雷公藤紅素對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響

柳笑彥

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

巨噬細胞對外源刺激具有很強的表型可塑性和異質(zhì)性。根據(jù)表型可將巨噬細胞分為經(jīng)典激活的M1型(促炎)和選擇性激活的M2型(抗炎)。其表型變化是多種炎性反應性疾病發(fā)生、 發(fā)展和終止的調(diào)節(jié)因子。而炎性反應和代謝紊亂密切相關。因此， 調(diào)節(jié)巨噬細胞的表型為治療慢性炎性反應代謝性疾病提供了廣闊的前景[1- 3]。

雷公藤紅素(celastrol, Cel)，是一種天然三萜類化合物，是從中國傳統(tǒng)藥用植物雷公藤根皮中分離出的一種活性成分，在各種實驗模型中都表現(xiàn)出了有效的抗感染活性[4- 5]。雷公藤紅素對飲食誘導肥胖的小鼠脂肪和肝臟組織中M1/M2巨噬細胞極化分型有影響[6]，但其對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響尚不清晰。

本研究以小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，探討雷公藤紅素對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和Trizol試劑(Gibco公司)；IFN-γ、LPS、雷公藤紅素和牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司)；實時定量PCR試劑盒(Promega公司)；流式抗體APC anti-mouse F4/80、流式抗體PE anti-mouse CD11c、流式抗體APC anti-mouse CD206和流式試劑盒(BioLegend公司)；硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Merck公司)。

1.1.2 動物：6周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g[中國食品藥品檢定研究院，許可證號SCXK(京)2014- 0013]。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)及分組處理：腹腔灌肉湯法(刺激法)分離出小鼠腹腔巨噬細胞。將細胞進行如下分組并給予相應藥物處理：對照組(con，不作任何處理)、單純雷公藤紅素干預組(Cel，給予雷公藤紅素0.1 μmol/L)、經(jīng)典激活M1組(IFN-γ+LPS，給予IFN-γ 20 μg/L和LPS 100 μg/L共同作用)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel，先給予IFN-γ 20 μg/L和LPS 100 μg/L共同作用，12 h后，再給予雷公藤紅素0.1 μmol/L作用)。無血清饑餓24 h后收樣進行后續(xù)實驗。

1.2.2 實時定量PCR檢測Arg- 1、iNOS、CD11c、CD206的mRNA表達水平：用Trizol提取細胞總RNA，測定濃度及純度后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄并按實時定量PCR試劑盒說明配制PCR反應體系、運行反應程序。以β-actin為內(nèi)參分析，所使用引物(表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.3 流式細胞儀檢測M1、M2巨噬細胞相關標志物CD11c、CD206：實驗設置組別：A1：對照組(Con)、單純雷公藤紅素干預組(Cel)、經(jīng)典激活M1組(IFN-γ+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel) 4組細胞混合的對照(blank)。B1～B4：對照組(Con)、單純雷公藤紅素干預組(Cel)、經(jīng)典激活M1組(IFN-γ+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel)4組細胞的F4/80和CD11c雙染。C1～C4：對照組(Con)、單純雷公藤紅素干預組(Cel)、經(jīng)典激活M1組(IFN-γ+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-γ+LPS+Cel)4組細胞的CD11c和CD206雙染。取6孔板細胞置于冰上，用含1% BSA的PBS洗兩遍，每孔1 mL胰蛋白酶消化。5 min后每孔加等量的DMEM培養(yǎng)基終止消化，將細胞收集至相應已標記好的1.5 mL離心管中，1 000×g5 min離心，棄上清。每管沉淀用含1% BSA的PBS 1 mL溶解，吹打混勻，1 000×g5 min離心，棄上清。棄上清后每管約有100 μL的液體殘留，按實驗設置組別混好細胞，在殘留的含1% BSA的PBS細胞懸液里直接添加流式抗體：B1～B4組每管添加APC anti-mouse F4/80抗體和PE anti-mouse CD11c抗體各1 μL；C1～C4組每管添加PE anti-mouse CD11c抗體和APC anti-mouse CD206抗體各1μL。避光冰上孵育15～20 min。再用含1% BSA的PBS 1 000×g5 min洗兩遍，每管細胞用500 μL含1% BSA的PBS重懸，流式上機檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組Arg- 1、CD206、iNOS及CD11c的mRNA表達水平變化

各組Arg- 1、CD206、iNOS和CD11c的mRNA表達水平變化(圖1)。

單純雷公藤紅素干預組Arg- 1 mRNA表達水平有升高趨勢；經(jīng)典激活M1組Arg- 1 mRNA表達水平有降低趨勢(圖1A)。加入雷公藤紅素后，M1型巨噬細胞的Arg- 1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(圖1A)。

經(jīng)典激活M1組CD206 mRNA表達水平有降低趨勢；經(jīng)雷公藤紅素干預后，M1型巨噬細胞的CD206 mRNA表達水平有升高趨勢(圖1B)。相較于經(jīng)典激活M1組，單純雷公藤紅素干預組的巨噬細胞CD206 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(圖1B)。

單純雷公藤紅素干預組iNOS mRNA表達水平有非常顯著的降低(P<0.01)；經(jīng)典激活M1組的iNOS mRNA表達水平則有非常顯著的升高(P<0.01)(圖1C)。加入雷公藤紅素后，M1型巨噬細胞的iNOS mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；相較于經(jīng)典激活M1組，單純雷公藤紅素干預組的iNOS mRNA表達水平也有非常顯著的降低(P<0.01)(圖1C)。

A.Arg- 1 expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; B.CD206 expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; C.iNOS expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; D.CD11c expressional level of control, Cel group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with IFN-γ+LPS group

單純雷公藤紅素干預組CD11c mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)(圖1D)。

2.2 各組F4/80+CD11c+ 細胞比例

雷公藤紅素能使M1型巨噬細胞比例降低(X軸為APC標記的F4/80，代表泛巨噬細胞；Y軸為PE標記的CD11c，代表M1型巨噬細胞)(圖2)。

2.3 各組CD11c+CD206- 細胞比例

雷公藤紅素能使M1型巨噬細胞比例降低；M2型巨噬細胞比例太低，無法染上(X軸為APC標記的CD206，代表M2型巨噬細胞；Y軸為PE標記的CD11c，代表M1型巨噬細胞)(圖3)。

3 討論

近年來，肥胖等代謝綜合征和與肥胖相關的代謝性疾病在全球范圍內(nèi)日益增加，已經(jīng)成為嚴重影響人們健康、經(jīng)濟和生活的主要問題[7]。慢性低度炎性反應與肥胖和代謝綜合征有關，在代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。巨噬細胞炎性浸潤就是代謝性疾病炎性反應環(huán)境的特點之一[8]。經(jīng)典激活的巨噬細胞(M1)促進脂肪組織炎性反應和胰島素抵抗，而選擇性激活的巨噬細胞(M2)阻止肥胖和胰島素抵抗[9]。在這種情況下，調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，改變M1/M2巨噬細胞的比例，為肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病的治療提供了新的靶點和思路。本研究顯示，雷公藤紅素能抑制小鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化。

中藥活性成分和分子靶點的鑒定是現(xiàn)代藥理學的巨大機遇。雷公藤紅素就是這樣一種最初從中藥中鑒別出來的化合物。它是一種三萜甲基化合物，是存在于雷公藤根提取物的藥理活性成分，已被證明具有抗炎作用，一般用于治療炎性反應和自身免疫性疾病。雷公藤紅素因其潛在的抗炎和抗癌活性而引起了極大的關注，被認為是從傳統(tǒng)中藥的植物提取物中分離出來的最有前途的藥物分子[10]。雷公藤紅素在單核細胞、巨噬細胞、白細胞中等能夠抑制脂多糖、干擾素c、雙鏈RNA誘導的炎性反應的各種介質(zhì)[11]。但其對促炎的M1型巨噬細胞和抗炎的M2型巨噬細胞極化分型的影響尚不清晰。在本研究中，雷公藤紅素能促使M1型巨噬細胞相應標志物CD11c、iNOS表達減少，能使M2型巨噬細胞相應標志物Arg- 1表達增加，表明雷公藤紅素能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，改變M1/M2巨噬細胞的比例以發(fā)揮抗炎作用。

A.proportion of F4/80+CD11c+cells of control group; B.proportion of F4/80+CD11c+cells of Cel group; C.proportion of F4/80+CD11c+cells of IFN-γ+LPS group; D.proportion of F4/80+CD11c+cells of IFN-γ+LPS+Cel group

圖2對照、Cel、IFN-γ+LPS和IFN-γ+LPS+Cel各組F4/80+CD11c+細胞比例的比較
Fig2ComparisonofproportionofF4/80+CD11c+cellsofcontrol,Cel,IFN-γ+LPSandIFN-γ+LPS+Celgroup

A.proportion of CD11c+CD206-cells of control group; B.proportion of CD11c+CD206-cells of Cel group; C.proportion of CD11c+CD206-cells of IFN-γ+LPS group; D.proportion of CD11c+CD206-cells of IFN-γ+LPS+Cel group

圖3對照組、Cel、IFN-γ+LPS和IFN-γ+LPS+Cel各組CD11c+CD206-細胞比例的比較
Fig3ComparisonofproportionofCD11c+CD206-cellsofcontrol,Cel,IFN-γ+LPSandIFN-γ+LPS+Celgroup

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