慢性腎病患者外周血T淋巴細胞及NK細胞中TIGIT的表達和意義*

陳 微,聶倩武,郝俊峰,肖 亮,付 勇,楊軍平△

1.江西中醫(yī)藥大學研究生院,江西南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科,江西南昌 330006;3.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院針灸科,江西南昌 330006

慢性腎病(CKD)是指存在腎臟結構或功能異常,持續(xù)時間超過3個月,并且表現(xiàn)為進行性或不可逆的腎損傷[1]。許多CKD最終的共同病理表現(xiàn)是腎臟纖維化,并且逐漸發(fā)展為慢性腎衰竭。CKD發(fā)展到終末期的患者需要進行腎臟替代治療,生活質量降低。CKD給患者和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。CKD發(fā)展的過程中,由于存在毒素的潴留、代謝紊亂、炎癥和氧化應激、礦物質-骨代謝紊亂等情況,患者體內同時存在免疫應激與免疫功能缺陷,導致機體的免疫功能失調[2]。既往的研究表明CKD患者的免疫失調主要表現(xiàn)為細胞免疫功能失調,以免疫細胞數(shù)量減少和產生細胞因子的能力降低為特征[3]。T淋巴細胞是調節(jié)細胞免疫的關鍵細胞,它的改變會影響細胞免疫功能。有免疫缺陷的CKD患者中,T淋巴細胞介導的免疫反應出現(xiàn)異常,CKD患者的T淋巴細胞不僅功能低下,其數(shù)量通常也是異常減少的[4]。此外,終末期CRF患者中存在T淋巴細胞功能障礙,例如CD4+T淋巴細胞亞群中的調節(jié)性T淋巴細胞減少[5-6]。因此,CKD的發(fā)生與進展和免疫功能特別是T淋巴細胞的數(shù)量和功能密切相關。

免疫細胞表面的共刺激分子是免疫系統(tǒng)的重要組成部分,具有調控免疫細胞活化和自身免疫反應的功能[7]。基于T淋巴細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸的抑制性結構域(TIGIT)為共刺激分子,在T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞中高表達,TIGIT的結構由細胞外部分免疫球蛋白樣結構域、跨膜部分1型跨膜結構域及細胞內部分免疫受體蛋白酪氨酸抑制基序3部分組成[8]。YU等[9]于2009年首次報道TIGIT是一種傳遞抑制性信號的受體,TIGIT獨特的調節(jié)功能及同其他免疫抑制性受體的協(xié)同效應能夠抑制免疫反應和免疫細胞的增殖,在多種腫瘤、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都有重要作用[10-11]。但TIGIT作為一種抑制性共刺激分子是否參與CKD的發(fā)病過程和疾病進展還未見報道。因此,本研究對TIGIT在CKD中的表達和意義進行初步探索。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年9月至2021年12月于江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腎病科住院治療的CKD 2～4期患者和同期體檢的健康志愿者納入研究分別作為CKD組和健康對照(HC)組。CKD組有97例患者,其中男55例,女42例;年齡(50.58±12.83)歲;原發(fā)性腎病56例,繼發(fā)性腎病41例(12例為糖尿病腎病,17例為高血壓腎病,12例為其他原因所導致的CKD)。CKD患者的臨床診斷和分期標準參照文獻[12],排除自身免疫性疾病、腫瘤、感染性疾病等其他疾病。根據(jù)分期標準又將CKD組分為3個亞組,其中CKD 2期患者組25例作為G2組,CKD 3期患者組37例作為G3組,CKD 4期患者組35例作為G4組。HC組有23例健康者,其中男12例,女11例;年齡(44.39±10.82)歲;心、肺、肝、腎等重要臟器功能正常,無炎癥或其他免疫性疾病。兩組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05),具有可比性。本研究經(jīng)江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:JZFYKYLL2019001),CKD患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Bricyte E6型流式細胞儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。流式細胞抗體藻紅蛋白標記的TIGIT(PE-TIGIT)抗體、多甲藻葉綠素蛋白標記的CD3(PerCP-CD3)抗體、異硫氰酸熒光素標記的CD4(FITC-CD4)抗體、別藻青蛋白標記的CD8(APC-CD4)抗體、別藻青蛋白標記的CD56(APC-CD56)抗體及相應的同型對照均購自美國Biolegend公司。人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技公司。PBS緩沖液購自北京中杉金橋生物有限公司。P800型全自動生化分析儀購自羅氏公司。

1.3方法

1.3.1標本采集及外周血單個核細胞(PBMC)提取 受試者均禁食10 h左右于清晨使用EDTA抗凝管抽取外周血5 mL,標本采集后在4 h內按照人淋巴細胞分離液說明書提取PBMC,PBMC經(jīng)生理鹽水重懸后調整細胞密度為1.0×106個/mL備用。

1.3.2流式細胞術檢測 流式上樣管分別設置陰性對照管、樣本管,每管各加入PBMC懸液50 μL,然后在1號樣本管和陰性對照管分別加入CD3、CD4、CD8、TIGIT單克隆流式抗體及相應同型對照抗體各5 μL;2號樣本管和陰性對照管分別加入CD3、CD56、TIGIT單克隆流式抗體及相應同型對照抗體各5 μL;充分混勻后室溫避光孵育30 min,最后加入450 mL PBS,室溫避光孵育30 min,上機檢測。

1.3.3流式細胞術圈門策略 對流式細胞術結果進行可視化處理,主要處理步驟有:(1)以前向散射(FSC)為橫坐標、側角散射(SSC)為縱坐標,在流式細胞圖中圈出淋巴細胞群;(2)在圈定的淋巴細胞群中以CD3為橫坐標,分別以CD4、CD8、CD56為縱坐標設門,在淋巴細胞群中分別圈出T淋巴細胞(CD3+)、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞(CD3-CD56+);(3)在圈出的CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞群中以TIGIT為橫坐標,SSC為縱坐標,圈出TIGIT+CD4+T淋巴細胞、TIGIT+CD8+T淋巴細胞、TIGIT+NK細胞,TIGIT的表達水平以各淋巴細胞亞群中TIGIT陽性細胞百分比表示;(4)根據(jù)上述方法計算T淋巴細胞及其亞群占總淋巴細胞的百分比并對細胞進行計數(shù)。

1.3.4相關指標的檢測或計算 血肌酐、尿素氮、尿酸、胱抑素C和C反應蛋白等均采用P800型全自動生化分析儀進行檢測,操作嚴格按照說明書進行,估算的腎小球濾過率(eGFR)計算使用腎病飲食改良公式:eGFR[mL/(min·1.73 m2)]=186×(血肌酐)-1.154×年齡-0.203,若為女性則還要乘以0.742。

2 結 果

2.1HC組與CKD組各淋巴細胞亞群中TIGIT表達水平比較 與HC組比較,CKD組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞中TIGIT表達水平均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 HC組與CKD組TIGIT在各淋巴細胞亞群中的表達水平的比較[M(P25,P75),%]

2.2TIGIT的表達水平與淋巴細胞亞群細胞數(shù)的相關性 CKD組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT表達水平與細胞數(shù)量關系的散點圖,見圖1。Pearson相關性分析顯示,CD4+T淋巴細胞數(shù)與CD4+T淋巴細胞TIGIT表達水平呈負相關(r=-0.377,P<0.001);CD8+T淋巴細胞數(shù)與CD8+T淋巴細胞TIGIT表達水平呈負相關(r=-0.384,P<0.001);NK細胞數(shù)與NK細胞TIGIT表達水平無明顯相關性(r=-0.071,P=0.480)。

圖1 TIGIT表達水平與3個淋巴細胞亞群細胞數(shù)的相關性

2.3CKD組不同淋巴細胞亞群TIGIT表達水平與CKD分期的關系 CKD 2～4期患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT表達水平均有隨CKD分期的增加而升高的趨勢。CD4+T淋巴細胞TIGIT表達水平:G4組高于G3組和G2組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CD8+T淋巴細胞和NK細胞TIGIT表達水平:G4組均高于G2組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注:*表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.4TIGIT表達水平與eGFR及血液生化指標的相關性 CKD組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT表達水平與eGFR及血液生化指標的相關性分析結果見表2。CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT表達水平與eGFR呈負相關(P<0.05),與肌酐、胱抑素C呈正相關(P<0.05),與尿酸、C反應蛋白無明顯相關性(P>0.05),CD4+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT表達水平與尿素氮呈正相關(P<0.05),CD8+T淋巴細胞TIGIT表達水平與尿素氮無明顯相關性(P>0.05)。

表2 各淋巴細胞亞群中TIGIT的表達水平與eGFR及血液生化指標的相關性(r)

3 討 論

盡管CKD的免疫學發(fā)病機制尚不完全清楚,但毋庸置疑的是CKD的發(fā)生、發(fā)展都與免疫系統(tǒng)密不可分,免疫動態(tài)平衡的破壞會通過T淋巴細胞和B淋巴細胞的自身反應導致CKD的發(fā)生,這可能會損害腎臟的不同部位,導致腎小球、腎小管及間質持續(xù)損傷,腎小球硬化的形成及腎纖維化的發(fā)生,腎功能逐漸減退,并最終發(fā)展為終末期腎病。同時,腎臟中存在多種自身免疫性疾病的靶標。一些自身免疫性疾病會導致腎臟的損害,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎、過敏性紫癜性腎炎[13]。T淋巴細胞和NK細胞作為免疫系統(tǒng)重要的組成部分,在CKD的發(fā)病過程中具有重要作用,同時CKD患者隨著病情進展出現(xiàn)T淋巴細胞和NK細胞的功能障礙和數(shù)量減少,這種現(xiàn)象在終末期腎病中變得特別明顯[14]。因此,探討T淋巴細胞和NK細胞在CKD發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用有重要意義。

TIGIT作為一種傳遞抑制性信號的受體,具有向免疫細胞傳導負性信號,抑制免疫細胞活化和分泌細胞因子的作用,與天然免疫細胞(樹突狀細胞、NK細胞)以及適應性免疫細胞(T淋巴細胞)存在密切關系[15]。TIGIT被其配體激活后,在大多數(shù)NK細胞和多種T淋巴細胞亞群中表達,包括記憶和激活的T淋巴細胞、調節(jié)性T淋巴細胞和濾泡T輔助細胞[16-18],并且已被證實能在多種疾病患者的CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞中異常高表達。此外,有研究表明外周血TIGIT+CD4+T淋巴細胞百分比與尿微量清蛋白、尿IgG、尿轉鐵蛋白等腎損傷指標及患者的不良臨床結局密切相關[19]。

為了研究TIGIT表達水平與CKD的關系,本研究采用流式細胞術檢測了97例CKD患者和23例健康者各淋巴細胞亞群的TIGIT表達水平,發(fā)現(xiàn)相較于HC組,CKD組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞的TIGIT表達水平均升高(P<0.05)。這似乎與TIGIT的抑制性免疫調節(jié)作用不符,但實際上并非如此,CKD患者TIGIT表達水平的升高是由于自身免疫應答異常,可能進一步促進B細胞的活化,導致疾病的進一步發(fā)展。ABBAS等[20]發(fā)現(xiàn)TIGIT分子具有直接或間接抑制淋巴細胞活化的作用。本研究結果表明,TIGIT的表達抑制了CD4+和CD8+T淋巴細胞的活化,導致CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)的減少,而NK細胞數(shù)與NK細胞TIGIT的表達水平無明顯相關性。這可能是因為CKD 2～4期患者NK細胞數(shù)量變化受TIGIT表達的影響較小或本研究樣本量較小的緣故。本研究還根據(jù)CKD分期將CKD患者分為G2、G3、G4組,進一步分析了TIGIT的表達水平與CKD分期的關系,并對不同分期患者各淋巴細胞亞群的TIGIT表達水平進行了分析,發(fā)現(xiàn)CKD組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT的表達水平有隨CKD分期的增加而升高的趨勢,表明CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT的表達水平與CKD的嚴重程度有關。本研究還表明CKD 2～4期患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞中TIGIT表達水平與eGFR呈負相關,與肌酐、胱抑素C呈正相關,與尿酸、C反應蛋白無明顯相關性,CD4+T淋巴細胞、NK細胞TIGIT表達水平與尿素氮呈正相關,CD8+T淋巴細胞TIGIT表達水平與尿素氮無明顯相關性,更進一步證實了TIGIT的表達水平與CKD的嚴重程度有關。

綜上所述,CKD患者T淋巴細胞及NK細胞TIGIT的表達水平升高,其表達與CKD分期、淋巴細胞數(shù)減少、eGFR及疾病相關的血液生化指標密切相關。筆者推測,TIGIT參與了CKD的免疫調節(jié),并且有可能成為CKD免疫治療過程中的重要靶點。后續(xù)的研究中需增加腎穿刺病理檢查結果的分析,研究腎組織病變微環(huán)境中TIGIT變化,擴大樣本量或進行動物實驗等繼續(xù)深入研究TIGIT在CKD發(fā)生、發(fā)展中的作用。