鄭麥9023胚性懸浮細(xì)胞系的建立和植株再生

李冬兵, 呂桂珍, 牛洪斌, 尹 鈞*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002; 2.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高校生態(tài)學(xué)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631)

懸浮細(xì)胞系是研究細(xì)胞周期及細(xì)胞代謝影響因素的一種方便的工具[1-2]。懸浮細(xì)胞系的研究一直是植物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，原因在于懸浮細(xì)胞系可以用來建立植物高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系及進(jìn)行體細(xì)胞無性系突變體的篩選。與雙子葉植物相比，單子葉植物的胚性懸浮系更難建立[3]。懸浮系的建立受基因型、外植體及培養(yǎng)基的組成等因素的影響[4]。對(duì)于雙子葉植物，胚性愈傷組織則可以從莖尖或葉片中獲得。用于小麥胚性懸浮系建立的愈傷組織可通過花藥、幼胚等外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生[5]。目前有2種獲得小麥懸浮系的方法[6]。一種是通過胚性愈傷組織直接獲得懸浮系；第二種是先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后通過繼代培養(yǎng)，挑選出胚性愈傷組織后，進(jìn)而制備懸浮系[7]。因?yàn)樯婕暗浇M織的分化，這2種方法操作起來都很耗時(shí)。

穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮系再生能力長達(dá)10個(gè)月之久[5,8]。到目前為止，僅有部分栽培種進(jìn)行了小麥懸浮細(xì)胞系的建立試驗(yàn)，且效果都不好。筆者所在課題組研究方向是小麥逆境分子調(diào)控，而以轉(zhuǎn)基因育種為代表的小麥分子育種為解決小麥的抗逆問題提供了一個(gè)嶄新的方向。

高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是小麥轉(zhuǎn)基因分子育種的瓶頸之一。本研究以小麥鄭麥9023作為研究對(duì)象，建立并優(yōu)化胚性懸浮細(xì)胞系，完成胚性懸浮系植株再生的過程，旨在為小麥高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

小麥鄭麥9023，來源于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家小麥工程技術(shù)研究中心小麥生長發(fā)育分子調(diào)控實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

將未成熟的小麥鄭麥9023種子置于4 ℃冰箱內(nèi)保存24～48 h，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將穗子用70%乙醇消毒1 min，0.1%升汞消毒8 min，用滅菌過的蒸餾水沖洗5遍，用解剖刀片挑取幼胚。

1.2.1 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織 制備含不同2，4-D質(zhì)量濃度的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將上述操作過的幼胚置于不同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。每皿放30粒幼胚，Parafilm封口。28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)不同濃度培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

1.2.2 胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng) 制備含2，4-D和KT不同質(zhì)量濃度組合的MS繼代培養(yǎng)基，從1.2.1得到的愈傷組織里挑取胚性愈傷組織(通常是淺黃致密的)，轉(zhuǎn)移至到不同質(zhì)量濃度的繼代培養(yǎng)基上，28 ℃(16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)20 d，觀察所得愈傷組織的生長情況。按照同樣的操作進(jìn)行愈傷組織在固體培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)。

1.2.3 懸浮細(xì)胞系的建立 將生長狀態(tài)較好的愈傷組織(胚性愈傷組織通常是黃色顆粒狀的)轉(zhuǎn)入150 mL三角瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，添加75 mL液體培養(yǎng)基，置搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)溫度(26±2)℃，光照強(qiáng)度1 000 μmol/(m2·s)，每20 d進(jìn)行1次繼代。

1.2.4 懸浮細(xì)胞系的參數(shù)測定 鮮質(zhì)量、懸浮細(xì)胞系液體培養(yǎng)基pH值的測定參考陳琰等[9]的方法。

1.2.5 植株再生與移栽 將懸浮系當(dāng)中的成熟胚轉(zhuǎn)移至基本的MS固體培養(yǎng)基上，記錄其發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)最終的移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度2，4-D對(duì)鄭麥9023幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響

表1顯示，鄭麥9023幼胚在2，4-D質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時(shí)出愈率達(dá)到最大值。在較低的2，4-D 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(1.0～3.0 mg/L)，鄭麥9023幼胚的出愈率隨2，4-D質(zhì)量濃度的升高而增大；然而，在較高的2，4-D質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(3.0～5.0 mg/L)，鄭麥9023幼胚的愈傷誘導(dǎo)率隨2，4-D質(zhì)量濃度的增加而降低。較高2，4-D質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(3.0～5.0 mg/L)的愈傷組織的狀態(tài)不好，不容易挑選胚性愈傷組織。因此，綜合愈傷組織誘導(dǎo)率及后期愈傷組織繼代情況考慮，鄭麥9023幼胚最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有2，4-D質(zhì)量濃度為 3.0 mg/L的MS培養(yǎng)基。

表1 不同質(zhì)量濃度2，4-D對(duì)鄭麥9023幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同質(zhì)量濃度的2，4-D、 KT對(duì)愈傷組織繼代的影響

將鄭麥9023幼胚誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有2，4-D和 KT不同質(zhì)量濃度組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。對(duì)所得到的愈傷組織進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，表2結(jié)果顯示，當(dāng)2，4-D的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，低質(zhì)量濃度KT處理就可以獲得生長狀態(tài)良好的愈傷組織，而隨著KT質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的狀態(tài)趨向褐化。比較可得，最適宜進(jìn)行小麥愈傷組織繼代的培養(yǎng)基是MS+ 1.0 mg/L 2，4-D + 0.1 mg/L KT，該繼代條件下可以得到胚性愈傷組織(即黃色松脆型)。

表2 不同質(zhì)量濃度的2，4-D和KT對(duì)鄭麥9023幼胚愈傷組織繼代的影響

2.3 鄭麥9023 胚性細(xì)胞懸浮系最佳pH值的確定

在細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液的pH值不斷發(fā)生變化。測定結(jié)果顯示(圖1)，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的前8 d，pH值急劇下降，由6.0降至4.6，隨之又逐漸上升；隨著細(xì)胞生長速度的減緩，pH值的上升速度也逐漸減緩，在16 d后漸趨穩(wěn)定，保持在5.8左右。

圖1 不同培養(yǎng)天數(shù)懸浮液pH值的變化

2.4 鄭麥9023胚性細(xì)胞懸浮系繼代最佳周期的確定

在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長量在不斷發(fā)生變化，但是會(huì)出現(xiàn)一個(gè)最大值。測定結(jié)果顯示(圖2)，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最開始的8 d里，細(xì)胞呈現(xiàn)緩慢生長；8～16 d細(xì)胞快速增長；16 d以后細(xì)胞基本不再生長，生長量保持在0.5 g左右。綜合細(xì)胞的生長量及懸浮系pH值的變化可以確定懸浮系的最佳繼代時(shí)間為16 d。

圖2 不同培養(yǎng)天數(shù)懸浮液中細(xì)胞生長量的變化

2.5 鄭麥9023胚性細(xì)胞懸浮系的建立

將繼代產(chǎn)生的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有1.0 mg/L 2，4-D 和 0.1 mg/L KT的 MS液體培養(yǎng)基上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(圖3A)，通過調(diào)整懸浮培養(yǎng)體系的pH值及繼代周期，獲得了狀態(tài)良好的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。這些胚性懸浮細(xì)胞在懸浮系中穩(wěn)定培養(yǎng)一段時(shí)間后會(huì)進(jìn)入到體細(xì)胞胚胎發(fā)生的途徑，由圖3B和3C可以看出懸浮細(xì)胞所處的時(shí)期是盾型胚。

圖3 懸浮細(xì)胞的狀態(tài)

2.6 植株再生與移栽

單子葉植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生包含原胚、球形胚、盾型胚等不同的發(fā)育階段。本研究將所得的盾型胚轉(zhuǎn)移至基本的MS固體培養(yǎng)基上，莖端先發(fā)育，然后開始長根。如圖4所示，最終長成正常的植株，檢測發(fā)現(xiàn)植株的移栽成活率達(dá)到95%。

3 結(jié)論與討論

有關(guān)利用愈傷組織、懸浮細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行小麥的組織培養(yǎng)及再生的報(bào)道很多，這些研究都需要愈傷組織。有研究者想通過直接挑選胚性愈傷組織進(jìn)入到懸浮階段，而省去先誘導(dǎo)愈傷組織再得到胚性愈傷組織這一步驟，然而僅在部分基因型中得到實(shí)現(xiàn)。胚性愈傷組織是可以從懸浮細(xì)胞中直接獲得的。

圖4 鄭麥9023成熟胚發(fā)育成正常的植株

植物愈傷組織誘導(dǎo)以及繼代培養(yǎng)受到多種因素的影響，如基因型、外植體、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、溫度等，其中植物生長調(diào)節(jié)劑影響很大。很多研究表明，用于愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基中2，4-D的質(zhì)量濃度為2.0 mg/L[10]，然而在本試驗(yàn)中，小麥鄭麥9023愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D的質(zhì)量濃度為 3.0 mg/L，基因型的不同可能導(dǎo)致了試驗(yàn)結(jié)果的差異。

本試驗(yàn)的愈傷組織固體繼代培養(yǎng)基中，所選擇的2，4-D質(zhì)量濃度為1.0～3.0 mg/L。結(jié)果顯示，在低質(zhì)量濃度的2，4-D下，愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中生長狀態(tài)較好，而在高質(zhì)量濃度2，4-D下，愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中狀態(tài)不好。同時(shí)附加了不同質(zhì)量濃度的KT，最終在MS+ 1.0 mg/L 2, 4-D + 0.1 mg/L KT的最佳培養(yǎng)基上得到了黃色松脆的胚性愈傷組織，進(jìn)而繼續(xù)探索最佳的懸浮體系。

與固體培養(yǎng)相比，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有細(xì)胞繁殖速度快，能大規(guī)模地培養(yǎng)和提供大量均勻一致的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)[11-14]。本試驗(yàn)中，液體培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞分裂速度快，球形胚的數(shù)量多且較同步，并可以得到較多的各個(gè)時(shí)期的胚。球形胚經(jīng)過體胚萌發(fā)和體胚成熟等步驟的處理，成功地誘導(dǎo)獲得了體胚的再生植株。

相對(duì)于器官發(fā)生而言，體細(xì)胞胚胎發(fā)生的優(yōu)點(diǎn)很多，包括高效、再生效率高等,適合于在分子水平上研究胚胎發(fā)生[12]；體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)是遺傳轉(zhuǎn)化研究的良好受體系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，可以轉(zhuǎn)入有用抗性基因，進(jìn)行遺傳改良研究[12]。

基于小麥的胚性細(xì)胞懸浮系可以有效開展小麥的細(xì)胞工程研究，包括小麥體細(xì)胞無性系突變體的篩選、生物反應(yīng)器等。目前，大多數(shù)的小麥突變體還是通過EMS誘變獲得，與EMS誘變相比，體細(xì)胞無性系突變體具有快速獲得、遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn):

[1] Guenzi A C,Scheets K,Green J L,etal.Development and characterization of a nonmorphogenetic cell line of wheat (Triticumaestivum)[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2004,78:23-28.

[2] Yu C,Chen Z,Lu L,etal.Somatic embryogenesis and plant regeneration from litchi protoplasts isolated from embryogenic suspensions[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2000,61:51-58.

[3] Przetakiewicz A,Orczyk W,Nadolska-Orczyk A.The effect of auxin on plant regeneration of wheat, barley and triticale[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2003,73:245-256.

[4] Varshney A,Altpeter F.Stable transformation and tissue culture response in current European winter wheats (TriticumaestivumL.)[J].Molecular Breeding,2002,8:295-309.

[5] Brisibe E A, Olesen A,Andersen S B.Characterization of anther culture-derived cell suspensions exclusively regenerating green plantlets in wheat (TriticumaestivumL.)[J].Euphytica,1997,93: 321.

[6] Li H,Machii H,Hagio T,etal.Plant regeneration from protoplasts ofTriticumaestivumL.cv.Nakasoushu[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1999,58:119-125.

[7] Wang W C,Nguyen H T.A novel approach for efficient plant regeneration from long-term suspension culture of wheat[J].Plant Cell Reports,1990,8:639-642.

[8] Qiao Y M,Cattaneo M,Locatelli F,etal.Plant regeneration from long term suspension culture-derived protoplasts of hexaploid wheat (TriticumaestivumL.)[J].Plant Cell Reports,1992,11:262-265.

[9] 陳琰,張潔,王冬梅.建立小麥洛夫林10懸浮系初探[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(4):68-70.

[10] 蔡體樹,田慧琴,林書康.基因型和胚齡對(duì)小麥未成熟胚離體培養(yǎng)反應(yīng)的影響[J].遺傳學(xué)報(bào),1989,16(2):81-88.

[11] Attree S,Dunstan D,Fowke L.Plantlet regeneration from embryogenic protoplasts of white spruce (Piceaglauca)[J].Nature Biotechnology,1989,7(10):1060-1062.

[12] Merkle S.Strategies for dealing with limitations of somatic embryogenesis in hardwood trees[J].Plant Tissue Culture and Biotechnology,1995,1:112-121.

[13] Vinocur B,Carmi T,Altman A,etal.Enhanced bud regeneration in aspen (PopulustremulaL.) roots cultured in liquid media[J].Plant Cell Reports,2000,19(12):1146-1154.

[14] 施嫻泓，葉莉，劉臘梅，等.L-β-苯基乳酸對(duì)小麥幼苗生長及生理的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49(1)：30-35.