巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在多發(fā)性肌炎/皮肌炎患者中的意義

王 艷，張亞妹，王維偉，尹利國(guó)，彭清林，王國(guó)春△，有 軍

(1.北京中日友好醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100029；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730； 3.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200135)

特發(fā)性炎性肌病(IIM)是一種以全身橫紋肌慢性、非化膿性炎性病變?yōu)橹饕卣鞯娜硇约膊?，易合并肺間質(zhì)病變、心臟病變、惡性腫瘤等疾病。皮肌炎(DM)和多發(fā)性肌炎(PM)是其常見(jiàn)的兩種亞型。多項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究證實(shí)IIM的患者合并腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，為3%～40%[1]，尤其見(jiàn)于DM患者,其合并腫瘤的發(fā)生率可為健康人群的10倍[2]。腫瘤可先于、同時(shí)或后于DM發(fā)生,絕大部分的腫瘤發(fā)生于DM診斷的前后3年。DM合并腫瘤患者因?qū)に刂委煵幻舾?，病情不易控制，?dǎo)致長(zhǎng)期生存率不高。因此，早期積極治療DM合并腫瘤患者，對(duì)改善預(yù)后有重要意義。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是由免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子，可抑制巨噬細(xì)胞的自由移動(dòng)，具有多效炎性介質(zhì)功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，MIF與多種疾病尤其是腫瘤的病程進(jìn)展、預(yù)后情況關(guān)系密切。本研究擬采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)觀察血清中MIF在PM/DM患者中的表達(dá)情況，并分析MIF與PM/DM患者臨床特征、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 DM 125例，PM 10例，共計(jì)135例患者納入PM/DM組，其中女性101例，男性34例,年齡20～83歲，平均(51.6±9.2)歲；其中DM包括經(jīng)典DM 99例,DM合并腫瘤34例，無(wú)肌病性DM(CADM)5例。30例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者，30例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者，15例原發(fā)性干燥綜合征(pSS)患者，共計(jì)75例患者納入其他自身免疫病組。同期健康體檢者64例納入健康對(duì)照組，其中男13例，女51例，年齡18～71歲，平均(45.4±14.0)歲。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad (iMark)酶標(biāo)儀。血清MIF的測(cè)定使用美國(guó)RayBio?Human MIF ELISA試劑盒。

1.3檢測(cè)方法 采集所有研究對(duì)象血清標(biāo)本，用Eppendorf管分裝后，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱待測(cè)。采用ELISA法分別檢測(cè)血清MIF、抗轉(zhuǎn)錄中介因子(TIF)-1γ抗體：(1)把包被好特異性抗體的96微孔試劑盒放置至室溫。重組抗原按倍比稀釋方法進(jìn)行稀釋，加入100 μL作為標(biāo)準(zhǔn)品。(2)待測(cè)血清按比例1∶6稀釋，分別加入反應(yīng)孔，4 ℃振蕩孵育過(guò)夜。(3)倒掉微量孔內(nèi)液體，清洗液沖洗4次，加入100 μL生物素標(biāo)記的二抗,室溫震蕩孵育2 h。(4)棄去微量孔內(nèi)液體，清洗液沖洗4次加入100 μL Streptavidin solution，室溫震蕩孵育45 min。(5)棄去微量孔內(nèi)液體，清洗液沖洗4次加入100 μL TMB顯色劑，室溫下震蕩孵育30 min。(6)加人50 μL的反應(yīng)中止液(1 mol/L硫酸)中止反應(yīng)，立即于450 nm 處測(cè)光吸收度(A)，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔A值。標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)血清均做雙孔取平均A值。研究中T淋巴細(xì)胞及其亞類采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)水平采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.4疾病評(píng)分 在收集每位入組患者血清標(biāo)本的同時(shí)，進(jìn)行肌炎活動(dòng)評(píng)估視覺(jué)模擬(MYOACT)評(píng)分：包括疾病活動(dòng)度、皮膚評(píng)分、消化道、骨骼肌等評(píng)分，每項(xiàng)為1～5分，最后計(jì)算總分即為MYOACT評(píng)分值。

2 結(jié) 果

2.1PM/DM組患者的基本臨床特征分析 PM/DM組患者病程為0.3～180.0月，平均25.8月；血清肌酸激酶(CK)水平為14.0～17 724.0 IU/L，平均876.9 IU/L，患者其他的基本臨床特征見(jiàn)表1。

表1 PM/DM組患者的基本臨床特征分析[n(%)，n=135)]

2.2各組的血清MIF水平比較 PM/DM組、健康對(duì)照組的血清MIF水平分別為11 622.43(2 216.00～95 968.00)、1 472.67(805.25～1 940.25)pg/mL，PM/DM組明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。RA、SLE、pSS患者中，血清MIF分別為13 686(10 142～17 486)、4 408(3 133～5 208)、24 251(19 807～29 604)pg/mL,與健康對(duì)照組相比，MIF值也均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3PM/DM患者血清MIF水平與臨床特征的相關(guān)性 PM/DM組135例患者血清MIF水平與疾病持續(xù)時(shí)間呈弱負(fù)相關(guān)(r=-0.289,P<0.05)。PM/DM“早期階段”(≤6個(gè)月)患者[(1 027.73±89.23)pg/mL]血清MIF水平低于“進(jìn)展階段”(>6個(gè)月)患者[(2 217±48.65)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

有吞咽困難PM/DM患者血清MIF水平明顯高于無(wú)吞咽困難的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)抗羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)抗體陽(yáng)性的患者血清MIF水平高于抗HMGCR抗體陰性的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床特征PM/DM患者血清MIF水平比較[M(P25～P75)，pg/mL]

2.4血清MIF水平與PM/DM患者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)之間的關(guān)系 血清MIF水平與血清IgM(r=0.182,P=0.05)、IgG (r=0.208,P=0.025) 呈弱相關(guān)，與B2淋巴細(xì)胞百分比(r=0.255,P=0.014)、血細(xì)胞沉降率(ESR)(r=0.231,P=0.011)呈弱正相關(guān)，與T抑制性淋巴細(xì)胞(r=-0.190,P=0.048)、T淋巴細(xì)胞總數(shù)(r=-0.244,P=0.011)呈弱負(fù)相關(guān)。ALT、AST、LDH水平也與MIF呈弱相關(guān)。

2.5血清MIF與DM合并腫瘤 DM合并腫瘤患者腺癌發(fā)生率高于實(shí)體瘤，腺癌中乳腺癌的比例最多(30%)?；颊咂骄〕虨?23.7±46.6)月。DM合并腫瘤患者血清MIF水平高于單純DM患者(P=0.006)。以6、24月為截點(diǎn)分別分析DM合并腫瘤患者治療前后血清MIF變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外發(fā)現(xiàn)DM合并腫瘤中，抗TIF-1γ抗體陽(yáng)性組的MIF水平明顯高于抗體陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)，見(jiàn)圖1。

由健康對(duì)照組血清MIF A(平均A值+4倍標(biāo)準(zhǔn)差)，計(jì)算得出其cut-off值為4 913.87 pg/mL。MIF陽(yáng)性(高于cut-off值)DM合并腫瘤的發(fā)生率為25.6%,MIF陰性(低于cut-off值)為8.6%(P=0.045)。

MIF診斷DM合并腫瘤的靈敏度和特異度分別為94.1%(32/34)、23.1%(21/91)，抗TIF-1γ抗體診斷DM合并腫瘤的靈敏度和特異度分別為68.9%(20/29)、87.9%(80/91)。

圖1 DM合并腫瘤患者特征

2.6血清MIF與PM/DM患者臨床疾病活動(dòng)度的關(guān)系 進(jìn)一步研究了血清MIF水平是否與IIM疾病活動(dòng)度相關(guān)。評(píng)估根據(jù)血清采樣時(shí)MYOACT分?jǐn)?shù)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)血清MIF水平和MYOACT分?jǐn)?shù)之間存在顯著相關(guān)(r=0.202,P=0.225) 。

3 討 論

DM基本病理改變是肌纖維變性和(或)壞死、肌細(xì)胞再生、肌萎及特異性抗體的產(chǎn)生，有大量活化的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞浸潤(rùn)[3]。PM無(wú)明顯皮膚損傷。臨床上均表現(xiàn)為對(duì)稱性進(jìn)行性近端肌力減退，出現(xiàn)多種內(nèi)臟器官受累，對(duì)患者的生存能力、心理、精神等方面有明顯影響。更重要的是，IIM尤其是DM易合并ILD、心臟病變、惡性腫瘤等疾病，極大地影響了患者的生存率。

MIF由單核/巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等非免疫細(xì)胞合成,可抑制巨噬細(xì)胞的自由移動(dòng)，使其在炎性反應(yīng)中呈定向移動(dòng)。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MIF具有多種炎性介質(zhì)功能：促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，形成正性反饋環(huán)路；促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附，促進(jìn)炎性部位對(duì)白細(xì)胞的招募；促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)，維持炎性反應(yīng)。本研究使用ELISA法，首次系統(tǒng)分析了PM/DM患者血清MIF水平與臨床特征的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)DM、PM患者的血清MIF水平明顯高于健康對(duì)照組，SLE、RA、pSS患者與健康對(duì)照者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與之前研究基本一致[4]，進(jìn)一步說(shuō)明了MIF在自身免疫疾病發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展中的作用。

此次研究發(fā)現(xiàn)MIF水平與外周淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱相關(guān)。既往研究顯示,在PM/DM患者中外周血T細(xì)胞的比例低于健康對(duì)照組，即CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)量低于健康對(duì)照組；B細(xì)胞數(shù)量與其他疾病對(duì)照組、健康組相比明顯下降[5-6]。筆者推測(cè)，MIF的分泌并不依賴外周血T、B細(xì)胞,肌肉組織中的骨骼肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞,可能有助于升高血清MIF。但在IIM中血清MIF的確切來(lái)源仍然需要探索。

本研究還發(fā)現(xiàn),IIM早期血清MIF水平明顯低于進(jìn)展期，但與IIM的病程持續(xù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。其原理尚不清楚，可能由于在疾病的不同階段，MIF介導(dǎo)了不同的免疫通路所導(dǎo)致。且MIF在疾病進(jìn)展階段比早期階段發(fā)揮更重要的作用。

吞咽困難是IIM一種難治性并發(fā)癥，缺乏明確的血清生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn) 吞咽困難IIM患者M(jìn)IF水平明顯高于無(wú)吞咽困難患者，并且抗HMGCR抗體陽(yáng)性的患者血清MIF水平高于抗HMGCR抗體陰性的患者?？笻MGCR抗體與嚴(yán)重的壞死性肌病緊密相關(guān)，并且此抗體陽(yáng)性會(huì)增加患吞咽困難的風(fēng)險(xiǎn)[7]。本次研究結(jié)果提示,升高的血清MIF可能被作為除了抗HMGCR抗體之外的吞咽困難的標(biāo)記，但具體關(guān)聯(lián)機(jī)制仍有待研究。

另外值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)合并腫瘤的PM/DM患者血清MIF水平高于未合并腫瘤的患者，尤其是在DM中發(fā)生腫瘤患者M(jìn)IF水平明顯高于未發(fā)生腫瘤者。MIF高于cut-off值的DM患者合并腫瘤的發(fā)生率明顯高于MIF低于cut-off值合并腫瘤患者。MIF參與腫瘤的發(fā)病機(jī)制，與疾病的病程進(jìn)展、預(yù)后情況關(guān)系密切。口腔鱗狀細(xì)胞癌中，MIF升高與腫瘤的惡性程度、侵襲和浸潤(rùn)的深度呈正相關(guān)[8]；在黑色素瘤中，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中的MIF比原位性黑色素瘤高，并且在轉(zhuǎn)移性腫瘤中，根據(jù)MIF水平進(jìn)行四分位分組計(jì)算，MIF高的患者的生存時(shí)間更短，疾病進(jìn)展更快[9]。

本研究納入的DM合并腫瘤中腺癌發(fā)生率高于實(shí)體瘤，腺癌中乳腺癌的比例最多(30%)，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道DM/PM伴發(fā)腫瘤常見(jiàn)類型為卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和非霍奇金氏淋巴瘤等一致。但不同于白種人伴發(fā)腫瘤的類型沒(méi)有特殊傾向性，亞洲人群中最常見(jiàn)的伴發(fā)腫瘤類型是鼻咽癌[10]。值得注意的是，抗TIF-1γ抗體陽(yáng)性的DM合并腫瘤患者M(jìn)IF水平高于此抗體陰性患者。血清抗TIF-1γ抗體可作為DM合并腫瘤的敏感而特異的血清學(xué)指標(biāo)，以往多項(xiàng)研究證實(shí)其可用于早期診斷DM合并腫瘤[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，MIF診斷DM合并腫瘤的靈敏度、特異度分別為94.1%、23.1%，抗TIF-1γ抗體診斷DM合并腫瘤的靈敏度、特異度分別為68.9%、87.9%。因此，將這2種抗體聯(lián)合分析在提高診斷靈敏度的同時(shí)能保證一定的特異度，可作為早期診斷DM合并腫瘤靈敏而又特異的指標(biāo)。

本研究未發(fā)現(xiàn)血清MIF水平和MYOACT分?jǐn)?shù)之間存在相關(guān)性。有報(bào)道稱RA患者血清MIF和血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平呈負(fù)相關(guān)，與DAS28評(píng)分無(wú)相關(guān)性[12]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在我國(guó)PM/DM患者人群中血清MIF水平升高，血清MIF可作為DM/PM疾病活動(dòng)標(biāo)志。它還可同抗TIF-1γ抗體聯(lián)合用于早期診斷DM合并腫瘤。但MIF在DM合并腫瘤的發(fā)病機(jī)制中的作用及確切的預(yù)測(cè)價(jià)值，仍有待進(jìn)一步探討。

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