β1-腎上腺素受體自身抗體通過促進肝細胞凋亡參與小鼠肝損傷

于海存，杜蕓輝，張詩晗，閆 莉，李玉明

(1.首都醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 生理學與病理生理學系， 北京 100069; 2.首都醫(yī)科大學附屬安貞醫(yī)院北京心肺血管疾病研究所，北京 100029；3.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院生理與病理生理學系，北京 100005；4.首都醫(yī)科大學 燕京醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系， 北京 101300)

慢性肝損傷是全球范圍內高致病率、高病死率的肝臟疾病，發(fā)病原因主要包括病毒感染、酒精性或非酒精性肝臟疾病、脂質代謝異常、 藥物損傷及自身免疫性疾病[1]等，其中交感神經系統(tǒng)的過度激活在肝損傷過程中發(fā)揮的作用越來越引起人們的關注[2]。已有的研究發(fā)現，在小鼠肝纖維化過程中有β1-腎上腺素受體(β1-AR)的過度表達，而給予β腎上腺素受體阻滯劑可以明顯改善肝臟纖維化，這提示β1-AR的過度激活參與了肝損傷的發(fā)生發(fā)展。近年來發(fā)現一種針對于β1-腎上腺素受體細胞外第二環(huán)(β1-AR-ECII)的自身抗體(β1-AA)，其廣泛存在于擴張性心肌病、心律失常等心血管疾病中，可以通過持續(xù)激活β1-AR而發(fā)揮正性肌力、正性傳導和升高細胞內鈣離子的受體激動劑樣作用。已知肝細胞表面有β1-AR的表達[3]，那么循環(huán)血液中的β1-AA是否會通過作用于肝臟表面的β1-AR而對肝臟產生影響尚不得而知。

因此，本研究的目的主要是探討β1-AA對肝臟結構和功能的影響及作用機制，為臨床β1-AA陽性患者肝功能損傷的治療提供新的思路和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性BALB/c小鼠，8周齡，體質量(20±2)g[首都醫(yī)科大學動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001]；15只SPF級SD大鼠的乳鼠，0～3 d (北京維通利華實驗動物技術有限公司)；正常肝細胞系QSG7701細胞(中國醫(yī)學科學院基礎研究所細胞中心)。

1.1.2 主要試劑：具有活性的單克隆抗體β1-AA[4]、胰蛋白酶1∶250 (trypsin powder，porcine 1∶250，Sigma-Aldrich公司)；Ⅱ型膠原酶(coll-agenase type 2，Worthington公司)；Tunel染色試劑盒(Roche公司)；annexin V/PI凋亡試劑盒(Invitrogen公司)；caspase 3活性檢測試劑盒(Biomol公司)；美托洛爾(metoprolol tar-trate，Abcam公司)；2,2-azino-di (3-ethylbenzothiazoline) sulphonic acid (ABTS)-H2O2(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：以5 μg/g的β1-AA進行小鼠腹腔注射，每2 周給藥1次，連續(xù)給藥20 周，同期設置IgG陰性對照組。采用本實驗室改良的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)動態(tài)監(jiān)測血清中1-AA的含量[5]。

1.2.2 乳鼠心肌細胞跳動頻率的檢測：將提取的心肌細胞[6]接種于96孔板，培養(yǎng)2～3 d，實驗分組為陰性IgG組、β1-AA組(10-7mol/L)、β1-AA(10-7mol/L)+ β1-AR阻斷劑metoprolol組(3×10-7mol/L)和單獨的metoprolol組(3×10-7mol/L)；加入阻斷劑1 h后再加入β1-AA作用48 h，顯微鏡下每組觀察7～8個培養(yǎng)孔，每個培養(yǎng)孔隨機計數5～8個視野，每個視野每次計數30 s，最后計數分離的單個細胞1 min內同步收縮的次數，驗證β1-AA的生物活性。

1.2.3 BALB/c小鼠血清中AST、ALT、GLB和ALB(谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、球蛋白和白蛋白)水平的檢測：通過鼠尾靜脈采血收集正常對照組和β1-AA被動免疫組小鼠4、8和12周的血清，委托北京北方生物技術研究所用速率法檢測血清中AST、ALT、GLB和ALB的濃度。

1.2.4 小鼠肝臟門靜脈流速、肝靜脈流速和肝臟直徑的檢測：將對照組和β1-AA被動免疫組小鼠在0、8周時，分別仰臥固定，于1.5%體積濃度的異氟烷吸入麻醉下，剪去腹部鼠毛后涂以耦合劑，用高頻線陣探頭 (75 MHz)探測肝臟大小、回聲狀況、肝靜脈和門靜脈血管內徑，所有數據均測量3次并取其平均值。

1.2.5 Tunel染色檢測肝細胞凋亡：肝組織用10%甲醛固定，分級乙醇(85%、95%和100%)脫水。在二甲苯中滲透后，石蠟包埋。將石蠟塊切成4 μm切片，按試劑盒說明書所述進行Tunel染色，每張載玻片選取5～8個視野，計算凋亡細胞核的百分比,評估細胞凋亡指數。

1.2.6 AnnexinV/PI檢測肝細胞凋亡：將QSG7701細胞以(1～5)×105/孔接種到6孔板，過夜，分別設置陰性IgG組(10-7mol/L)、β1-AA組(10-7mol/L)和β1-AA+metoprolol(3×10-7mol/L)組，作用24 h，根據說明書進行操作，利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.7 肝細胞caspase 3活性的檢測：將QSG7701細胞以1×105/孔接種到12孔板，待其增殖良好，分別設置陰性IgG組(10-7mol/L)、不同濃度的β1-AA組(10-6、10-7和10-8mol/L)及β1-AA+metoprolol(3×10-7mol/L)組，作用24 h，按照說明書進行操作，最后利用熒光酶標儀檢測熒光度值(Ex: 400 nm，Em 508 nm)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 成功制備β1-AA單克隆抗體，并建立β1-AA被動免疫小鼠模型

β1-AA與IgG具有相同的蛋白條帶，重鏈分子質量55 ku，輕鏈25 ku(圖1A)；該單克隆抗體可以增加乳鼠心肌細胞跳動頻率(P<0.01)，β1腎上腺素受體阻滯劑metoprolol可以部分逆轉這一效應(圖1B)；在β1-AA被動免疫小鼠第4 周，外周血清β1-AA濃度明顯上升(P<0.05)，隨后，被動免疫組小鼠血清中β1-AA濃度相對于正常對照組都明顯升高，提示被動免疫小鼠模型建立成功(圖1C)。

2.2 β1-AA長期被動免疫導致小鼠肝損傷

β1-AA免疫組小鼠血清中ALT、AST在被動免疫第8 周時明顯升高(P<0.05)，ALB下降(P<0.01)(圖2)。

2.3 β1-AA長期被動免疫致小鼠肝臟門靜脈流速和肝靜脈流速降低

β1-AA長期被動免疫小鼠第8 周時，肝靜脈血流速(HPV)和門靜脈流速(MPV)明顯降低(表1)。

2.4 β1-AA長期被動免疫過程中小鼠肝細胞發(fā)生凋亡

β1-AA免疫第8 周肝組織凋亡的肝細胞核百分比為8.00%±0.02%，顯著高于對照組的2.30%±0.03%(圖3)。

2.5 β1-AA通過β1-腎上腺素受體促進肝細胞系QSG7701發(fā)生凋亡

Annexin V/PI染色發(fā)現β1-AA(10-7mol/L)可以促進正常肝細胞系QSG7701發(fā)生凋亡，當給予β1腎上腺素受體阻滯劑metoprolol(3×10-7mol/L)后，可以逆轉這一效應(P<0.05)(圖4A)，但并不能完全逆轉；caspase 3活性檢測發(fā)現，不同濃度的β1-AA(10-6、10-7及10-8mol/L) 促進肝細胞caspase 3活性增加，而β1-AR特異性阻斷劑metoprolol可以部分逆轉此效應(圖4B)。

A.β1-AA had the same molecule mass as commercial mice IgG tested by Coomassie brilliant blue staining; B.β1-AA that was synthesised had the biological activity; C.the serum value of β1-AA in the passive immunization model was higher than the negative IgG group;*P<0.05，**P<0.01 compared with IgG group

圖1具有生物活性的β1-AA單克隆抗體及β1-AA被動免疫模型小鼠的鑒定
Fig1Identificationofthebiologicallyactiveofβ1-AAandpassiveimmunizationmicemodel

*P<0.05, **P<0.01 compared with IgG group圖2 β1-AA被動免疫小鼠過程中肝臟生化學指標的變化Fig 2 Changes of biochemical indexes in liver during the β1-AA passive n=6)

groupHPV/(mm/s)MPV/(mm/s)hepatictransfer/mmIgG 24.5±2.3 70.0±1.820.0±0.9β1-AA 19.3±1.3* 8.0±2.1**21.0±1.3

HPV.hepatic vein velocity; MPV.portal vein velocity;**P<0.05,*P<0.01 compared with IgG group.

3 討論

已知β1-AA最早是在擴張性心肌病患者體內發(fā)現的，可以結合β1腎上腺素受體細胞外第二環(huán)而致受體持續(xù)激活，是一種潛在的損傷因子。β1-AA作為機體免疫系統(tǒng)的產物，它可以促進小鼠源性巨噬細胞系RAW264.7細胞分泌TNFα[7]， 而β1-AR的激動劑異丙腎上腺素(ISO)可以抑制LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNFα[8]。 提示，β1-AA可能與β1-AR激動劑效應不同。同時，有文獻報道β1-AA可以通過作用于T淋巴細胞增加胰島素抵抗，進而影響血糖水平[9]。這進一步說明β1-AA和機體的免疫系統(tǒng)密不可分。肝臟是機體免疫反應系統(tǒng)的重要器官之一，β1-AA在導致心功能下降的同時，它對肝功能的影響是怎樣的目前并不清楚。本研究發(fā)現，β1-AA可能通過作用于肝細胞表面的β1-AR導致肝細胞凋亡，進而引起肝功能受損。

為了明確β1-AA對肝臟的影響，本研究首先構建了一種針對β1-AR細胞外第二環(huán)，并且與患者血清中的β1-AA具有相同生物學效應的單克隆抗體，即β1-AA，排除了其他非特異性抗體的干擾。另外，采用β1-AA長期被動免疫小鼠模型能夠更好的模擬臨床疾病，并且有效的排除了抗原肽段的影響。

本研究連續(xù)選取β1-AA被動免疫小鼠0、4、8和12周為監(jiān)測點， 動態(tài)觀察了小鼠肝功能的變化。

圖3 β1-AA被動免疫過程中小鼠肝細胞的變化Fig 3 Hepatocytes changes during the β1-AA passive immunization

血清ALT水平和AST水平常被用作臨床試驗肝功能的生物學標志物[10]。當肝臟長期受損時，ALB合成降低[11]。在本研究中，初步得到在被動免疫小鼠第8 周時ALT、AST明顯升高，ALB明顯下降。提示，β1-AA長期作用會導致肝損傷。肝臟超聲結果提示，在β1-AA長期作用下肝靜脈和門靜脈流速明顯下降，而肝臟大小尚無出現明顯的變化。肝組織切片、Annexin V/PI染色和肝細胞caspase 3活性檢測進一步驗證了β1-AA對肝細胞的直接損傷作用，而β1-腎上腺素受體阻滯劑可以部分逆轉這一效應，提示β1-AA可能通過β1-腎上腺素受體途徑引起肝細胞凋亡，但并不能排除還有其他作用途徑存在，比如非β1-腎上腺素受體途徑。本研究初步闡明了β1-AA在導致心功能損傷的同時可能通過肝細胞表面的β1-AR致肝細胞凋亡，進而導致肝功能下降，為臨床肝損傷發(fā)生發(fā)展的機制研究提供新的思路和實驗基礎。

A.the apoptosis of hepatocytes induced by β1-AA; B.the caspase- 3 relative activity of hepatocytes induced by different ooncentrative of β1-AA;*P<0.05,**P<0.01 compared with IgG group;#P<0.05 compared with 10-7β1-AA group;##P<0.01 compared with β1-AA group

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