血管生成素樣蛋白8基因罕見(jiàn)突變與嚴(yán)重高三酰甘油血癥

楊 頌，楊云云，焦曉璐，朱苗苗，李 娟，秦彥文

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 北京市心肺血管疾病研究所， 北京 100029)

高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)在中國(guó)患病率高達(dá)13.1%，嚴(yán)重HTG是高三酰甘油血癥相關(guān)性急性胰腺炎發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。如果能夠發(fā)現(xiàn)HTG的病因，并進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)降低急性胰腺炎的發(fā)病具有重要意義。HTG的發(fā)病受遺傳因素影響，嚴(yán)重HTG是由單基因突變所致[2]。

近年研究表明血管生成素樣蛋白 8(angiopoietin-like protein 8，ANGPTL8)參與三酰甘油(triglyceride, TG)代謝[3]：ANGPTL8 重組蛋白刺激3T3-L1細(xì)胞，促進(jìn)TG在細(xì)胞內(nèi)聚積[4]；ANGPTL8-/-小鼠血漿ANGPTL8濃度減低，餐后TG水平降低[3]； 全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)研究發(fā)現(xiàn)，白種人和黑種人中ANGPTL8罕見(jiàn)突變使血清 TG水平下降 15%[5]，而ANGPTL8罕見(jiàn)突變?cè)谥袊?guó)人群中尚缺乏研究。

目前，目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序技術(shù)已成功地應(yīng)用于檢測(cè)血脂異常[6- 7]。本研究對(duì)嚴(yán)重HTG患者進(jìn)行目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序，篩選與TG相關(guān)的ANGPTL8突變。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取 2016-2017年就診于北京安貞醫(yī)院且臨床診斷為嚴(yán)重HTG血癥的患者43例。所有患者簽署知情同意書(shū)。詳細(xì)記錄患者年齡、民族、性別、質(zhì)量、籍貫、血壓、吸煙、身高和飲酒等情況；采集血脂、血糖、肝腎功能和血常規(guī)等多項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，仔細(xì)詢問(wèn)心血管疾病、肝腎疾病等疾病病史以及家族史等情況。所有研究對(duì)象均為漢族。本研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

嚴(yán)重HTG血癥患者的入選標(biāo)準(zhǔn)[8]：TG>10.0 mmol/L。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除肝、腎功能障礙、血糖及血鈣代謝等異常，排除骨髓瘤、柯興氏綜合征、胰腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)或減低、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和垂體機(jī)能減退癥等導(dǎo)致繼發(fā)性血脂異常的疾病，排除使用降脂藥物者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序：基因組 DNA 的提?。撼槿⑴c者外周靜脈血2～3 mL，放入EDTA抗凝試管，暫時(shí)4℃保存。分離外周血白細(xì)胞，1.5 mL離心管中存放，然后-80 ℃保存。采用血液樣本DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作提取外周血基因組DNA，采用Qubit?2.0(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行DNA定量。設(shè)計(jì)相關(guān)基因多重引物對(duì)(panel)：在線設(shè)計(jì)包含9個(gè)已知HTG相關(guān)基因的多重引物對(duì)(https://www.ampliseq.com)，包括基因的外顯子區(qū)和非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，多重引物對(duì)包括已知的促進(jìn)血管內(nèi)脂肪分解的基因LPL、APOA5、APOA4、APOC3、APOC2、APOE；以及本研究觀察的具有抑制脂肪分解作用的血管生成素樣蛋白家族基因ANGPTL3、ANGPTL4和ANGPTL8，覆蓋率為99%。對(duì)于總膽固醇水平大于7.8 mmol/L或者低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平大于4.9 mmol/L的嚴(yán)重HTG患者進(jìn)行家族性高膽固醇血癥相關(guān)基因篩查，以排除膽固醇相關(guān)基因的干擾。同樣在線設(shè)計(jì)包含4個(gè)已知膽固醇相關(guān)基因(LDLR、APOB、PCSK9、ABCA1)的多重引物對(duì)，包括基因的外顯子區(qū)和UTR區(qū)。DNA文庫(kù)構(gòu)建和富集：采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0- 96LV (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific公司)、10 ng基因組DNA，Ion XpressTMBarcode Adapters kit、Ion AmpliSeqTMCustom and Community DNA Panels、Agencourt?AMPure? XP Kit，按照說(shuō)明進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，構(gòu)建基因cDNA文庫(kù)；擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用Ion PGMTM Hi-QTM OT2 Kit、Dynabeads? MyOneTMStreptavidin C1、Ion 318 Chip Kit 進(jìn)行富集。目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序：采用Ion PGM HI-Q Seq Kit、Ion PGM Wash 2 Bottle Kit在 Ion PGM測(cè)序儀上進(jìn)行二代測(cè)序。在運(yùn)行結(jié)束時(shí)，采用Ion Torrent Suite 5.0.2 version對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步注釋。采用人類基因組(hg19)為映射參考基因，校準(zhǔn)結(jié)果與BAM格式文件(SAM的壓縮形式)結(jié)合。突變檢測(cè)及注釋：檢測(cè)到的突變采用Ion Reporter (version5.0)進(jìn)行注釋，每個(gè)突變包括突變頻率注釋(ExAc、ESP6500、G1000、中國(guó)人數(shù)據(jù)庫(kù)等)及功能預(yù)測(cè)注釋(sift、ppt- 2、Mutation Taster)。

1.2.2 生物信息學(xué)分析：測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后，將得到的樣本突變信息與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)、外顯子組測(cè)序項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(kù) (ESP6500)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(1 000 g)及本地人群數(shù)據(jù)庫(kù)(Inhouse) 進(jìn)行比對(duì)分析。去掉同義突變，去掉在1 000 g、ESP6500 和Inhouse 數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)頻率大于1%的突變；對(duì)于HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中明確報(bào)道過(guò)的突變位點(diǎn)：對(duì)比 HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)中與樣本遺傳疾病相關(guān)的突變熱點(diǎn)，分析已報(bào)道位點(diǎn)的疾病臨床癥狀與樣本臨床癥狀是否一致，如果一致則可以考慮該突變?yōu)橹虏⊥蛔?；?duì)于不攜帶已知致病突變的患者：根據(jù)sift、ppt- 2、Mutation Taster功能預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出氨基酸改變?yōu)闊o(wú)義突變(stop gain)、移碼突變(frame shift)、前接突變(splicing)、終止密碼子丟失(stop loss)、錯(cuò)義突變(missense)等對(duì)蛋白功能影響比較大的突變位點(diǎn)；結(jié)合基因與疾病的關(guān)聯(lián)信息和樣本的臨床信息，篩選樣本的可疑致病基因突變。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序多重引物對(duì)

設(shè)計(jì)了TG代謝相關(guān)基因多重引物對(duì)(表1)，包含9個(gè)基因，覆蓋外顯子區(qū)和UTR區(qū)，每個(gè)外顯子堿基的平均測(cè)序深度在100×，覆蓋度為99.7%。

表1 測(cè)序基因列表Table 1 List of genes to be sequenced

2.2 嚴(yán)重HTG患者臨床特征

43例嚴(yán)重HTG的臨床特征見(jiàn)表2，嚴(yán)重HTG患者的TG、總膽固醇水平顯著升高，高密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低。4例患者有急性胰腺炎病史。

2.3 嚴(yán)重HTG患者的罕見(jiàn)突變

通過(guò)目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序，在43例嚴(yán)重HTG患者中，共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)已知的致病突變或可疑致病突變(表3)，其中位于LPL和APOA5的3個(gè)錯(cuò)義突變(p.E269K, p.D48V, p.G185C)是在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的已知致病突變； 位于基因LPL3′UTR區(qū)的突變、APOA4的缺失突變(p.D335fs)、APOE的錯(cuò)義突變(p.E189K)和ANGPTL8 5′UTR區(qū)的突變經(jīng)過(guò)功能預(yù)測(cè)可能為致病的有害新突變。在本研究患者中APOC3/C2、ANGPTL3/4均未發(fā)現(xiàn)可疑基因突變。43例嚴(yán)重HTG患者中，有33例患者攜帶有已知致病突變或可疑致病突變，10例患者未發(fā)現(xiàn)致病和可疑致病的突變，這說(shuō)明仍有未知基因突變影響TG水平。

表2 嚴(yán)重HTG患者的臨床特征

TC.total cholesterol; data are presented as mean ± standard deviation or %.

2.4 ANGPTL8突變引起三酰甘油和膽固醇的改變

在7個(gè)突變中，LPL、APOA5/A4/C3/A1基因簇、APOE突變主要影響TG，而攜帶有ANGPTL8突變的患者不僅表現(xiàn)為TG水平升高(TG=18.1 mmol/L)，總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平也發(fā)生了顯著改變(TC=9.03 mmol/L,HDL-C=0.68 mmol/L)，對(duì)該患者進(jìn)行了已知膽固醇相關(guān)基因(LDLR、APOB、PCSK9、ABCA1)突變的篩查，未發(fā)現(xiàn)攜帶有膽固醇相關(guān)基因已知突變，推測(cè)ANGPTL8突變可能同時(shí)影響TG和膽固醇水平，有待于進(jìn)一步研究。

表3 嚴(yán)重HTG患者中的致病和可疑致病突變Table 3 Pathogenic and probably pathogenic mutations identified in patients with extreme TG

Nuc.nulceotide; SIFT.sorting intolerant from tolerant; ppt- 2.PolyPhen2; DM.disease-causing mutation in HGMD; DFP.disease-associated functional polymorphism in HGMD.

3 討論

通過(guò)對(duì)43例嚴(yán)重HTG血癥患者進(jìn)行目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序， 篩查出3個(gè)已報(bào)道的致病突變(p.E269K,p.D48V, p.G185C)和4個(gè)新的基因突變：位于LPL 3′UTR區(qū)的突變、APOA4的缺失突變(p.D335fs)、APOE的錯(cuò)義突變(p.E189K)和ANGPTL8 5′UTR區(qū)的突變。其中位于ANGPTL8的突變?cè)谌祟愡z傳突變相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中都未曾報(bào)道，為了進(jìn)一步確定該突變是罕見(jiàn)突變，本研究對(duì)149例非高三酰甘油血癥人群進(jìn)行目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)該突變，說(shuō)明該突變?cè)谥袊?guó)人群中屬罕見(jiàn)突變，低頻率攜帶率多提示為可疑突變，由于缺乏功能驗(yàn)證，其致病性有待進(jìn)一步證實(shí)，但該突變是首次發(fā)現(xiàn)的與血脂相關(guān)的ANGPTL8罕見(jiàn)可疑致病突變。

嚴(yán)重HTG主要是單基因突變，常見(jiàn)的原因是LPL突變導(dǎo)致LPL缺乏[9]。另外，APOC2突變也可以影響LPL的激活，從而導(dǎo)致TG蓄積[10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL8與該家族成員ANGPTL3、ANGPTL4的N端有同源性，通過(guò)ANGPTL3、ANGPTL4協(xié)同作用調(diào)控脂代謝[11]，研究[12]已證實(shí)ANGPTL3發(fā)生突變可導(dǎo)致血漿中LDL-C和TG水平下降， 可能通過(guò)調(diào)節(jié)LPL、肝酯酶(hepatic lipase，HL)和內(nèi)皮酯酶(endothelial lipase，EL)的活性參與血脂的調(diào)節(jié)。ANGPTL4敲除小鼠[13]可導(dǎo)致循環(huán)中TG水平的降低，過(guò)表達(dá)該基因則導(dǎo)致血漿中TG水平升高。ANGPTL4通過(guò)抑制LPL和EL的活性，降低循環(huán)中TG的清除率。本研究中發(fā)現(xiàn)的ANGPTL8罕見(jiàn)突變同時(shí)影響TG和總膽固醇，可能是由于該突變同時(shí)影響了相關(guān)酶的活性和功能，進(jìn)而影響到脂質(zhì)代謝。

近年來(lái)，汽車車內(nèi)污染越來(lái)越引起重視。如果國(guó)家相關(guān)政策更完善，汽車制造企業(yè)更自律，駕乘人員方式更健康，將會(huì)使汽車內(nèi)污染更少，從而保護(hù)駕乘人員身心健康。

本研究有一定局限性：目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序無(wú)法檢測(cè)大片段缺失；新的可疑致病突變需要擴(kuò)大人群驗(yàn)證并需要進(jìn)一步功能驗(yàn)證；另有10例患者未篩查出致病突變，雖然排除了繼發(fā)性高脂血癥進(jìn)行基因突變篩查，但仍可能存在其他未知的繼發(fā)因素，同時(shí)也可能是由于設(shè)計(jì)的多重引物對(duì)中未涉及的基因突變導(dǎo)致。

通過(guò)對(duì)嚴(yán)重HTG患者進(jìn)行目標(biāo)基因靶向捕獲測(cè)序，發(fā)現(xiàn)TG代謝已知基因的新突變，并發(fā)現(xiàn)ANGPTL8新的罕見(jiàn)突變，擴(kuò)大了TG代謝的基因譜，為ANGPTL8與脂質(zhì)代謝的研究奠定理論基礎(chǔ)。

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