上調(diào)人食管癌Eca109細(xì)胞Shh-Gli1信號通路對放射抗拒性及細(xì)胞周期的影響*

余今菁， 賀昱霖， 劉佳琪， 姚 菲， 劉 群， 龍 輝， 吳清明△

(武漢科技大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院， 2職業(yè)危害識別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科， 湖北 武漢 430065； 4十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所， 湖北 十堰 442000)

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1-2]，發(fā)病率高，預(yù)后較差。對于晚期食管癌患者，放射治療聯(lián)合手術(shù)是最好的治療手段之一[3]，但放射治療可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放射抗拒性的產(chǎn)生，從而影響放療療效。有研究指出，消化道腫瘤的發(fā)生與Sonic Hedgehog(Shh)信號通路的異常激活有關(guān)，食管鱗狀細(xì)胞癌中存在Shh信號通路相關(guān)因子的高表達(dá)，Shh信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1抑制劑能夠增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性[4-5]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，食管癌放射抗拒株Eca109R細(xì)胞中Gli1與Shh蛋白表達(dá)明顯高于親本株Eca109[6]，表明食管癌放射抗拒性的產(chǎn)生可能與Shh信號通路相關(guān)蛋白過表達(dá)有關(guān)。然而Shh信號通路如何通過其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1影響食管癌細(xì)胞放射抗拒性的機(jī)制尚不明了。因此，本實(shí)驗(yàn)通過上調(diào)親本株Eca109細(xì)胞中關(guān)鍵因子Gli1的表達(dá)，檢測食管癌細(xì)胞放射敏感性與細(xì)胞周期的變化，探究Shh信號通路相關(guān)因子與食管癌放射抗拒性及細(xì)胞周期改變之間的關(guān)聯(lián)。

材 料 和 方 法

1 材料

人食管癌細(xì)胞株Eca109(十堰太和醫(yī)院惠贈)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN)；細(xì)胞周期試劑盒(聯(lián)科公司)；抗Gli1抗體(北京博奧森公司)；過表達(dá)Gli1質(zhì)粒(吉凱公司)。CO2培養(yǎng)箱和超凈工作臺(Thermo Fisher)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 用由Eca109細(xì)胞中擴(kuò)增出的Gli1序列構(gòu)建的Gli1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，命名為Eca109-ox-Gli1組；同時(shí)Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對照(negative control)組；另設(shè)不做處理的親本株Eca109細(xì)胞作為正常對照(normal control)組。

2.3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞以每孔6×105個的密度接種于6孔板內(nèi)，確保第2天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到70%的匯合度。用125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5 μL Lipofectamine 2000試劑。用125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2.5 μg質(zhì)粒。將稀釋的質(zhì)粒與稀釋的Lipofectamine 2000試劑混合(1∶1比例)，孵育5 min。將混合的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物加至細(xì)胞中，再加入完全培養(yǎng)基，使終體積達(dá)2 mL。轉(zhuǎn)染后24 h可通過熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。

2.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)TRIzol說明書提取個組細(xì)胞的總RNA并定量。取總RNA 2 μg經(jīng)SuperScript III Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到終體積20 μL的cDNA，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，按說明書所述檢測細(xì)胞中Gli1的mRNA表達(dá)。PCR體系為：12.5 μL SYBR Green PCR Msater Mix、5 μL RT逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、1 μL正向及反向引物。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)量。Gli1的上游引物序列為5’-CGCCTCGAAAACCTGA-3’， 下游引物序列為5’-GGGAGCTTACATACATACGG-3’； β-actin的上游引物序列為5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTCT-3’， 下游引物序列為5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。

2.5Western blot檢測Gli1蛋白的表達(dá) 采用現(xiàn)配的含有1% PMSF的RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。蛋白煮沸變性，冷卻至室溫后上樣，每孔35 μg，SDS-PAGE 2 h，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，I 抗4 ℃孵育過夜，隔日用現(xiàn)配1×TBST洗膜3次，II抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白的表達(dá)，計(jì)算相對灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6集落形成實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞的放射敏感性 將指數(shù)生長期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，制成單細(xì)胞懸液，按每孔400、400、800、1 000和1 200的密度梯度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁且狀態(tài)良好(約12 h)，每板分別以0、2、4、6和8 Gy的劑量進(jìn)行細(xì)胞照射，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí)認(rèn)為集落已形成，終止培養(yǎng)。甲醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)含50個及以上細(xì)胞的集落數(shù)，用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算細(xì)胞放射敏感性參數(shù)：平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、外推值(N值)及照射2 Gy后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction at dose of 2 Cy,SF2)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7細(xì)胞照射 采用Varian 2300直線加速器對細(xì)胞進(jìn)行6 MV的X射線放射處理，每次放射劑量為200 cGy，照射視野面積為6 cm×4 cm，照射源距細(xì)胞培養(yǎng)瓶80 cm，培養(yǎng)瓶表面覆蓋1.5 cm厚的補(bǔ)償塊，吸收劑量率為2 Gy/min。取指數(shù)生長期Eca109細(xì)胞1瓶，用直線加速器照射1 min，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，并開始逐步恢復(fù)正常生長時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，可再次進(jìn)行放射處理。

2.8細(xì)胞周期檢測 使用聯(lián)科生物細(xì)胞周期檢測試劑盒，收集1×106個細(xì)胞，離心后70 %的冷乙醇1 mL 4 ℃固定過夜。隔日棄去固定液，PBS重懸細(xì)胞15 min，室溫離心5 min，棄上清。加入1 mL DNA Staining Solution，渦旋振蕩10 s混勻，室溫避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)所涉及的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中Gli1的mRNA表達(dá)水平

用Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞內(nèi)Gli1的mRNA表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參照。結(jié)果顯示，Eca109-ox-Gli1組與negative control組和normal control組相比，Gli1的mRNA表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The mRNA expression levels of Gli1 in the esophageal cancer cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol groups.

圖1轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中Gli1mRNA表達(dá)水平的比較

2 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中Gli1蛋白表達(dá)

Gli1蛋白的相對分子質(zhì)量是118 kD，內(nèi)參照蛋白β-actin的相對分子質(zhì)量是42 kD。結(jié)果顯示，Eca109-ox-Gli1組較2組對照細(xì)胞的Gli1蛋白表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The protein expression levels of Gli1 in the esophageal cancer cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol groups.

圖2轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中Gli1蛋白表達(dá)水平的比較

3 上調(diào)Gli1對Eca109細(xì)胞放射敏感性的影響

轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞分別接受0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy劑量的單次照射，利用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，可見Eca109-ox-Gli1組相比2個對照組對應(yīng)劑量的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且D0和Dq均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表1。這表明Eca109-ox-Gli1組細(xì)胞放射敏感性明顯減弱，放射抗拒性增強(qiáng)。

Figure 3. The survival curves of the esophageal cancer cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol groups at the same dose.

圖3單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線

表1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)的比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol groups.

4 上調(diào)Gli1對細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞分別接受6 Gy劑量的單次照射后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，3組細(xì)胞在照射前，Eca109-ox-Gli1組中S期細(xì)胞分布比例顯著高于對照組(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞分布低于對照組(P<0.05)，說明上調(diào)Gli1的細(xì)胞放射抗拒性相對增強(qiáng)，可能是由于對X射線最為抗拒的S期細(xì)胞比例增多所致。6 Gy的X射線照射后，3組細(xì)胞均出現(xiàn)G2/M期阻滯，表明細(xì)胞在進(jìn)行自身損傷修復(fù)，照射后normal control組相比于Eca109-ox-Gli1組G2/M期細(xì)胞比例顯著增高(P<0.01)，說明相比具有放射抗拒性的Eca109-ox-Gli1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，親本Eca109細(xì)胞積極地促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入對放射敏感的G2/M期，放射治療更為有效，見表2、3。

表2 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞X射線照射前的細(xì)胞周期分布

*P<0.05,**P<0.01vscontrol groups.

表3 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞X射線照射后的細(xì)胞周期分布

**P<0.01vsnormal control group.

討 論

Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和Smo及下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli組成，其中Gli鋅指蛋白家族包括Gli1、Gli2和Gli3。研究表明，Shh信號通路一般在正常成人組織器官中低表達(dá)、甚至不表達(dá)，僅在參與組織的修復(fù)時(shí)激活，而在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)存在該通路的異常激活[7-9]。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)食管癌前病變中Ptch1和Gli2蛋白表達(dá)增高，96%的食管腺癌患者存在Shh信號通路的異常激活，表明Shh信號通路的異常激活在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有研究報(bào)道[11]，43例出現(xiàn)放化療抗拒的食管癌細(xì)胞株中有36例(83.7%)檢測出Gli1陽性，表明食管癌放化療抗拒性與Hh通路的激活有關(guān)。近年來，有關(guān)腫瘤細(xì)胞放射抗拒機(jī)制的研究涉及多種復(fù)雜因素，包括細(xì)胞周期紊亂、DNA的損傷與修復(fù)、細(xì)胞的凋亡與分化、放射致細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變及血管形成等[12]。

在正常情況下，跨膜蛋白質(zhì)受體Ptch和Smo組成受體復(fù)合物，Smo的活性受到抑制；當(dāng)Shh配體激活時(shí)，Shh與Ptch結(jié)合，Smo釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1，調(diào)節(jié)Wnt、cyclin D1、N-Myc等多種靶基因表達(dá)，引起細(xì)胞周期改變和細(xì)胞增殖與凋亡[13]。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，抑制細(xì)胞周期調(diào)控因子CDC25在食管癌細(xì)胞中的過度激活后進(jìn)行細(xì)胞照射，G2/M期細(xì)胞的阻滯程度下降，放射敏感性提高，表明食管癌細(xì)胞的放射抗拒性可能與細(xì)胞周期的改變有關(guān)。Rizvi等[15]的研究顯示，CDK2啟動子序列在過表達(dá)Gli1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中富集，并且在Gli1過表達(dá)組中活性相比對照組增加多達(dá)5倍，說明Gli1與CDK2啟動子結(jié)合并充當(dāng)CDK2的轉(zhuǎn)錄激活劑。Simsmourtada等[11]發(fā)現(xiàn)，cyclin D1在受Shh信號刺激的SEG-1細(xì)胞中表達(dá)增高；抑制Hh信號后細(xì)胞周期進(jìn)展受到抑制，G1/S監(jiān)測點(diǎn)蛋白cyclin D1和周期蛋白依賴性激酶4的表達(dá)量減少，細(xì)胞大量停留在G1期，腫瘤的放射敏感性增強(qiáng)。因此，對細(xì)胞周期的研究可能是探究Shh信號通路影響腫瘤放射抗拒性機(jī)制的一個關(guān)鍵點(diǎn)。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[6]，食管癌放射抗拒株細(xì)胞活力較親本株下降，Shh和Gli1蛋白在放射抗拒細(xì)胞株中高表達(dá)，且Gli1明顯向細(xì)胞核聚集。本研究在原有基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步明確Shh信號通路影響食管癌細(xì)胞放射抗拒的機(jī)制，我們通過構(gòu)建過表達(dá)Gli1質(zhì)粒對Eca109細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后Gli1表達(dá)水平相比轉(zhuǎn)染前增加，同時(shí)集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)Gli1質(zhì)粒后細(xì)胞放射敏感性減弱，放射抗拒性增強(qiáng)，印證了Shh信號通路與食管癌的放射抗拒性是密切相關(guān)的。同時(shí)，我們通過檢測3組細(xì)胞照射前后細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)Gli1過表達(dá)細(xì)胞株S期細(xì)胞分布顯著增加，G2/M期細(xì)胞減少，而放射毒性效應(yīng)依賴于細(xì)胞周期，G1期和G2/M期細(xì)胞對射線敏感，S期的細(xì)胞對射線最為抗拒，即過表達(dá)細(xì)胞對射線敏感的細(xì)胞減少，放射抗拒性增強(qiáng)。X射線照射后，親本株Eca109細(xì)胞G2/M期細(xì)胞分布的增加較過表達(dá)細(xì)胞更為顯著，說明親本株細(xì)胞更能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入放射敏感的M期，放射治療對其更為有效。

綜上所述，本文通過上調(diào)Gli1進(jìn)一步探究了Shh信號通路激活與食管癌細(xì)胞放射抗拒性之間的關(guān)系，比較了上調(diào)Gli1細(xì)胞與親本細(xì)胞放射前后細(xì)胞周期的變化。由此可見，細(xì)胞周期改變可能與Shh/Gli1通路影響食管癌放射抗拒性增高密切相關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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