健康煙田與易感黑脛病煙田煙株不同生長時期根際土壤微生物區(qū)系變化規(guī)律

張笑宇，段宏群，蘆阿虔，李紅麗，王 巖*

(1.鄭州大學 化工與能源學院，河南 鄭州 450001； 2.河南省洛陽市煙草公司，河南 洛陽 471000)

煙草黑脛病(病原為Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是一種重要的真菌型土傳病害，嚴重影響煙葉產量和品質，甚至導致絕收。對煙草黑脛病的防治通常采用選育抗病品種、化學防治、生物防治和加強栽培管理等措施，由于化學農藥的濫用和煙草抗病品種種植年限的增加，造成黑脛病病原菌產生抗藥性和品種抗病性逐漸喪失等后果，勢必影響煙草的安全生產，同時也對周邊環(huán)境造成污染，嚴重制約煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]，而生物防治是利用自然界存在的拮抗微生物抑制植物病原菌的繁殖，具有安全、無污染、無公害的特點，符合煙草有害生物綜合治理的發(fā)展方向[2-3]。

土壤生物學性狀能夠反映土壤質量和肥力特征，是評價土壤健康的重要生物學指標[4]，土壤微生物對土傳病害的抑制能力是土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡、健康和穩(wěn)定的另一個重要指標[2,5]。本研究對河南省汝陽縣柏樹鄉(xiāng)水磨村多年公認的健康和易感黑脛病煙田進行了調查取樣，通過高通量宏基因組測序技術對煙株生長過程中根際土壤微生物區(qū)系進行測定，旨在明確煙田根際土壤微生物的變化規(guī)律，為通過采取生物技術措施確保煙田土壤健康提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗田概況與材料

河南省汝陽縣柏樹鄉(xiāng)植煙歷史悠久且管理精細，煙葉品質優(yōu)良。2016年通過實地調查，確定以柏樹鄉(xiāng)水磨村為試驗點。在柏樹鄉(xiāng)水磨村選擇連續(xù)植煙多年而發(fā)病率較低的健康煙田(T1)和發(fā)病率較高的易感病煙田(T2)，煙田種植情況和土壤基本性狀如表1和表2所示。分別于移栽前、旺長期和成熟期采集土樣，按S形進行多點取樣，將煙株0～20 cm耕層根系區(qū)土樣挖出，抖掉根系外圍大塊土，取貼根表的土壤作為根際土壤并進行編號[6]。將編號的土樣帶回實驗室處理和測定：部分風干過篩，用于土壤理化性狀測定；部分置于4 ℃冰箱保存，用于檢測可培養(yǎng)微生物數量；部分裝離心管-20 ℃冷凍保存，用于土壤微生物高通量宏基因組測定。

表1 試驗田概況

表2 試驗田土壤理化性質

1.2 試驗方法

1.2.1 可培養(yǎng)微生物數量的測定 土壤中可培養(yǎng)微生物數量測定采用稀釋平板法[7]。細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基；放線菌用高氏1號培養(yǎng)基。

1.2.2 微生物高通量宏基因組測序分析 將土壤樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行微生物高通量宏基因組測序分析，過程和方法如下。煙田根際土壤經過預處理后，利用OMEGA試劑盒提取土壤DNA。對提取到的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳分析，檢查基因組DNA的完整度，并利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。以全部基因組DNA為模板進行PCR擴增，細菌16S rDNA擴增引物分別為341F：5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode)CCTACGGGN-

GGCWGCAG-3′，805R：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATC-

C-3′；真菌18S rDNA擴增引物分別為NS1：5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，Fung：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGT-

TG-3′。PCR擴增體系:2×TaqMaster Mix 15 μL，基因組 DNA 20 ng，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物 (10 μmol/L) 1 μL，加H2O至30 μL。反應條件: 第1輪擴增首先94 ℃預變性3 min，然后94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，25個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min；第2輪擴增在相同條件下進行5個循環(huán)。PCR擴增結束后，對產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用生工生物工程公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒對DNA進行回收，然后進行測序分析。

OTU為將所有樣本按照序列間的距離進行聚類，然后將相似度高于97%的序列定義為一個操作分類單元，故OTU數可表示煙田根際土壤中物種數量的多少，序列比對、聚類分析采用的軟件為Usearch。用香濃指數衡量群落之間差異性，以Chao1指數的大小估計土壤微生物物種總數[8]，采用Mothur軟件分別按照公式(1)和公式(2)計算這2項指標。

Hshannon=-∑Sobsi=1niNlnniN

(1)

式(1)中，Hshannon表示香濃指數，Sobs為實際檢測到的OTU數，ni為含有i條序列的OTU數，N為序列總數。

Schao1=Sobs+n1(n1-1)2(n2+1)

(2)

式(2)中，Schao1即Chao1指數為估計OTU數，Sobs為實際檢測到的OTU數，n1為只含有1條序列的OTU數，n2為只含有2條序列的OTU數。

群落結構分布圖首先是采用RDP classifier軟件，將OTU在屬水平上所對應的物種信息按照分類學進行分類，然后采用R語言進行作圖。聚類樹狀圖首先采用R語言中Vegan軟件包根據各個樣本物種豐度計算beta多樣性(樣本間物種多樣性)，依據距離矩陣進行層次聚類分析，然后再使用非加權組平均法(UPGMA)構建樹狀結構，用于可視化分析。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2013、SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 健康與易感病煙田根際土壤中可培養(yǎng)微生物數量的變化規(guī)律

如表3所示，煙株生長過程中根際土壤微生物數量變化較大，煙田根際土壤中可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌數量移栽前均較少，旺長期則明顯增多，且細菌和放線菌的增長幅度遠大于真菌，成熟期微生物數量又表現出一定程度的下降趨勢，造成這一趨勢的原因可能是旺長期的溫度適宜微生物的生長和繁殖，且此時煙株根系生長旺盛，根系分泌物增多以及酶活性提高，從而導致微生物數量顯著增長[9]，成熟期煙株根系活力下降，根系分泌物減少甚至分泌一些有毒物質[10-11]，進而使得微生物數量有所降低。同時還發(fā)現，健康煙田根際土壤中可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌數量在移栽前與易感病煙田差異不顯著，而在旺長期和成熟期健康煙田中可培養(yǎng)細菌和放線菌的數量顯著大于易感病煙田。細菌是土壤中的主要微生物，在土壤微生態(tài)環(huán)境的物質和能量轉化中起著重要作用，放線菌能夠改善土壤團粒結構，代謝產物中含有刺激植物生長的有效物質，且放線菌產生的抗生素能調節(jié)土壤微生物區(qū)系，抑制病原菌，控制病蟲害發(fā)生[10,12]，因此健康煙田中細菌和放線菌數量增加，對于抑制病害發(fā)生具有重要作用。真菌則與細菌和放線菌相反，在旺長期和成熟期健康煙田中可培養(yǎng)真菌數量小于易感病煙田，并在成熟期達到顯著性差異水平，造成這種變化的原因可能是由于煙株生長后期病原菌數量急劇增加，對可培養(yǎng)真菌數量有一定程度的影響[13]，這與李佳等[9]研究得出的易感病煙田中土壤微生物數量的變化規(guī)律一致。

表3 健康與易感病煙田中可培養(yǎng)微生物數量 ×104 cfu/g

注：不同的小寫字母表示不同處理間同一微生物類別差異顯著(P<0.05)。

2.2 健康與易感病煙田根際土壤微生物Alpha多樣性分析

Alpha多樣性也被稱為生境內物種多樣性，主要關注均勻生境下的物種數目[14]，利用Alpha多樣性分析中的OTU數、香濃指數和Chao1指數對煙田根際土壤中微生物多樣性進行判斷。健康與易感病煙田根際土壤微生物Alpha多樣性測定結果如表4所示。

表4 健康與易感病煙田微生物Alpha多樣性分析

由表4可知，隨著煙株的生長，煙田根際土壤細菌群落的OTU數、香濃指數和Chao1指數基本呈逐漸下降趨勢，表明煙株生長過程中根際土壤細菌多樣性逐漸降低；除旺長期健康煙田根際土壤細菌群落Chao1指數略低于易感病煙田外，移栽前、旺長期和成熟期健康煙田細菌群落的OTU數、香濃指數和Chao1指數均高于易感病煙田。而煙田土壤真菌群落變化相對復雜一些，在煙株生長過程中煙田根際土壤真菌群落OTU數逐漸降低，香濃指數先升高后降低，健康煙田根際土壤真菌群落Chao1指數逐漸降低，易感病煙田根際土壤真菌群落Chao1指數先降低后升高；除旺長期健康煙田真菌群落香濃指數略低于易感病煙田之外，移栽前和旺長期真菌群落多樣性均高于易感病煙田，成熟期則相反，易感病煙田中真菌群落OTU數和Chao1指數均高于健康煙田，充分說明成熟期易感病煙田真菌物種多樣性提高，可能是由于成熟期病原菌的大量生長所致。

2.3 健康與易感病煙田根際土壤微生物群落結構相似性分析

聚類樹狀圖是通過樹狀結構反映多個樣本間的相似度和差異性，健康與易感病煙田根際土壤微生物在屬水平上的群落聚類樹狀圖如圖1所示。

a:細菌；b:真菌圖1 屬水平健康與易感病煙田根際土壤微生物群落聚類分析

從圖1可以看出，健康煙田和易感病煙田微生物群落結構在移栽前和旺長期相似度均較大，但是隨著煙株的生長，到成熟期時健康煙田和易感病煙田根際土壤微生物群落結構表現出較大的差異性，說明土壤微生物多樣性發(fā)生了較大的改變，這種變化可能是由于病原菌在侵入寄主過程中或侵入后，在一定程度上干擾植物的正常代謝，引起根系分泌物的改變造成的[15]，由此推測發(fā)病煙株中黑脛病病原菌可能誘導了根際環(huán)境發(fā)生相應變化，從而導致煙田微生物結構的改變。

2.4 健康與易感病煙田根際土壤中微生物群落分布規(guī)律

根據微生物高通量宏基因組測序結果可知，移栽前健康煙田和易感病煙田根際土壤微生物在屬水平上分別檢測出細菌458類和503類，旺長期分別檢測出358類和377類，成熟期分別為384類和383類。

由圖2可知，在移栽前、旺長期和成熟期，Gp6、Gemmatimonas(芽單胞菌屬)、Sphingomonas(鞘脂單胞菌屬)、Gp4和Pseudomonas(假單胞菌屬)這5類細菌為優(yōu)勢菌屬，健康煙田與易感病煙田根際土壤中上述5種優(yōu)勢細菌移栽前相對豐度分別為29.19%和24.50%，旺長期分別為32.68%和36.11%，成熟期分別為35.39%和30.37%，可知煙株不同生長時期優(yōu)勢細菌屬的種類和豐度差異不大。從圖2還可以看出，Pseudomonas的相對豐度在煙株生長過程中呈現先增加后降低的趨勢，旺長期達最大值，成熟期健康煙田根際土壤中Pseudomonas的相對豐度為5.16%，高于易感病煙田(3.77%)。有文獻表明，Pseudomonas是環(huán)境微生物中代謝煙堿的優(yōu)勢種群，可以通過固氮作用產生多種植物激素以促進煙株對水分和礦質元素的吸收[8,16]，因此，Pseudomonas數量增加，有利于煙株生長。隨著煙株生長，Sphingomonas的相對豐度在健康煙田根際土壤中逐漸增加，在易感病煙田根際土壤中則是先降低后增加，旺長期健康煙田中Sphingomonas的相對豐度(7.02%)高于易感病煙田(6.75%)。有文獻表明，Sphingomonas是降解土壤有毒物質最有效的微生物菌屬之一，且可以促進煙株根際營養(yǎng)吸收、抵抗多種病原菌，該屬中某些菌株具有固氮和脫氫特性，在維持植煙土壤氮平衡方面起著重要作用[8]，旺長期煙株以營養(yǎng)生長為主，這一時期健康煙田Sphingomonas數量的增加，能夠促進根系營養(yǎng)吸收，抑制病害發(fā)生。

圖2 屬水平健康與易感病煙田根際土壤細菌群落結構分布

根據微生物高通量宏基因組測序結果可知，移栽前健康和易感病煙田根際土壤微生物在屬水平上分別檢測出真菌223類和211類，旺長期分別為200類和221類，成熟期分別為159類和148類。

由圖3可知，移栽前健康煙田和易感病煙田根際土壤真菌中Gibberella(赤霉屬)、Penidiella、Setomelanomma為優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為51.85%和51.58%；旺長期健康煙田根際土壤真菌中Penidiella、Thielavia(梭孢殼屬)、Spizellomyces為優(yōu)勢菌屬，占29.13%，易感病煙田中Spizellomyces、Thielavia、Setomelanomma為優(yōu)勢菌屬，占35.10%；成熟期健康煙田中Conocybe(錐蓋傘屬)為優(yōu)勢菌屬，占56.90%，易感病煙田中Phytophthora(疫霉屬)為優(yōu)勢菌屬，占60.43%。可知煙株不同生長時期優(yōu)勢真菌屬的種類和豐度差異較大。其中Phytophthora是煙草黑脛病病原菌所在屬[17]，在煙株生長過程中其相對豐度不斷升高，成熟期達到最大值，且成熟期易感病煙田中Phytophthora的相對豐度(60.43%)明顯高于健康煙田(0.32%)。有研究表明，發(fā)病率或發(fā)病指數與土壤中病原微生物的數量成正比[18]，因此，黑脛病病原菌數量的增加，提高了易感病煙田中黑脛病的發(fā)病概率。成熟期健康煙田根際土壤中Conocybe的相對豐度遠高于易感病煙田，文獻表明，Conocybe中某些真菌會分泌鄰苯二甲酸二異丁酯[19]，而鄰苯二甲酸二異丁酯能顯著抑制茄子黃萎病菌菌絲生長[20]，因此推測煙田中Conocybe的分泌物鄰苯二甲酸二異丁酯可能對黑脛病病原菌生長也具有一定的抑制作用。

圖3 屬水平健康與易感病煙田根際土壤真菌群落結構分布

3 結論與討論

微生物是土壤中物質轉化的重要參與者，在有機質的礦化、腐殖質的形成和分解、植物營養(yǎng)的轉化、土壤污染修復、抑制病原菌活性等過程中起著不可替代的作用[21]。傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術僅能分離出1%～10%的土壤微生物，而分子生物學技術為不可培養(yǎng)微生物的分析提供了有利的手段，具有檢測極限低、靈敏度高等優(yōu)勢，已經廣泛應用于環(huán)境微生物研究中[22]。本研究測定分析了健康和易感病煙田在煙株生長期根際土壤微生物數量及其多樣性的變化特征，結果表明，在煙株生長過程中可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌數量呈先增加后減少的趨勢，旺長期達到最大值，旺長期和成熟期健康煙田根際土壤中可培養(yǎng)細菌和放線菌數量遠遠大于易感病煙田，使得健康煙田土壤抑病活性增加，發(fā)病率降低，而旺長期和成熟期易感病煙田可培養(yǎng)真菌數量大于健康煙田。利用分子生物學方法測定煙株不同生長時期健康與易感病煙田根際土壤微生物群落結構，結果表明，隨著煙株生長，煙田根際土壤微生物群落多樣性總體上逐漸降低，土壤微生物趨向單一化，土壤病原微生物得到富集，不僅不利于土壤中微生物種群的平衡，而且易導致植物根部病害的發(fā)生[4,23]，健康煙田微生物群落多樣性基本大于易感病煙田，同時成熟期健康與易感病煙田微生物群落結構差異性較大。通過進一步對微生物群落結構分布分析發(fā)現，旺長期健康煙田根際土壤中Sphingomonas的相對豐度高于易感病煙田，成熟期健康煙田根際土壤中Pseudomonas、Conocybe的相對豐度高于易感病煙田，同時易感病煙田中病原菌Phytophthora的相對豐度在成熟期顯著增加，遠遠高于健康煙田。

本研究只關注了不同生長時期煙株根際土壤微生物的變化情況以及健康煙田與易感病煙田微生物數量及區(qū)系的不同表現，為利用土壤微生物抑制煙株生長過程中病害的發(fā)生提供了理論依據和指導，但未考慮煙株地上部分的生長情況及煙株病害發(fā)生的其他影響。

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