左炔諾孕酮和炔雌醚對布氏田鼠繁殖的影響

施玉華,王白石，孫 紅，季志鴻，王振龍**

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

鼠類是重要農(nóng)林生物災(zāi)害，我國年均農(nóng)業(yè)鼠害發(fā)生面積約4 000萬hm2，糧食損失超過100億kg，年經(jīng)濟(jì)損失80億～100億元[1-2]。目前，鼠害治理的措施與方案主要有物理(器械)滅殺、化學(xué)藥物滅殺、生態(tài)控鼠、生物防治等不同形式[3]。近年來，綜合多學(xué)科的方法和手段，以生態(tài)安全為基礎(chǔ)的綜合控制(Integrated pest management,IPM)逐漸成為鼠害控制的發(fā)展方向，其中，不育控制技術(shù)(Fertility control technologies)備受關(guān)注。不育控制的原理是通過不育劑改變雌鼠或雄鼠的生理代謝水平，阻斷雌鼠的生殖激素分泌，使受精卵無法著床或阻止胚胎發(fā)育，從而降低種群數(shù)量的增長[4-5]。從生態(tài)學(xué)角度考慮，使鼠不育被認(rèn)為比傳統(tǒng)的毒殺方法更有潛力[6-8]。

左炔諾孕酮(L)和炔雌醚(Q)分別是人工合成的孕激素和雌激素，多用于人類和嚙齒類的避孕藥[9-11]。以L和Q為主要成分的EP-1可抑制多種嚙齒動物的生殖[12-13]。鼠種和劑量對EP-1的不育效果影響較大[14-18]，不育效果還存在可逆現(xiàn)象，動物后期恢復(fù)繁殖能力[19-20]。EP-1對雄性鼠類的作用較為一致，即顯著降低雄性鼠類的睪丸、附睪、精囊腺質(zhì)量[12，14]，其中發(fā)揮主要作用的是Q成分[11]。目前，不育劑對雌性鼠類的作用則存在爭議。Q可抑制雌性的繁殖，降低血清雌二醇和孕酮水平，抑制卵巢中卵泡的成熟和排卵[21]，也有研究顯示，Q顯著提升雌二醇、孕酮水平[22]；L的作用不大[23]。

布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)隸屬于嚙齒目(Rodentia)、倉鼠科(Cricetidae)、毛足田鼠屬(Lasiopodomys)[24]，是我國北方農(nóng)、林、牧交錯區(qū)主要害鼠之一[25]。對布氏田鼠的研究主要涉及婚配制度、氣味識別、種群結(jié)構(gòu)與生活習(xí)性、擇偶、繁殖、能量代謝、產(chǎn)熱機(jī)制、日食量、代謝率、危害和控制等方面[26-28]。有關(guān)布氏田鼠的不育控制技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，EP-1可導(dǎo)致雄性布氏田鼠的生殖器官萎縮，對雌鼠則無明顯的影響[29]，其中Q可有效降低布氏田鼠的總產(chǎn)仔數(shù)[30]。

本研究以布氏田鼠為對象，在實驗室設(shè)置L(+/-)×Q(+/-)雙因素試驗，連續(xù)7 d以灌胃法給藥，劑量2 mg/kg。灌胃試驗完成后配對飼養(yǎng)，記錄動物體質(zhì)量與繁殖情況，30 d后解剖動物，測定繁殖器官質(zhì)量和血清激素水平，旨在明確L和Q對布氏田鼠繁殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選擇成年布氏田鼠(由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所提供)，90～120日齡，體質(zhì)量40～60 g，分為L-Q-(對照)、L+Q-、L-Q+、L+Q+4組，每組7對。灌胃結(jié)束前單只飼養(yǎng)于聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠(37 cm×26 cm×17 cm)中，以鋸末為墊料，脫脂棉為巢穴，室溫控制在20～25 ℃，光照控制為14L∶10D，每天10:00—10:30供以充足的兔顆粒飼料(河南省實驗動物中心生產(chǎn))和潔凈的飲用水，灌胃試驗完成后配對飼養(yǎng)。

1.2 不育劑配制與給藥方式

本研究選用L、Q以及二者1∶1的混合物(購自大連美侖生物科技有限公司)作為3個給藥組藥物，將三者都溶于20% 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)(購自山東濱州智源生物科技有限公司)中，質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，每個給藥組配制50 mL，放置于4 ℃。

每天9:00給藥，采用12號彎頭灌胃針、1 mL注射器，灌胃劑量為2 mg/kg，連續(xù)7 d給藥。

1.3 測定項目及方法

灌胃前及灌胃結(jié)束后7、14、21、28 d分別稱量動物體質(zhì)量。灌胃結(jié)束后30 d，解剖動物，統(tǒng)計田鼠的懷孕率、胎仔數(shù)、畸形率等情況，解剖雄鼠取睪丸、附睪，雌鼠取子宮、卵巢，稱質(zhì)量。

眼球取血，0.5 mL EP管取血0.3～0.5 mL，常溫下靜置2 h，然后3 500 r/min離心10 min，用移液槍小心吸取上層血清，放于-20 ℃，待酶聯(lián)免疫分析。采用大鼠皮質(zhì)酮檢測試劑盒、促卵泡生成素檢測試劑盒、雌二醇檢測試劑盒和睪酮檢測試劑盒(均購自上海滬震生物科技有限公司)測定各種激素的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。器官指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，采用2×2列聯(lián)表的精確檢驗法計算懷孕率的概率值，體質(zhì)量、器官指數(shù)、激素水平則利用重復(fù)測量廣義線性模型進(jìn)行分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，多組間均數(shù)比較時，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不育劑對布氏田鼠體質(zhì)量的影響

從圖1可以看出，不同類型的不育劑對布氏田鼠體質(zhì)量的影響不同。利用廣義線性模型分析得知，灌胃后經(jīng)過28 d的飼養(yǎng)，L對布氏田鼠體質(zhì)量變化率的影響不顯著(F1，106=3.086，P=0.082)，Q則可顯著降低動物的體質(zhì)量(F1，106=11.394，P=0.01)，其中灌胃后14 d達(dá)到最低，比灌胃前體質(zhì)量降低了18.16%(F3，106=2.062，P=0.031)，灌胃后21 d與28 d則逐漸恢復(fù)。說明Q可顯著降低布氏田鼠的體質(zhì)量，而L則不能。

圖1 不育劑對布氏田鼠體質(zhì)量變化率的影響

2.2 不育劑對布氏田鼠繁殖參數(shù)的影響

L和Q均顯著抑制布氏田鼠的繁殖，對照組個體懷孕率為85.70%(12/14)，L+Q-組則僅為 7.14%(1/14)(df=1，P=3.44E-5)，其他2組均無懷孕個體(df=1，P=2.99E-6)。對照組平均胎仔數(shù)為5.67±0.62(n=12)，L+Q-組僅有1只懷孕，胎仔數(shù)為8。

2.3 不育劑對布氏田鼠器官指數(shù)的影響

不育劑對布氏田鼠的器官指數(shù)影響不同(表1)。L對子宮指數(shù)抑制作用不顯著；Q則存在顯著的降低作用，當(dāng)L不存在時，Q對子宮指數(shù)的降低作用為64.20%，當(dāng)L存在時，Q的降低作用為30.56%；二者不存在顯著的交互作用。L和Q對卵巢指數(shù)的影響不顯著，二者也不存在顯著的交互作用。當(dāng)Q不存在時，L對睪丸指數(shù)的降低作用僅為2.11%，而當(dāng)Q存在時，L對睪丸指數(shù)的提升作用達(dá)到了66.67%，總體上L顯著升高睪丸指數(shù)；Q則顯著抑制睪丸指數(shù)，當(dāng)L不存在時，Q對睪丸指數(shù)的抑制作用達(dá)到了43.16%，當(dāng)L存在時，Q的抑制作用降為3.22%；二者存在顯著的交互作用。L顯著升高附睪指數(shù)，當(dāng)Q不存在時，L的升高作用為18.18%，當(dāng)Q存在時，L的升高作用則達(dá)到了160.00%；Q的抑制作用不顯著，且二者不存在顯著的交互作用。以上說明，L可顯著升高雄性繁殖器官指數(shù)，而對雌性繁殖器官的作用不顯著，與之不同的是，Q對雌性的子宮指數(shù)和雄性的睪丸指數(shù)均具有顯著的抑制作用。

表1 不育劑對布氏田鼠器官指數(shù)影響的雙因素方差分析

2.4 不育劑對布氏田鼠激素水平的影響

不育劑對布氏田鼠的激素水平影響不同(表2)。不育劑對布氏田鼠血清中雌二醇、睪酮和皮質(zhì)酮含量的影響不顯著；L僅顯著抑制布氏田鼠血清中促卵泡生成素的表達(dá)量，當(dāng)Q不存在時，L的抑制作用為11.83%，Q存在時，L的抑制作用則達(dá)到55.38%。說明L對促卵泡生成素的抑制作用在Q的參與下得到了加強(qiáng)。

表2 不育劑對布氏田鼠激素水平影響的雙因素方差分析

續(xù)表2 不育劑對布氏田鼠激素水平影響的雙因素方差分析

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Q和L均顯著抑制布氏田鼠的繁殖，前者的不育控制效果較好；Q可顯著降低布氏田鼠的體質(zhì)量，L則無此作用；Q顯著抑制子宮指數(shù)(-64.20%～-30.56%)和睪丸指數(shù)(-43.16%～-3.22%)，L則削弱了Q對二者的抑制作用；L顯著升高睪丸指數(shù)(-2.11%～66.67%)和附睪指數(shù)(18.18%～160.00%)，Q促進(jìn)L對二者的升高作用；L顯著抑制血清促卵泡生成素的表達(dá)量(-55.38% ～-11.83%)，Q提升L的抑制作用?？傮w上，Q對布氏田鼠的繁殖具有抑制作用，L的抑制作用較弱，二者混用可降低Q的有效抑制作用。

不育劑對田鼠體質(zhì)量的抑制效果是劑量依賴的。李季萌等[31]發(fā)現(xiàn)，給布氏田鼠每周灌胃80、120、160 mg/kg的雷公藤，共持續(xù)4周，120 mg/kg的劑量在灌胃第2周可以顯著降低田鼠的體質(zhì)量，這和本研究結(jié)果一致?；粜惴嫉萚32]研究表明，以25、50、100、200 mg/kg的貝奧不育劑給布氏田鼠灌胃，200 mg/kg的劑量可以使田鼠的體質(zhì)量從第1周到第4周持續(xù)降低，100 mg/kg的劑量在第2周降低最為顯著，其他2個劑量幾乎沒有變化。不育控制的原理不是通過抑制個體發(fā)育達(dá)到控制個體繁殖的目的，而是通過不育個體參與繁殖競爭而產(chǎn)生的競爭性繁殖干擾效應(yīng)達(dá)到不育控制的目的，所以應(yīng)該避免對不育個體造成致命的傷害，劑量應(yīng)盡可能不影響其生長發(fā)育[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，以2 mg/kg的劑量給布氏田鼠灌胃，Q對體質(zhì)量的抑制作用顯著，其在灌胃結(jié)束后14 d達(dá)到最低，而L則促進(jìn)體質(zhì)量的上升，但作用不顯著。

王濤濤等[30]研究表明，Q可以降低布氏田鼠雌性個體的繁殖率和平均窩仔數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，L和Q均會抑制布氏田鼠的繁殖，但Q的繁殖抑制效果較好，與上述研究基本一致。由于僅有一組給藥處理的個體繁殖，無法確定胎仔數(shù)和質(zhì)量方面的差異性。

王大偉等[29]研究表明，以2 mg/kg的EP-1給雌性布氏田鼠灌胃，對子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)均無顯著的抑制作用。本研究則發(fā)現(xiàn)，Q可以顯著降低子宮指數(shù)，當(dāng)L不存在時，Q的降低作用為64.20%，當(dāng)L存在時，Q的降低作用為30.56%，但L對子宮指數(shù)的抑制作用不顯著。推測存在差異的原因可能為：EP-1是L和Q 2∶1的混合物，Q的份量較輕，減輕了效果；另外，對照組有一個子宮本體肥大，一個剛生育完，子宮肥厚還未恢復(fù)，還有一個剛?cè)焉?，里面有胎仔，這些都增加了對照組子宮的總質(zhì)量。L和Q對子宮外形的影響不顯著，給藥組子宮形態(tài)細(xì)長、壁薄，但這只是少數(shù)現(xiàn)象，并不呈現(xiàn)規(guī)律性。同時，L和Q對卵巢組織和卵巢指數(shù)都沒有顯著的影響。

Zhao等[11]用1 mg/kg的EP-1、0.34 mg/kg的Q以及0.66 mg/kg的L分別給布氏田鼠灌胃30 d、60 d和90 d后發(fā)現(xiàn)，Q可抑制雄性的繁殖，降低其睪丸和附睪質(zhì)量，切片也顯示，其曲細(xì)精管變得稀疏，精子數(shù)減少。本研究結(jié)果支持上述發(fā)現(xiàn)，Q顯著抑制睪丸指數(shù)，當(dāng)L不存在時，Q的抑制作用達(dá)到了43.16%，當(dāng)L存在時，Q的抑制作用僅為3.22%，L的存在削弱了Q的抑制作用。切片也顯示，Q使睪丸曲細(xì)精管的腔隙增大，各級精細(xì)胞減少。此外，還發(fā)現(xiàn)，L可顯著升高睪丸指數(shù)(-2.11%～66.67%)和附睪指數(shù)(18.18%～160.00%)，Q的存在使得L的升高作用更明顯，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

張錦偉等[14]研究表明，采用4～64 mg/kg的Q處理可使血清中促卵泡生成素表達(dá)量升高。本研究結(jié)果與其不一致，L顯著抑制布氏田鼠血清中促卵泡生成素的表達(dá)量，Q的存在可以強(qiáng)化L的抑制作用，即當(dāng)Q不存在時，L的抑制作用為11.83%，Q存在時，L的抑制作用則達(dá)到55.38%。促卵泡生成素含量降低，說明二者的協(xié)同作用引起體內(nèi)下丘腦-垂體-性腺軸的負(fù)反饋，這與以前的研究結(jié)果[33]類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，L和Q對布氏田鼠血清中雌二醇、睪酮和皮質(zhì)酮含量的影響不顯著。雌二醇是由顆粒細(xì)胞分泌，協(xié)助促卵泡生成素以促進(jìn)排卵，其含量變化不大，說明這2種藥物并未對雌二醇的分泌造成影響，可能是由于該激素不是造成排卵的主要激素，也可能是生殖系統(tǒng)激素紊亂，這與張錦偉等[14]得到的結(jié)果類似。睪酮由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，其作用是促進(jìn)生殖器官的發(fā)育成熟及精子的成熟，睪酮變化不大，可能與采血的時機(jī)有關(guān)，本研究采血是在灌胃結(jié)束后的30 d，推測此時不育劑造成的血清睪酮含量降低的情況得到了恢復(fù)。皮質(zhì)酮是一種應(yīng)激反應(yīng)的激素，灌胃和給藥均會引起動物的應(yīng)激反應(yīng)，然而本研究中給藥并未引起皮質(zhì)酮的變化，可能也與所測時間有關(guān)，30 d后可能動物的應(yīng)激反應(yīng)已恢復(fù)正常，這與體質(zhì)量也恢復(fù)正常保持一致。

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