基于G-SSR和EST-SSR標(biāo)記的鯽6個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

甘寶江 龐美霞 俞小牧 童金茍

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

鯽屬(Carassius)隸屬鯉科(Cyprinidae)中的鯉亞科(Cyprininae)， 該屬通常被劃分為3個(gè)種: 黑鯽(Carassius carassius)、鯽(Carassius auratus)和銀鯽(Carassius auratus gibelioBloch)。目前的研究表明， 黑鯽主要分布于中歐、東歐， 亞洲西伯利亞勒那河和我國(guó)新疆； 鯽主要分布于中國(guó)、日本和朝鮮半島[1]； 銀鯽因其多倍體起源[2]、獨(dú)特的多重生殖方式[3]， 已逐漸被視為一個(gè)獨(dú)立的物種[4]， 其廣泛分布于亞歐大陸[5]。鯽有三倍體銀鯽和二倍體鯽之分[6]， 在我國(guó)分布很廣泛， 擁有的地理種群繁多， 遍布我國(guó)各大湖泊及水系， 且擁有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。在不同水系環(huán)境中生活的鯽， 其形態(tài)、行為、生活史、體色、肉質(zhì)等方面出現(xiàn)了一定的變異和分化， 展現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。因此， 鯽在我國(guó)淡水生態(tài)系統(tǒng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中占據(jù)重要地位， 對(duì)其進(jìn)行種群遺傳多樣性的研究具有較大的理論和應(yīng)用價(jià)值。

遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是物種長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵因素， 包括對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)[7]， 并在野生動(dòng)物保護(hù)和管理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)物種遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析， 可以確定哪些種群應(yīng)該被優(yōu)先保護(hù)[8]， 而且其分析結(jié)果可以反應(yīng)物種或種群的進(jìn)化歷史， 估算其進(jìn)化潛力和育種能力， 為保護(hù)稀有或?yàn)l危物種資源提供參考， 還可以為魚類經(jīng)濟(jì)性狀的改良和種質(zhì)資源的保護(hù)奠定基礎(chǔ)[9]。目前， 在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究中常使用的遺傳標(biāo)記主要包括線粒體DNA (Mitochondrial DNA， mtDNA)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism， RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplified polymorphic DNA， RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism， AFLP)、小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)、微衛(wèi)星(Microsatellite DNA)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism， SNP)以及表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence tags， ESTs)等[10]。由于各種遺傳標(biāo)記的特性各不相同， 它們適用的遺傳學(xué)研究領(lǐng)域也不盡相同。其中微衛(wèi)星標(biāo)記(也稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列， Simple sequence repeat， SSR)， 由于其具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、數(shù)量豐富、呈共顯性遺傳且廣泛而均勻地分布于基因組等優(yōu)點(diǎn)， 已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析[11—14]。

SSR按照其來(lái)源可分為基因組SSR (G-SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (EST-SSR)。其中G-SSR標(biāo)記來(lái)源于基因組序列， 一般通過(guò)經(jīng)典的構(gòu)建與篩選基因組文庫(kù)、微衛(wèi)星富集、省略篩庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索等[15]方法進(jìn)行開發(fā)， 該類標(biāo)記極少能定位到基因上。EST-SSR標(biāo)記則來(lái)源于轉(zhuǎn)錄序列， 可以定位到相關(guān)功能基因上， 因此， EST-SSR標(biāo)記可以檢測(cè)種群基因功能的遺傳多態(tài)性， 而且能夠在近源物種中進(jìn)行跨種擴(kuò)增[16]， 相較于G-SSR標(biāo)記更有助于提高標(biāo)記輔助育種的效率[17，18]。近年來(lái)， 利用多種分子標(biāo)記對(duì)鯽群體遺傳多樣性已進(jìn)行了初步探討， 如蔣芳芳等[19]利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、mtDNA標(biāo)記及轉(zhuǎn)鐵蛋白等標(biāo)記分析了二倍體和三倍體鯽群體的遺傳多樣性； 楊林等[20]利用轉(zhuǎn)鐵蛋白和同工酶對(duì)銀鯽克隆系親緣關(guān)系及遺傳多樣性進(jìn)行了分析。然而， 利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析鯽野生群體遺傳多樣性的研究鮮有報(bào)道。

本研究分別利用8個(gè)FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)微衛(wèi)星富集技術(shù)開發(fā)的G-SSR標(biāo)記和8個(gè)本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的ESTSSR標(biāo)記， 以來(lái)自黑龍江、長(zhǎng)江、奉化江及淮河水系共6個(gè)鯽野生二倍體群體作為研究對(duì)象， 通過(guò)全自動(dòng)DNA測(cè)序儀分析技術(shù)對(duì)這些鯽野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析， 目的是為開展鯽種質(zhì)資源的遺傳評(píng)價(jià)和保護(hù)以及鯽經(jīng)濟(jì)性狀遺傳改良等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供群體遺傳學(xué)參考信息； 2種不同來(lái)源的微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析和比較結(jié)果， 也為鯽或其他魚類微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)和分子遺傳分析與應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所使用的6個(gè)鯽野生群體(圖 1、表 1)樣本于2006—2016年分別采集于黑龍江水系的鏡泊湖(JPH，n=45)和杜爾伯特蒙古族自治縣的九河鄉(xiāng)(JHX，n=35)， 奉化江水系的寧波(NB，n=41)、長(zhǎng)江水系的牛山湖(NSH，n=34)和太湖(TH，n=40)， 及淮河水系的洪澤湖(HZH，n=36)。每尾樣本魚剪取尾鰭約0.5 g浸泡于無(wú)水乙醇中保存?zhèn)溆茫?采用經(jīng)典的酚–氯仿法提取基因組DNA[21]。

1.2 倍性鑒定

圖 1 鯽6個(gè)群體的采樣點(diǎn)示意圖(用五角星表示)Fig. 1 Distribution of sampling sites for six Carassius auratus populations of China (the star dots stand for sampling sites)

表 1 本研究中所用的鯽樣本信息Tab. 1 Sample information of six crucian carp populations used in this study

參照Mishina等[22]利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定鯽染色體倍性的方法， 本實(shí)驗(yàn)室篩選出能高效、準(zhǔn)確地鑒定鯽倍性的微衛(wèi)星標(biāo)記[23，24](YJ0004、HLJYJ018、HLJYJ029、HLJYJ049)， 并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證(龐美霞等， 未發(fā)表資料)。本文對(duì)采集的共計(jì)231尾鯽復(fù)合種樣本的基因組DNA進(jìn)行上述4個(gè)SSR位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物用10%的非變性聚丙烯酰氨凝膠進(jìn)行電泳分型， 用溴化乙錠(EB)對(duì)凝膠進(jìn)行染色， 并用JS-A380凝膠成像儀(上海培清科技公司)掃描并拍照。統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體在每個(gè)位點(diǎn)上的等位基因數(shù)并判斷鯽樣本的染色體倍性。綜合4個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目信息， 只要有1個(gè)及以上位點(diǎn)上同時(shí)出現(xiàn)3個(gè)等位基因則認(rèn)為該個(gè)體是三倍體(或稱為六倍體)鯽； 從中挑選出二倍體(或稱為四倍體)鯽野生樣本進(jìn)行后續(xù)的群體遺傳學(xué)研究。鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)二倍體鯽個(gè)體總計(jì)180尾， 占總數(shù)的77.6%。其中， JHX、JPH、NSH、NB、TH、HZH的二倍體鯽的樣本數(shù)分別為32、31、27、30、36和24尾。

1.3 引物選取及PCR擴(kuò)增

本研究使用的G-SSR標(biāo)記來(lái)自于已發(fā)表的8個(gè)HLJYJ微衛(wèi)星標(biāo)記[18]， EST-SSR標(biāo)記來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)鯽EST序列設(shè)計(jì)的8個(gè)GCE微衛(wèi)星標(biāo)記(未發(fā)表的數(shù)據(jù))， 每對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的正向引物5′端使用FAM或HEX熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。

PCR反應(yīng)總體積為15 μL， 反應(yīng)混合物包含以下組分: 36—60 ng模板DNA， 0.48 UTaqDNA聚合酶， 1.5 μL 10×PCR buffer， 0.48 μL dNTP (2.5 mmol/L)， 0.48 μL正反向混合引物(各2.5 μmol/L)， 11.22 μL滅菌去離子水。PCR擴(kuò)增條件如下: 94℃預(yù)變性5min； 擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)， 每個(gè)循環(huán)94℃變性35s， 48—60℃退火35s (退火溫度見表 2)， 72℃延伸40s； 72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物采用3730型DNA測(cè)序儀(ABI， USA)測(cè)序分型， 微衛(wèi)星熒光引物合成以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分型均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

使用GeneMarker 2.2軟件讀取3730型DNA測(cè)序儀測(cè)序結(jié)果， 進(jìn)行微衛(wèi)星片段大小的統(tǒng)計(jì)。利用軟件PopGene 32[25]計(jì)算觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)以及Nei’s遺傳距離[26]。Microsoft-toolkit插件計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)。根據(jù)Nei’s遺傳距離， 使用MEGA 4軟件[27]對(duì)6個(gè)鯽野生群體進(jìn)行聚類分析。Arlequin 3.1軟件[28]計(jì)算各群體間的分化系數(shù)Fst， 同時(shí)用于進(jìn)行各群體的哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberge quilibrium)檢驗(yàn)。進(jìn)行多重比較時(shí)， 概率的顯著性水平需要進(jìn)行Bonferroni校正[29]。利用分子變異分析(AMOVA)方法[30]計(jì)算群體遺傳結(jié)構(gòu)， 利用Structure 2.2[31]軟件中的貝葉斯方法[32]混合模型來(lái)構(gòu)建群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性及群體多樣性分析

統(tǒng)計(jì)8個(gè)G-SSR標(biāo)記在所有鯽樣品中的多態(tài)性信息發(fā)現(xiàn)8個(gè)G-SSR (HLJYJ028、HLJYJ075、HLJYJ120、HLJYJ033、HLJYJ048、HLJYJ029、HLJYJ124、HLJYJ049)的Na和Ne分別為9—31和4.7—20.2， HLJYJ124位點(diǎn)Na最小(9)， HLJYJ028最大(31)。8個(gè)G-SSR位點(diǎn)的He、Ho以及PIC分別為0.789—0.953、0.659—0.878和0.757—0.948， 而8個(gè)EST-SSR (GCE092、GCE489、GCE359、GCE416、GCE451、GCE460、GCE464、 GCE474)的Na、Ne、He、Ho以及PIC分別為12—35、4.1—22.4、0.756—0.958、0.511—0.906和0.726—0.953。在HLJYJ引物和GCE引物中分別檢測(cè)到173和155個(gè)等位基因， HLJYJ和GCE微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均Na、Ne、He、Ho以及PIC分別為22、12.9、0.769、0.893、0.879， 19、9.5、0.728、0.870和0.855。G-SSR和EST-SSR標(biāo)記均為較高多態(tài)性的位點(diǎn)， 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，HLJYJ微衛(wèi)星位點(diǎn)的各平均遺傳多樣性參數(shù)均高于GCE微衛(wèi)星(表 3、表 4)， 表明鯽EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性稍低于G-SSR標(biāo)記。

6個(gè)鯽野生群體(JHX、JPH、NSH、NB、TH、HZH)在各位點(diǎn)的多樣性詳細(xì)信息見表 4。在共計(jì)180尾樣本中， 共檢測(cè)到328個(gè)等位基因， 其中黑龍江水系JHX和JPH群體分別檢測(cè)到194和188個(gè)等位基因， 奉化江水系NB群體檢測(cè)到212個(gè)等位基因， 長(zhǎng)江水系的NSH和TH群體分別檢測(cè)到211和232個(gè)等位基因， 而淮河水系的HZH群體檢測(cè)到210個(gè)等位基因。利用G-SSR和EST-SSR檢測(cè)每個(gè)群體的平均Na和平均Ne分別在12—15、7.6—10.6；11—14、5.5—7.7變化(表 5)， 各個(gè)群體的平均He、平均Ho以及平均PIC分別介于0.816—0.896、0.739—0.869和0.786—0.864； 0.801—0.867、0755—0.856和0.761—0.833。2種微衛(wèi)星標(biāo)記在6個(gè)鯽野生群體中的檢測(cè)結(jié)果均顯示， 屬于黑龍江水系的JHX和JPH兩群體的各平均多樣性參數(shù)都相對(duì)較小， 表明黑龍江水系群體遺傳多樣性偏低； 而淮河、奉化江與長(zhǎng)江水系鯽野生群體間遺傳多樣性無(wú)明顯差異。

2.2 群體間的遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分析發(fā)現(xiàn)， 群體間的遺傳變異占4.47%，群體內(nèi)的遺傳變異占95.53%， 說(shuō)明鯽遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)部個(gè)體間。8個(gè)G-SSR在6個(gè)鯽群體的遺傳分化分析結(jié)果顯示， 鯽群體間Fst值介于0.008—0.085 (表 6)， 表明各群體間存在不同程度的遺傳分化。隸屬黑龍江水系的JHX和JPH兩群體間Fst值較低， 而這2群體與其余水系群體間的Fst值均較高。其中JPH與長(zhǎng)江、奉化江和淮河水系的群體兩兩間Fst值為0.060—0.085， 遺傳分化均極顯著(P＜0.01)；JHX群體與奉化江、長(zhǎng)江和淮河水系的群體兩兩間Fst值為0.044—0.081之間， 與NSH以及NB群體間的Fst值達(dá)到了0.081和0.060(P＜0.01)。位于奉化江水系的NB、長(zhǎng)江水系下游的TH和淮河水系HZH兩兩群體之間Fst值較小(0.008—0.017)， 而這3個(gè)群體與位于長(zhǎng)江水系中游的NSH群體間Fst值則相對(duì)較大(0.028—0.040)。利用軟件Structure2.2對(duì)群體內(nèi)的各個(gè)體進(jìn)行混合模型分析(圖 2)， 本研究選取K值為2—6， 重復(fù)計(jì)算20次， 根據(jù)公式ΔK=m([L″K])/s[L(K)][33]計(jì)算出最佳理論群數(shù)ΔK=2。假設(shè)K=2時(shí)， 可以明顯看出6個(gè)鯽群體分屬于2個(gè)類群，其中來(lái)自黑龍江水系的JHX、JPH群體與其余水系的群體間的遺傳結(jié)構(gòu)分化明顯， 聚為一個(gè)類群， 而其他群體相對(duì)獨(dú)立為另一類群。各個(gè)鯽群體間的Nei’s遺傳距離介于0.203—0.701(表 6)， 以TH和HZH群體之間的遺傳距離最小， 而JPH與NSH群體之間的遺傳距離最大， 遺傳距離與地理距離之間成正相關(guān)關(guān)系。依據(jù)計(jì)算出來(lái)的Nei’s遺傳距離(表6)對(duì)6個(gè)鯽群體進(jìn)行了聚類分析(圖 3)， 發(fā)現(xiàn)來(lái)自黑龍江水系的JHX與JPH群體聚為一枝， 其余群體聚為另一大枝， 該分枝中長(zhǎng)江水系下游的TH、奉化江水系NB與淮河水系的HZH群體聚為一枝， 再與位于長(zhǎng)江水系中游的NSH群體聚為一大枝。

表 2 本研究中所用鯽微衛(wèi)星標(biāo)記的基本信息Tab. 2 Information of Carassius auratus microsatellite markers used in this study

表 3 16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳參數(shù)信息表Tab. 3 Genetic parameters at 16 microsatellite markers

利用8個(gè)EST-SSR計(jì)算6個(gè)鯽野生群體間群體間Fst值、Nei’s遺傳距離分別介于0.203—0.701和0.117—0.683(表 6)， 貝葉斯分析根據(jù)公式ΔK=m([L″K])/s[L(K)][33]計(jì)算出最佳理論群數(shù)ΔK=2。與G-SSR分析結(jié)果相比， 基于EST-SSR標(biāo)記的UPGMA聚類分析和貝葉斯分析也將6個(gè)鯽群體劃為兩大類群: 黑龍江水系群體， 奉化江、長(zhǎng)江和淮河水系群體(圖 3)， 盡管EST-SSR與G-SSR標(biāo)記的Fst值、Nei’s遺傳距離數(shù)值不同， 但兩類SSR標(biāo)記揭示了相似的鯽群體遺傳結(jié)構(gòu)和分化格局。

3 討論

3.1 鯽野生群體遺傳多樣性

一般來(lái)說(shuō)， 微衛(wèi)星位點(diǎn)的核心重復(fù)次數(shù)至少為5次才可能檢測(cè)出遺傳多態(tài)性[36]， 而且重復(fù)次數(shù)越高， 其等位基因數(shù)也就相應(yīng)越多[37]。本文所使用的16個(gè)SSR標(biāo)記的核心序列重復(fù)次數(shù)均在5—31次(表2)， 在6個(gè)鯽群體中的多態(tài)信息含量(PIC)介于0.725—0.953， 表明它們均為高度多態(tài)性座位[38](PIC＞0.5， 表 3)。PIC是反映群體遺傳多樣性的度量之一， 其數(shù)值與基因豐度成正相關(guān)[39]。在本研究中， 2種來(lái)源的SSR被用于鯽群體遺傳多樣性的研究， 在不同水系來(lái)源的6個(gè)群體中均檢測(cè)出較高的多態(tài)性(表 4、表 5)。賈志英等[40]利用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)黑龍江水系6個(gè)鯽野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)， 平均PIC為0.596—0.648， 其鯽群體遺傳多樣性相較本研究中黑龍江水系2個(gè)鯽野生群體偏低； 魯雙慶等[41]利用9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)4個(gè)鯽群體研究發(fā)現(xiàn)， 平均PIC為0.530—0.670， 同樣低于本研究中的6個(gè)鯽群體遺傳多樣性。這些PIC差異可能是由以下兩方面的原因造成的: 一方面可能是由于使用的微衛(wèi)星標(biāo)記的種類和具體位點(diǎn)不同； 另一方面可能是由于不同分辨率的檢測(cè)方法所產(chǎn)生的遺傳多態(tài)性差異[42，43]。與傳統(tǒng)方法的聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯色相比， 使用DNA測(cè)序儀檢測(cè)到的等位基因數(shù)要比前者多得多。例如， 利用相同的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究草魚(Ctenopharyngodon idellus)群體遺傳多樣性， 李家樂等[44]利用測(cè)序儀分型檢測(cè)技術(shù)和付建軍等[45]利用傳統(tǒng)聚丙烯酰胺電泳技術(shù)所檢測(cè)到的等位基因數(shù)分別為7—12個(gè)和2—6個(gè)。本研究還發(fā)現(xiàn)利用2種不同來(lái)源微衛(wèi)星標(biāo)記， 均發(fā)現(xiàn)黑龍江水系鯽群體的各遺傳參數(shù)明顯低于其余3個(gè)水系。在利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究黑龍江、長(zhǎng)江和珠江水系草魚[45]、鰱(Hypophthalmichehys molitrix)[46]群體遺傳多樣性時(shí)， 不同作者也發(fā)現(xiàn)黑龍江水系這2種魚類的群體遺傳多樣性偏低。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因可能是黑龍江水系位于高緯度地區(qū)， 由于餌料及氣候環(huán)境等[45]因素造成魚類資源比較匱乏； 而長(zhǎng)江水系水面大、餌料豐富和氣候環(huán)境適宜等使其能夠容納更豐富的魚類資源， 因而長(zhǎng)江水系魚類群體具有較高遺傳多樣性。Nevo[47]也認(rèn)為微衛(wèi)星等分子遺傳標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目與環(huán)境溫度呈正相關(guān)。李思發(fā)等[48]進(jìn)一步證實(shí)同種魚類不同種群的多態(tài)位點(diǎn)比例有隨緯度的升高而降低的趨勢(shì)， 黑龍江水系魚類種群遺傳多樣性相對(duì)較低。

表4 六個(gè)鯽群體在16個(gè)核微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性信息Tab. 4 Major statistics of the analysis at 16 Carassius auratus microsatellite loci

3.2 鯽群體結(jié)構(gòu)

群體遺傳分化系數(shù)Fst是反映群體間遺傳分化程度的常用指標(biāo)， 數(shù)值越大則表示兩群體間的遺傳分化程度越高[49]。一般認(rèn)為，F(xiàn)st值在0.05以上時(shí)群體間的遺傳分化程度達(dá)到中等或顯著性[50]。本研究中8個(gè)G-SSR標(biāo)記檢測(cè)群體間基因分化系數(shù)顯示(表 6)， 來(lái)自黑龍江水系的2個(gè)群體與其余水系的所有群體兩兩間Fst值介于0.044—0.085， 均達(dá)到或接近于中等程度的遺傳分化， 表明黑龍江鯽群體與其他水系群體間的遺傳結(jié)構(gòu)存在較明顯的差異。李思發(fā)等[48]在對(duì)長(zhǎng)江、珠江、黑龍江的鰱、鳙(Aristichthys nobilis)和草魚原種種群的生化遺傳結(jié)構(gòu)與變異的研究中發(fā)現(xiàn)， 同種魚在不同水系種群之間存在著明顯的生化遺傳差異， 尤其是黑龍江水系群體與其他水系群體差異最大， 與本研究結(jié)果相似。這可能是因?yàn)楹邶埥等后w處于相對(duì)獨(dú)立的邊緣地區(qū)[51]， 與其余水系群體形成地理隔離導(dǎo)致生殖隔離所致； 來(lái)自長(zhǎng)江、奉化江和淮河水系的群體兩兩間Fst值均小于0.05， 屬于輕微程度的遺傳分化或無(wú)明顯分化， 這是由于這些水系之間存在一定的連通， 或由于地理距離較近存在人為遷移和運(yùn)輸因素，導(dǎo)致屬于這些水系的魚類群體之間可能具有一定程度的基因交流。聚類分析也顯示(圖 3)， 黑龍江水系兩群體單獨(dú)聚為一枝， 其余水系群體聚為另一枝， 表明鯽群體間遺傳距離與群體間的地理距離成正相關(guān)。王偉偉等[52]發(fā)現(xiàn)相近的斑鱖(Siniperca scherzeri)地理群體之間的遺傳關(guān)系較近。楊慧榮等[53]對(duì)珠江和長(zhǎng)江水系赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)線粒體DNA D-loop分析后， 也發(fā)現(xiàn)相近的地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)相似。這些研究均支持較大的地理距離與遺傳距離正相關(guān)的結(jié)論。

表 5 六個(gè)鯽群體的平均遺傳參數(shù)Tab. 5 Mean genetic parameters in 6 Carassius auratus populations

表 6 六個(gè)鯽群體間的Fst值(對(duì)角線下方)及遺傳距離(對(duì)角線上方)Tab. 6 Nei's genetic distance (above diagonal) and pairwise Fst values (below diagonal) among 6 Carassius auratus populations

圖 2 六個(gè)鯽群體個(gè)體在不同假設(shè)K值的遺傳結(jié)構(gòu)Fig. 2 Genetic structure of assuming different K values for individuals of six Carassius auratus populations

圖 3 基于Nei’s遺傳距離的6個(gè)鯽群體聚類圖Fig. 3 The dendrogram of the six Carassius auratus populations based on Nei’s genetic distance using UPGMA method

迄今還未有同時(shí)利用G-SSR和EST-SSR標(biāo)記對(duì)同一種魚進(jìn)行群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的報(bào)道。為了進(jìn)行比較研究， 本研究分別利用8個(gè)GSSR和8個(gè)EST-SSR標(biāo)記對(duì)6個(gè)鯽野生群體間進(jìn)行貝葉斯分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖 2、圖 3)， 基于ESTSSR與G-SSR標(biāo)記的UPGMA聚類分析和貝葉斯分析結(jié)果相似， 兩類SSR標(biāo)記揭示了相似的鯽群體遺傳結(jié)構(gòu)和分化格局。此結(jié)果與丁西朋等[54]研究GSSR和EST-SSR標(biāo)記在柱花草(Stylosanthes)種間的遺傳差異研究結(jié)果相同； 孔令鋒等[55]基于G-SSR和EST-SSR標(biāo)記研究野生和養(yǎng)殖的太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)遺傳多樣性時(shí)， 2種標(biāo)記的聚類分析結(jié)果不一致； 這有可能是太平洋牡蠣中的養(yǎng)殖群體經(jīng)歷近交、選擇和遺傳漂變[56]而導(dǎo)致群體多樣性下降， 無(wú)效等位基因的存在以及稀有等位基因流失等原因造成的。

3.3 鯽野生群體G-SSR和EST-SSR多態(tài)性比較

SSR的核心序列重復(fù)單位以2個(gè)核苷酸為主，少數(shù)為3個(gè)核苷酸的重復(fù)， 極少數(shù)重復(fù)單位為4個(gè)或更多個(gè)核苷酸[35]。本研究所使用的G-SSR標(biāo)記核心序列是三或四堿基重復(fù)， EST-SSR標(biāo)記中只有1個(gè)為四堿基重復(fù)， 其余7個(gè)均為兩堿基重復(fù)。動(dòng)植物微衛(wèi)星標(biāo)記的研究表明: 在一般情況下G-SSR標(biāo)記的多態(tài)性要明顯高于EST-SSR標(biāo)記[57]， 在小麥(Triticum aestivum)[58，59]和太平洋牡蠣[55]的遺傳多樣性研究中均是如此。其原因主要是因?yàn)镚SSR標(biāo)記主要來(lái)源于基因組的非編碼區(qū)段， 而ESTSSR標(biāo)記則是來(lái)源于編碼區(qū)內(nèi)或靠近編碼區(qū)[60]。在物種進(jìn)化歷程中， 位于編碼區(qū)的EST-SSR標(biāo)記相對(duì)穩(wěn)定、突變幾率小[61]。本研究結(jié)果中G-SSR標(biāo)記的平均PIC僅略高于EST-SSR標(biāo)記的平均PIC(表3)， 這可能是由于以二堿基為主的8個(gè)EST-SSR標(biāo)記平均重復(fù)單元次數(shù)為13.5， 而以三、四堿基為主的8個(gè)G-SSR標(biāo)記平均重復(fù)單元次數(shù)為18， 重復(fù)單元為兩堿基的微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的突變率， 其次為三堿基和四堿基以及復(fù)合型重復(fù)類型的微衛(wèi)星標(biāo)記[62]。

EST-SSR標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)在于其作為基因的一部分而擁有特殊功能的等位基因[63]， 其側(cè)翼序列在物種之間高度保守， 相對(duì)于基因組來(lái)源的SSR標(biāo)記，EST-SSR在物種之間有較好的通用性[64]； ESTSSR標(biāo)記具有突變率低且較穩(wěn)定的特點(diǎn)還可被用于重建較為久遠(yuǎn)的進(jìn)化事件[60]； 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展， 越來(lái)越多EST-SSR標(biāo)記將會(huì)被發(fā)掘和利用[65]。因此， 研究EST-SSR標(biāo)記與功能基因的相關(guān)性， 不僅可以檢測(cè)近緣物種該功能基因的多態(tài)性， 還可以構(gòu)建魚類的遺傳進(jìn)化史。多態(tài)性較低是EST-SSR標(biāo)記的特性之一。本研究根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)的GCE359微衛(wèi)星標(biāo)記是一個(gè)重復(fù)單元為四堿基、重復(fù)次數(shù)多達(dá)31次、呈現(xiàn)較高水平多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記， 這表明提高EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性還是有跡可循的。可能提高EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性的方法包括: (1)選擇EST-SSR標(biāo)記時(shí)， 盡量靠近3′或5′端非翻編譯區(qū)段， 因?yàn)榛谶@些區(qū)域的位點(diǎn)變異性可能較高[65]； (2)改進(jìn)分析手段(例如等位基因分型采用DNA測(cè)序儀分析技術(shù))； (3)盡可能利用3個(gè)或4個(gè)以上核苷酸重復(fù)以及重復(fù)次數(shù)高的位點(diǎn)， 可有效提高EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性。

本研究通過(guò)對(duì)6個(gè)鯽群體的遺傳分析， 發(fā)現(xiàn)鯽野生群體整體上具有較高的遺傳多樣性， 但黑龍江2個(gè)群體遺傳多樣性明顯低于其他水系； 由于地理隔離， 來(lái)自黑龍江水系的鯽野生群體遺傳結(jié)構(gòu)與其余群體(長(zhǎng)江、淮河、奉化江)分化顯著。另一方面， 盡管EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性略低于G-SSR標(biāo)記，但這兩類SSR標(biāo)記揭示了相似的鯽群體遺傳結(jié)構(gòu)和分化格局。EST-SSR標(biāo)記反映了基因轉(zhuǎn)錄部分的遺傳多態(tài)性， 通常代表著某種基因功能的變化，因此若將其與之相關(guān)的功能聯(lián)系起來(lái)， 將會(huì)在轉(zhuǎn)錄組圖譜的繪制、功能基因的發(fā)掘和利用領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。本文的這些研究結(jié)果將為鯽種質(zhì)資源的保護(hù)和利用以及評(píng)價(jià)EST-SSR標(biāo)記在魚類群體遺傳學(xué)研究中的價(jià)值提供新的參考信息。

致謝:

感謝本實(shí)驗(yàn)室的馮秀、劉海洋、王新華、劉雪麗、周穎等以及中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所李新輝研究員實(shí)驗(yàn)室為鯽樣本采集和分子遺傳分析提供的幫助。

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