牛奇異變形桿菌的分離鑒定及16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

曾邦權(quán) 段博芳 鄭歡莉 張應(yīng)國 周建國 趙煥云岳 亮 戴玲玲 張文東

（1.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650201；2.澄江縣畜禽改良站，云南澄江 652599；3.云南省農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201）

奇異變形桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬，兼性厭氧，革蘭氏陰性，具運動性，是人和動物的寄生菌和病原菌，廣泛存在于動物糞便、污水和土壤中，是常見的條件致病菌。該菌能夠引起人的原發(fā)性和繼發(fā)性感染，是泌尿系感染常見病原菌，僅次于大腸埃希氏菌，還可引起呼吸道、傷口、燒傷創(chuàng)面、腦膜炎、腹膜炎和食物中毒等疾病，也可引起豬、奶牛、山羊、雞、鴿等家畜禽以及麋鹿、獼猴、小熊貓、樹鼩、鱉、蛇等動物感染。該菌可由自身免疫力下降而引起內(nèi)源性感染，也可由被污染的食物、工具、創(chuàng)傷等引起外源性的感染。近些年P(guān)M感染人和動物的案例不斷被報道，引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，特別是對PM的侵襲性相關(guān)毒力基因和耐藥相關(guān)基因的研究。由于PM廣泛存在，生長條件要求不高，易引起人畜感染，部分菌株存在耐藥性，對人的健康和畜禽養(yǎng)殖有較大危害，因此對PM的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

2017年6月某肉牛場有部分?jǐn)嗄虪倥Ｏ嗬^發(fā)病，出現(xiàn)零星死亡，癥狀以腹瀉為主，病牛消瘦，食欲廢絕，糞便稀稠，后肢糞污嚴(yán)重，部分病牛有單肢或多肢關(guān)節(jié)腫脹，病牛呆立不動或臥地不起，最終衰竭死亡。剖解可見腹腔積液，肝臟腫大，脾臟腫大，腸系膜淋巴結(jié)嚴(yán)重腫大有出血點，腸道黏膜有出血斑，腎臟腫大，腎臟乳頭、腎盂出血，膀胱黏膜有出血點。為了解此次疫病的主要病因，對病死牛采集病料進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

病死犢牛肝、腎等病變組織及關(guān)節(jié)液等。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、SS瓊脂平板、細(xì)菌生化微量鑒定管、藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；5 %綿羊鮮血瓊脂平板購自昆明中云美生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒購于Tiangen公司；一步法RT-PCR試劑盒、pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司，大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

1.3 實驗動物

昆明系小白鼠成鼠，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.4 細(xì)菌分離和染色

病料接種鮮血瓊脂平板表面，37℃恒溫培養(yǎng)24h，挑取可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板，進(jìn)行純化培養(yǎng)，純培菌革蘭氏染色觀察；純化菌落分別接種于麥康凱平板、SS平板，觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)、特征等。

1.5 生化鑒定

接種環(huán)挑取純化菌落分別接種到微量生化管，37℃培養(yǎng)24～72h，觀察記錄結(jié)果。結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）對照，進(jìn)行鑒定。

1.6 致病性試驗

將20只昆明系成年小白鼠隨機(jī)分為2組，一組為試驗組、另一組為對照組。37℃培養(yǎng)18h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液20ml，離心收集菌體，用滅菌生理鹽水重懸，棄上清，如此2次，測定細(xì)菌含量備用。試驗組每只接種生理鹽水菌液0.5ml，對照組每只接種0.5ml的細(xì)菌生理鹽水；接種后每天觀察小白鼠發(fā)病、死亡情況并做好記錄。及時解剖觀察發(fā)病死亡小鼠，再從發(fā)病死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.7 藥敏試驗

采用藥敏片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）對分離到的菌株進(jìn)行試驗，取培養(yǎng)18h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液500ul均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，將藥敏片貼于表面，37℃恒溫培養(yǎng)12～18h后測量抑菌圈直徑，依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.8 16S rRNA的擴(kuò)增及序列測定

取營養(yǎng)肉湯菌液，離心收集菌體，采用Trizol法抽提細(xì)菌的RNA。參考已報道的細(xì)菌16SrRNA通用引物序列，上游引物F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1429R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。

50ul反應(yīng)體系：滅菌ddH2O 24.5uL，1step Buffer 20uL，primeScript 1 step Enzyme Mix 1.5μl，上、下游引物各1μl，模板DNA 2uL。反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，54℃退火90s，72℃延伸2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker 2000為對照，出現(xiàn)目的條帶者進(jìn)行電泳純化，膠回收按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。

回收的目的片段與pMD-18T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp法篩選陽性克隆，提取Amp陽性菌DNA進(jìn)行PCR鑒定。將篩選到的陽性克隆菌送上海生工測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及染色

37℃培養(yǎng)24h，可見菌落呈灰白色，扁平圓形，中心隆起，邊緣毛糙，有強(qiáng)烈臭味，且可見菌落擴(kuò)散，覆蓋整個培養(yǎng)基表面；挑取單個菌落點種于營養(yǎng)瓊脂上，以點種處為圓心，呈波浪逐圈生長，至長滿平板。在血瓊脂平板、麥康凱平板上呈無色菌落。SS培養(yǎng)基上形成透明、黃色、中間黑色的菌落。革蘭氏染色鏡檢為陰性，呈桿狀，多數(shù)單個存在，部分成對和短鏈排列，分離菌株KMD3疑似奇異變形桿菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果

結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對比，分離株KMD3生化結(jié)果與奇異變形桿菌一致（表1）。

表1 分離菌株生化試驗結(jié)果

2.3 致病性試驗

試驗組接種細(xì)菌生理鹽水濃度為6×108cfu/ml，接種后小白鼠顫抖、打堆、腹瀉，解剖可見肝、脾腫大，腎臟、膀胱有出血，消化道出血明顯，在接種后20h開始出現(xiàn)死亡，至72h全部死亡，并從死亡小鼠分離到接種菌。對照組的小白鼠未出現(xiàn)死亡。

2.4 藥敏試驗

本菌主要對阿米卡星（丁胺卡那霉素）、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、呋喃唑酮（痢特靈）、多粘菌素、阿莫西林敏感；諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢吡肟中度敏感；對頭孢類大部分抗生素、磺胺類、四環(huán)素類、林可胺類及氯霉素、紅霉素等耐藥（表2）。

圖1 16SrRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

2.5 PCR擴(kuò)增及陽性克隆鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增出 1 500 bp左右的特異性條帶（圖1）。陽性克隆提取DNA，經(jīng)PCR鑒定，擴(kuò)增出1500bp左右的特異性條帶（圖2）。

2.6 測定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

目的片段雙向測序，得到KMD3 16S rRNA基因片段。經(jīng)Blast比對分離株KMD3與GenBank中公布的PM菌株的16S rRNA序列高度同源，其同源性達(dá)99%，選取不同宿主的13個代表菌株與KMD3構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。KMD3與13株代表菌株及普通變形桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明：KMD3菌株與13個代表菌株處于同一分支，并且與鼠源（HQ169118.1）、牛源（JQ975907.1）、山羊源（KP401767.1）等位于更進(jìn)一級分支，與普通變形桿菌分屬兩個小分支，與大腸桿菌和沙門氏菌分屬兩個不同的大分支。KMD3與13株代表菌株及普通變形桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌進(jìn)行核苷酸相似性分析，結(jié)果顯示：KMD3與13個代表菌株同源性介于99.5%～100%，與鼠源（HQ169118.1）、牛源（JQ975907.1）、山羊源（KP401767.1）同源性高達(dá)100%，與普通變形桿菌（DQ885262.1）同源性為99.0%，與大腸桿菌、沙門氏菌同源性分別為91.9%、92.2%，進(jìn)而從分子層面證明了KMD3是奇異變形桿菌（圖3）。

圖2 陽性克隆PCR鑒定結(jié)果

圖3 分離株KMD3 16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

此次事件中發(fā)病動物均為斷奶犢牛，調(diào)查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場將斷奶犢牛集中飼養(yǎng)，補飼全株青綠玉米，收割時恰逢雨季，收割后未能及時處理，露天堆集，帶有PM的糞屑、塵土可能污染了玉米株，加之天氣陰冷、斷奶，對犢牛應(yīng)激較大，飼喂該批青玉米株后2天開始有犢牛出現(xiàn)腹瀉，癥狀與牛病毒性腹瀉、魏氏梭菌、沙門氏菌等感染類似，但排除了相關(guān)疾病，通過對分離菌的菌落特征、生長特性、鏡檢、生化特征的觀察，初步將KMD3判定為奇異變形桿菌。

CaiHY等認(rèn)為，16S rRNA基因序列已成為一個分子指標(biāo)，可以廣泛地用于各種微生物的遺傳特征和分子差異的研究，目前該技術(shù)已應(yīng)用于海洋、湖泊和土壤、大氣微生物菌群和病原微生物等環(huán)境微生物多樣性的分析。KMD3與其余不同來源PM均處于同一分支，同源性較高，說明不同宿主來源的PM遺傳變異程度較小。

KMD3菌株表現(xiàn)了較強(qiáng)的致病性，然而傳統(tǒng)觀念通常認(rèn)為PM是條件性致病菌，往往忽略了PM對人和動物的致病性，已有多篇報道證實奇異變形桿菌引起人、多種野生動物及家養(yǎng)動物的發(fā)病，特別是在集中飼養(yǎng)的條件下。由于該菌可以產(chǎn)生溶血素、溶蛋白酶、尿素酶等，導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重?fù)p傷，增加了臨床治療的難度，如果與大腸桿菌、沙門氏菌或部分病毒混合感染會增大疫病的嚴(yán)重程度。

KMD3菌株對氨基糖苷類抗生素敏感，對喹諾酮類抗生素中度敏感，對頭孢類、復(fù)合磺胺類藥物耐藥，因而阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素等可以用于疫病的早期治療。目前已有關(guān)于PM耐藥的報道，馮福英等對院內(nèi)感染的臨床樣本中分離到的20株奇異變形桿菌進(jìn)行了耐藥基因和整合子分布的研究，證實了分離菌株存在或部分存在超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs）TX-M-14型基因和頭孢菌素（AmpC）酶CMY-2型基因，潘玉善等[20]也通過對21株禽源PM的研究證實了部分菌株攜帶有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因。因此對動物PM耐藥性開展持續(xù)監(jiān)測是有必要的，可避免動物PM耐藥譜擴(kuò)大，防止公共衛(wèi)生事件發(fā)生，具有重要的實際意義。