3D打印氣管支架在長段氣管缺損修復(fù)中的應(yīng)用

鄭開福 劉宇健 唐希陽 姜濤 李小飛 趙晉波

氣管是連接肺和外界大氣的唯一通道，對維持生命具有至關(guān)重要的作用。目前手術(shù)切除重建是治療長段氣管損傷、腫瘤、狹窄等疾病最主要的方式之一。然而由于氣管的活動度較小，切除的長度過長會因吻合口張力過大導(dǎo)致手術(shù)失敗，目前臨床上氣管切除的長度極限為6 cm或不超過兒童氣管的1/3[1-2]。因此對于長段氣管的切除重建是臨床上一個具有挑戰(zhàn)性的難題，其中組織工程氣管是目前氣管替代物研究中的熱點。隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，將3D打印技術(shù)與組織工程技術(shù)相結(jié)合成為一個新的研究方向，通過打造與原生氣管生物性能更加接近的組織工程氣管[3]，可能為臨床治療長段氣管缺損提供更好的方式。在3D打印技術(shù)應(yīng)用于氣管重建的研究中，最常用的一種應(yīng)用是采用3D打印技術(shù)構(gòu)建氣管支架，通過支架來進行組織工程的再生；此外，另外一種應(yīng)用是采用3D打印技術(shù)將種子細(xì)胞等進行植入和三維立體培養(yǎng)，此類應(yīng)用涉及到生物3D打印的范疇，在本文中暫時不做討論。

一、3D打印氣管支架的材料與設(shè)計

氣管由于其解剖位置的特殊性，要求3D打印氣管支架不僅要具備足夠的強度以維持通氣功能，同時還需要有一定的活動性，能夠抵抗一定的彎曲和旋轉(zhuǎn)所帶來的應(yīng)力。材料和支架結(jié)構(gòu)的設(shè)計是影響支架性能的重要因素。

目前用于3D打印的材料主要包括天然聚合物和合成聚合物[4]。與合成聚合物相比，天然聚合物擁有更好的生物相容性，更有利于人工氣管周圍組織的長入，促進氣管再血管化、氣管軟骨及纖毛上皮的再生，但是天然聚合物的力學(xué)性能較低，限制了其在氣管支架中的應(yīng)用。合成聚合物具有更好的穩(wěn)定性以及更高的強度，因此氣管支架的制造多采用合成聚合物，包括聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）、聚氨酯（polyurethane，PU）、聚乳酸（polylactic acid，PLL A）、聚乳酸羥基乙酸（poly lactoglycolic acid，PLGA）等[5]。PCL由于其優(yōu)異的生化特性，如熔點低、無毒、可降解、生物相容性好、較強的抗拉伸性[6]，使PCL成為氣管支架研究中應(yīng)用最廣泛的材料。但PCL材料是否是最適合用于氣管支架的制造并沒有明確的答案。Ahn等[7]采用PU和PCL設(shè)計了相同的支架結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示PU材料制造的氣管比PCL的機械性能更好。目前關(guān)于不同材料的氣管支架的對比研究較少，同時材料學(xué)的迅速發(fā)展，各種新型材料也層出不窮，何種材料最適合于氣管替代物的制造還需要進一步研究。

圓筒狀氣管與波紋狀氣管是目前氣管支架主要的兩種結(jié)構(gòu)形態(tài)。Park等[8]研究表明在三點彎曲實驗中，雖然圓筒狀氣管能夠提供更強的力學(xué)強度，但是通過分析整體的壓力分布發(fā)現(xiàn)圓筒狀氣管的壓力集中在受壓點，形變程度明顯，管腔直徑明顯降低，而波紋狀氣管可以將壓力均勻分布于整個氣管，受力均勻，形變程度明顯低于波紋狀氣管，管腔直徑基本沒有改變。Park等[9]將波紋狀氣管與原生氣管相比，波紋狀氣管可承受的三點彎曲的強度為（1.088±0.161）MPa，原生氣管為（0.214±0.125）MPa，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ahn等[7]的研究中增加了3D打印氣管支架在扭轉(zhuǎn)維度的力學(xué)測試，結(jié)果也表明波紋狀氣管更加的靈活，具有更大的扭轉(zhuǎn)角度。由此可見波紋狀氣管是相對較好的一種用于氣管重建的設(shè)計方式（表1）。波紋狀氣管是對原生氣管的一種仿生設(shè)計，因此在設(shè)計氣管結(jié)構(gòu)時，應(yīng)考慮實驗動物原生氣管的軟管環(huán)與軟骨環(huán)的間隔以及軟骨環(huán)的寬度，進而以實際數(shù)據(jù)設(shè)計波紋與波紋的間隔以及波紋的寬度，達(dá)到仿生效果。

多孔結(jié)構(gòu)是3D打印組織器官研究的一個熱點，目的是為促進移植物周圍的細(xì)胞長入移植物。研究[10]表明孔隙直徑為300 μm最適于氣管組織長入，同時為加快氣管移植物的軟骨、上皮、血管等再生，通常在氣管支架上種植上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。但是研究[11]表明接種的細(xì)胞劑量與氣管移植物發(fā)生狹窄密切相關(guān)，隨著種植細(xì)胞劑量的提高，氣管移植物的功能可隨之得到改善。Best等[11]設(shè)計了多孔和無孔的C型環(huán)氣管支架并進行對比，結(jié)果顯示在相同培養(yǎng)條件下，無孔氣管支架的細(xì)胞增殖的密度高于多孔氣管支架，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這與傳統(tǒng)的觀念有較大的差異。因此進一步探究3D打印氣管支架的空隙直徑，平衡細(xì)胞種植劑量與氣管組織的長入是后續(xù)研究的重要內(nèi)容。另一方面，氣管支架的厚度、降解速率等因素對促進細(xì)胞黏附、血管及氣管軟骨再生均具有重要的影響，但是目前關(guān)于這方面的研究很少，還需要進一步探索。

二、3D打印氣管支架的組織再生問題

理想的氣管替代物除在結(jié)構(gòu)上能維持呼吸道的通暢，保證基本的通氣功能外，在功能上還應(yīng)該盡可能達(dá)到與原生氣管一致的水平，因此在長段氣管缺損的修復(fù)重建中氣管替代物的再上皮化、再血管化及新生軟骨形成是需要解決的3個重要問題。單純的3D打印氣管支架促進新生的上皮、血管及軟骨形成的能力較弱，同時也可引起較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肉芽組織的生成，造成氣管移植物的狹窄。為解決這些問題，不同研究團隊探索不同的方法（表2），包括種植上皮細(xì)胞、耳廓軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等促進組織再生，將支架包被凝膠、細(xì)胞外基質(zhì)為組織再生提供內(nèi)環(huán)境等[20]。

1. 3D打印氣管支架的再上皮化

氣管腔內(nèi)完整假復(fù)層纖毛柱狀上皮是抗感染的重要因素[21]，假復(fù)層纖毛柱狀上皮缺損可引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肉芽組織的形成，造成氣道狹窄。Chan等[15]以新西蘭兔作為實驗動物，使用單純的PCL氣管進行移植，隨訪4周發(fā)現(xiàn)氣管替代物發(fā)生嚴(yán)重狹窄，狹窄程度為83%～98%，肉芽組織增生明顯，僅在吻合口附近有少量纖毛上皮再生，移植物中央未見新生上皮組織。Bhora等[12]采用牛真皮細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）作為支架內(nèi)襯構(gòu)建人工氣管，將其移植到豬的氣管中，結(jié)果與Chan團隊相似。劉春全等[14]將PCL氣管支架復(fù)合軟骨細(xì)胞進行移植，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞基本覆蓋整個管腔需要6個月，而纖毛上皮的生成需要更長的時間。因此單純依靠吻合口兩端原生氣管的上皮細(xì)胞爬行到氣管移植物管腔表面難度較高，長段氣管替代物的再上皮化還需依賴于在氣管替代物上種植上皮細(xì)胞。Park等[13]首先將含有脫細(xì)胞的氣管黏膜外基質(zhì)的水凝膠覆蓋在氣管內(nèi)表面，然后將人下鼻甲間充質(zhì)干細(xì)胞片覆蓋在水凝膠上構(gòu)建組織工程氣管。將該人工氣管移植到兔氣管中，結(jié)果顯示2個月時兔的氣管管腔光滑，新生的成熟上皮完全覆蓋整個管腔表面，僅在吻合口處可見輕微的狹窄。該方法成功的使氣管腔內(nèi)的上皮再生，基本恢復(fù)正常氣道內(nèi)皮的一個正常功能，但還需要更長期的隨訪觀察及大型動物研究進一步驗證該方式的可靠性。

表1 不同材料及結(jié)構(gòu)氣管支架力學(xué)性能

表2 3D打印氣管支架對修復(fù)長段氣管缺損的研究結(jié)果

2. 3D打印氣管支架的再血管化

血管是氣管替代物營養(yǎng)供應(yīng)的基本來源，新生血管的生成能夠為上皮和軟骨提供營養(yǎng)，進一步促進纖毛柱狀上皮和軟骨組織的生成。在氣管替代物移植前進行預(yù)血管化是使用最多的方法。大網(wǎng)膜具有豐富的血運，Park等[9]將PCL氣管在兔子的大網(wǎng)膜中包埋2周后取出移植，組織學(xué)檢查結(jié)果顯示氣管支架內(nèi)有大量的新生血管形成，同時氣管管腔內(nèi)可見纖毛柱狀上皮和黏膜下層，新生組織中未見明顯炎癥。而在未預(yù)血管化組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，新生組織沒有明顯的結(jié)構(gòu)層次。Gao等[1]將氣管包埋在裸鼠背部皮下，取得了類似的結(jié)果。然而不管是包埋在大網(wǎng)膜還是皮下，均須取出后再進行移植。Gao等[16]將包被有軟骨細(xì)胞水凝膠的PCL氣管包埋在頸旁肌肉中2周，然后在原位進行氣管移植。優(yōu)點在于在預(yù)血管化之后不用離斷氣管替代物與周圍組織已經(jīng)形成的血管，可以為氣管替代物提供長期的血供。在該研究中經(jīng)過預(yù)血管化的氣管替代物軟骨細(xì)胞和纖毛上皮再生情況明顯優(yōu)于未預(yù)血管化的氣管替代物。因此，預(yù)血管化是促進氣管替代物血管再生的一種可行方法。

3. 3D打印氣管支架的軟骨形成

氣管軟骨是為氣道提供力學(xué)支撐的重要結(jié)構(gòu)，防止由于呼吸運動導(dǎo)致氣管塌陷而發(fā)生呼吸阻塞。長段氣管缺損的目標(biāo)是3D打印的氣管支架隨著時間逐步降解，同時C型軟骨逐步形成，最終由氣管軟骨為氣管替代物提供力學(xué)支撐。

Park等[8]將肝素化的明膠海綿環(huán)與波紋狀氣管復(fù)合，在明膠海綿環(huán)上負(fù)載可以緩釋的TGF-β1，同時種植人鼻中隔來源的軟骨細(xì)胞，將該組織工程氣管埋置在裸鼠背部皮下8周，結(jié)果顯示明膠海綿中充滿軟骨樣組織，阿爾新藍(lán)和番紅染色顯示新生組織中含有豐富的糖胺聚糖，這進一步表明軟骨的形成。由于明膠海綿為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此新生的軟骨有望形成與原生氣管一樣的C型軟骨。葛陽等[17]采用軟骨細(xì)胞膜片與3D打印聚酰胺支架復(fù)合，包埋在裸鼠皮下8周可見大量軟骨陷窩形成，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。張恒一等[18]采用種植耳廓軟骨細(xì)胞的明膠（gelatin，GT）/PCL靜電紡納米纖維膜與聚乳酸己內(nèi)酯（poly DL-lactideε-caprolactone，PLCL）支架復(fù)合構(gòu)建組織工程氣管，發(fā)現(xiàn)C型環(huán)狀軟骨結(jié)構(gòu)形成。然而，Xia等[19]將PCL復(fù)合軟骨細(xì)胞的氣管支架在山羊中進行移植，但是僅在吻合口處可見軟骨樣組織形成，這與皮下包埋的結(jié)果差距較大。因此，在氣管原位移植中軟骨的再生還需進一步研究。

4. 抗感染及抗炎作用

由于移植早期氣管腔內(nèi)的纖毛上皮還未形成，氣管替代物無法順利將異物及氣道分泌物排出。Xia等[19]的研究表明導(dǎo)致實驗動物死亡最主要的原因是由于肉芽組織增生導(dǎo)致氣管狹窄。因此制造具有抗感染和炎癥反應(yīng)的支架對減輕肉芽組織生成、避免管腔狹窄具有十分重要的意義。Lee等[22]在3D打印PCL氣管與普朗尼克F127非對稱多孔膜復(fù)合，該膜的空隙為納米級，能有效防止纖維結(jié)締組織侵入氣管腔，并能滲透黏膜再生所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。研究[22]表明非對稱多孔膜能夠明顯減輕氣管腔的肉芽組織生成。另一方面，Kang等[23]的研究表明在氣管支架表面采用離子液體聯(lián)合氧化石墨烯修飾可以提高支架的抗感染能力。因此，后續(xù)的研究應(yīng)該進一步探索氣管的表面結(jié)構(gòu)改性，使人工氣管具有更好的組織相容性和更長的生存時間。

5. 總結(jié)

綜上所述，3D打印氣管支架用于長段氣管缺損的修復(fù)是可行的。首先，氣管支架的強度明顯優(yōu)于原生氣管，PCL等可降解吸收材料的降解速度較慢，足以維持移植早期氣管腔內(nèi)的通暢。其次，通過仿生設(shè)計，支架在三點彎曲、徑向壓縮及扭轉(zhuǎn)試驗中都獲得了較為滿意的力學(xué)性能，基本達(dá)到原生氣管的力學(xué)要求。最后，3D打印氣管支架為上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等黏附提供了基本骨架作用，另一方面將強度較大的支架與強度較低的細(xì)胞外基質(zhì)、水凝膠等復(fù)合，在皮下、大網(wǎng)膜、頸旁肌肉等位置進行包埋預(yù)血管化，進一步促進3D打印氣管支架的再上皮化、血管化及軟骨再生。但是3D打印氣管支架還存在一些問題。首先，氣管支架對于機體屬于異物，這可能是導(dǎo)致許多動物氣管腔內(nèi)肉芽組織增生的重要原因之一。其次，大部分研究的支架設(shè)計沒有考慮到原生氣管后膜的作用，使移植后氣管排除異物及抗感染能力下降，影響長期的生存質(zhì)量。最后，與上皮再生相比，軟骨再生的周期較長，對于支架的降解速度是基于材料在體外的降解速度判斷的，在體內(nèi)支架的降解速度與軟骨形成速度是否能夠匹配還有待進一步的觀察研究。

三、展望

理想的氣管替代物應(yīng)該具有適當(dāng)?shù)臋C械性能、充足的血供、完整的氣管內(nèi)皮組織、C型結(jié)構(gòu)的軟骨環(huán)[24]，最終形成與原生氣管一致的氣管，即纖毛柱狀上皮為內(nèi)襯，C型環(huán)狀軟骨做支撐的結(jié)構(gòu)。因此，同時種植兩種或兩種以上細(xì)胞促進氣管替代物朝原生氣管方向分化可能是未來的一個重要方向。Kim團隊[25-26]進行了嘗試，使用新西蘭兔的鼻內(nèi)側(cè)黏膜上皮細(xì)胞和耳廓軟骨細(xì)胞分別與藻酸鹽水凝膠在體外均勻混合，聯(lián)合PCL材料，采用3D打印技術(shù)打印出5層結(jié)構(gòu)的人工氣管，最內(nèi)層和最外層為含孔隙結(jié)構(gòu)的PCL支架，中間為無空隙結(jié)構(gòu)的PCL支架，兩層支架之間內(nèi)層為含上皮細(xì)胞的水凝膠，外層為含軟骨細(xì)胞的水凝膠。但是該研究為氣管部分缺損的修復(fù)（10 mm×10 mm），是否適用于長段氣管缺損的修復(fù)還有待進一步研究。另一方面，隨著各種新型材料的發(fā)現(xiàn)，還應(yīng)該進一步對不同材料的3D打印氣管進行對比研究，選取最佳的材料。同時氣管的微觀結(jié)構(gòu)，包括空隙的直徑、厚度、形狀、表面修飾等均是影響細(xì)胞黏附的重要因素，需要進一步研究并在活體實驗中進行驗證。