FOXK1通過(guò)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移研究

盧洪勝，於櫻枝，牟櫻紅，潘黎明，曹學(xué)全，包衛(wèi)光，章輝

叉頭框（FOX）基因家族為一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，共包含43個(gè)成員。FOX基因家族1類(lèi)包括FOXA.G、I-L及Q亞家族，其在碳端有一個(gè)基本結(jié)構(gòu)域；而FOXH及FOXM-P則歸屬于FOX基因家族2類(lèi)。本研究的研究對(duì)象為FOX基因家族中的一員－FOXKl，其編碼的蛋白與鼠肌細(xì)胞核因子（MNF）/FOXKl有高度的同源性。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指具有極性的上皮細(xì)胞在一定的生理或病理情況下向具有移行能力的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的過(guò)程?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT時(shí)E-鈣黏素蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少，而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，如波形蛋白（Vimentin）等蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞黏附能力下降，遷移能力增加，更易于侵襲轉(zhuǎn)移[1-2]。本研究應(yīng)用組織芯片及免疫組化技術(shù)檢測(cè)胃癌組織FOXKl及EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的表達(dá)情況，探討其在胃癌中的表達(dá)意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院2013年1月至2017年7月胃癌手術(shù)患者88例，其中男58例，女30例；平均年齡（66.26±12.35）歲，≤60歲26例，＞60歲62例；腫瘤直徑≤5cm60例，＞5cm 28例。根據(jù)胃癌的不同分化程度和不同分期程度：高分化9例，中分化30例，低分化49例；T分期，T1期9例，T2期12例，T3期2例，T4期65例；N分期，N0期19例，N1期14例，N2期21例，N3期34例；TNM分期，Ⅰ期為10例，Ⅱ期25例，Ⅲ期52例，Ⅳ期1例。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片 采用自主研發(fā)的一次成型組織芯片制作技術(shù)制作芯片蠟塊。先對(duì)供體蠟塊進(jìn)行切片并HE染色，顯微鏡下定位，再在供體蠟塊對(duì)應(yīng)位置獲取組織芯，然后將獲得的組織芯按相對(duì)正常組織、癌灶組織配對(duì)依次排入銅質(zhì)模具的7×9陣列孔內(nèi)。每例設(shè)兩個(gè)重復(fù)點(diǎn)，放入65℃烤箱內(nèi)烤約10min（蠟芯表面微融化），取出后馬上注入65℃的包埋石蠟，然后取出墊片均勻用力按下陣列孔銅板將組織芯頂起。之后，在承蠟槽上放入包埋盒并加滿石蠟，最后將模具放入4℃冰箱或冷空調(diào)口快速冷卻，冷卻后即可取出組織芯片蠟塊。以4m厚度連續(xù)切片，敷貼于專(zhuān)用防脫載玻片上。

1.2.2 免疫組化 所用標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋組織，經(jīng)制作芯片后依次切片，其中常規(guī)HE染色1張，免疫組化切片3張，采用EnVision二步法。所用試劑FOXKl抗兔多克隆抗體，購(gòu)自中山公司，抗體濃度為1∶200，E-cadherin、Vimentin為單克隆抗體，購(gòu)自福建邁新公司，抗體濃度均為1∶100。

1.2.3 結(jié)果判讀 染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行半定量分析，F(xiàn)OXKl以細(xì)胞核中見(jiàn)到棕黃色顆粒分布為陽(yáng)性，E-cadherin、Vimentin分別以細(xì)胞膜和漿中見(jiàn)到棕黃色顆粒分布為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)為：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)視野計(jì)數(shù)100細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%為0分，5%～25%記為1分，25%～75%為2分，75%為3分。染色強(qiáng)度分值和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值相乘即為每張染色切片的最終得分，0～1分判為陰性，2～4分低表達(dá)組，6～9分為高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXK1在胃癌組織及正常對(duì)照中標(biāo)記結(jié)果比較 FOXK1在胃癌組織中表達(dá)為96.59%（85/88）（封二彩圖4～5），在正常胃黏膜中表達(dá)為7.95%（7/88），胃癌組織中FOXK1表達(dá)顯著高于正常胃黏膜（x2=138.56，P ＜ 0.01）。

2.2 FOXK1與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 FOXK1蛋白表達(dá)量在胃癌分化程度、腫瘤T分期、腫瘤N分期、腫瘤TNM分期中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

2.3 FOXK1與EMT標(biāo)記物E-cadherin、Vimentin的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)OXK1與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.21，P＜ 0.05），與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.63，P＜ 0.05）。

3 討論

表1 FOXK1表達(dá)與胃癌臨床病理因素及E-cadherin、Vimentin的關(guān)系

圖4 組織芯片顯示高分化胃癌HE染色（HE，×100）

圖5 組織芯片顯示FOXK1在中分化胃癌表達(dá)（En Vision法，×50）

胃癌是我國(guó)第二大高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率為679.1/10萬(wàn)人年，僅次于肺癌，且預(yù)后差，死亡率高[3]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多方面因素綜合影響下的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活及眾多分子水平上的改變。近年來(lái)，隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，早期胃癌患者5年生存率已顯著提高，但伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者預(yù)后仍然沒(méi)有明顯改善，成為死亡率高的重要原因。由此可見(jiàn)，胃癌進(jìn)展已經(jīng)成為影響胃癌患者的療效及獲得長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵問(wèn)題。

FOX基因參與腫瘤多種惡性生物學(xué)表型的調(diào)控，F(xiàn)OXK1為其中一員，屬于轉(zhuǎn)錄因子。近年來(lái)陸續(xù)有研究報(bào)道，Okada等[4]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1通過(guò)誘導(dǎo)VEGF生成，進(jìn)一步促使胃癌中血管形成而至進(jìn)展；Wang等[5]研究表明，F(xiàn)OXK1和FOXK2通過(guò)Wnt/-catenin信號(hào)系統(tǒng)將DVL轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，導(dǎo)致腫瘤惡性程度增加；Xie等[6]發(fā)現(xiàn)FOXK1在RUFY3過(guò)表達(dá)細(xì)胞株里逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程，表明RUFY3-FOXK1軸在腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)FOXK1在胃癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常胃黏膜，且分化程度越低，以及T分期、N分期、TNM分期越高，F(xiàn)OXK1蛋白表達(dá)量越高，這表明FOXK1介導(dǎo)了胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。對(duì)于FOXK1介導(dǎo)的機(jī)制也做了初步探究和分析，由于EMT過(guò)程伴隨著E-cadherin蛋白表達(dá)量減低及 Vimentin表達(dá)的增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移[7]。筆者進(jìn)一步做FOXK1與EMT相關(guān)性研究，結(jié)果為FOXK1高表達(dá)顯示上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin表達(dá)上升，表明FOXK1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的EMT，引起胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

終上所述，F(xiàn)OXK1檢測(cè)有助于評(píng)估胃癌的生物學(xué)行為和預(yù)后，初步表明通過(guò)介導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，但需要進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

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[5]Wang W,Li X,Lee M,et al.FOXKs promote Wnt/-catenin signaling by translocating DVL into the nucleus[J].DevCell,2015,32(6):707-718.

[6]Xie R,Wang J,Liu X,et al.RUFY3 interaction with FOXK1 pro motes invasion and metastasis in colorectal cancer[J].Sci Rep,2017,7(1):3709.

[7]He C,Wang Z,Zhang L,et al.A hydrophobic residue in the TALE homeodomain of PBX1 promotes epithelial-to-mesenchymal transition of gastric carcinoma[J].Oncotarget,2017,8(29):46818-46833.