直腸癌及癌前病變患者外周血髓源抑制細(xì)胞的表達(dá)及其臨床意義△

張勇超，李潛，謝建國，王家祥，韓廣森，張永磊，張金岱

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1普外科，2超聲科，鄭州 450008

3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科，鄭州 450052

直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)直腸癌是由腺瘤惡變而來，目前人們已廣泛認(rèn)同“腺瘤—腺癌”的演變過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，髓源抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中聚集，抑制機體的腫瘤免疫，在腫瘤的免疫逃逸機制中發(fā)揮重要作用[1-4]。至今為止，國內(nèi)外尚缺乏直腸癌及癌前病變患者M(jìn)DSC的研究報道，本研究以健康體檢者、直腸增生型息肉、直腸絨毛狀腺瘤及直腸癌患者的外周血為樣本，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測MDSC、T淋巴細(xì)胞亞群以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的比例，探討MDSC促進(jìn)“直腸腺瘤—直腸腺癌”演變的免疫機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采用隨機抽樣法，收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科2015年11月至2016年8月收治的155例直腸疾病患者的外周血標(biāo)本。根據(jù)患者腸鏡及病理學(xué)檢查結(jié)果分為3組：直腸增生型息肉組45例，直腸絨毛狀腺瘤組52例，直腸癌組58例。所有患者均有明確的病理診斷，均為首次診斷且未行化療、放療、手術(shù)、靶向治療等抗腫瘤治療，既往均無感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病病史。同時，收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院40例健康體檢者的外周血標(biāo)本，作為健康對照組。

1.2 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司。紅細(xì)胞裂解液、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標(biāo)記的鼠抗人CD3單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白-羰花青-5（P-phycoerythrin-Carbocyanine-5，PE-CY-5）標(biāo)記的鼠抗人CD8單克隆抗體、PE-CY-7標(biāo)記的鼠抗人CD11b單克隆抗體、PE-CY-5標(biāo)記的鼠抗人CD33單克隆抗體、PE-CY-5標(biāo)記的鼠抗人HLA-DR單克隆抗體、人Treg染色試劑盒及IgG同型對照抗體均購自美國BD公司。流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

經(jīng)腸鏡及病理學(xué)檢查后，患者于清晨空腹抽取靜脈血3 ml，肝素抗凝，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

Treg檢測：取靜脈血2 ml，以淋巴細(xì)胞分離液收集單核細(xì)胞，然后取細(xì)胞懸液100 μl（細(xì)胞數(shù)約為1×106個），依據(jù)Treg染色試劑盒說明書的指導(dǎo)步驟進(jìn)行操作，透化緩沖液洗滌后，以適量流式染色緩沖液重懸染色細(xì)胞，行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞檢測：取100 μl靜脈血置于流式管中，加入熒光標(biāo)記抗體CD3-PE、CD4-FITC、CD8-PE-CY-5各2 μl，2～8 ℃孵育30～60 min。加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，以適量流式染色緩沖液重懸染色細(xì)胞，行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

MDSC檢測：取100 μl靜脈血置于流式管中，加入熒光標(biāo)記抗體HLA-DR-PE-CY-5、CD33-PE-CY-5、CD11b-PE-CY-7各2 μl，2～8 ℃孵育30～60 min。加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌后，以適量流式染色緩沖液重懸染色細(xì)胞，行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及Post-hoc檢驗（SNK法），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)分析采用Pearson檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDSC及Treg比例的比較

4組患者M(jìn)DSC及Treg比例比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；直腸癌組MDSC及Treg比例最高，直腸絨毛狀腺瘤組、直腸增生型息肉組及健康對照組依次下降，進(jìn)一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 4組研究對象外周血MDSC、Treg比例的比較（%，±s）

表1 4組研究對象外周血MDSC、Treg比例的比較（%，±s）

注：a與直腸癌組比較，P＜0.05；b與直腸絨毛狀腺瘤組比較，P＜0.05；c與直腸增生型息肉組比較，P＜0.05

MDSC比例Treg比例組別

2.2 不同性別、年齡研究對象MDSC比例的比較

不同性別、年齡患者M(jìn)DSC比例的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。（表2）

表2 不同性別、年齡研究對象的MDSC比例（%，±s）

表2 不同性別、年齡研究對象的MDSC比例（%，±s）

特征性別男女4.13±0.92 4.38±1.15 2.68±0.33 2.79±0.45 1.41±0.12 1.62±0.25 0.86±0.15 0.67±0.08年齡（歲）≤60＞60 4.41±1.22 4.09±0.81 2.54±0.28 2.85±0.56 1.59±0.21 1.48±0.17 0.82±0.13 0.73±0.11直腸癌組（n=58）直腸絨毛狀腺瘤組（n=52）直腸增生型息肉組（n=45）健康對照組（n=40）

2.3 T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較

4組患者CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD8+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，直腸癌組CD8+T淋巴細(xì)胞比例最高，直腸絨毛狀腺瘤組、直腸增生型息肉組及健康對照組依次下降；直腸癌組CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值最低，直腸絨毛狀腺瘤組、直腸增生型息肉組及健康對照組依次升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表3）

2.4 外周血MDSC比例與Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的關(guān)系

Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示，外周血MDSC比例與Treg比例呈正相關(guān)（r=0.887，P﹤0.05），而與CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.793，P﹤0.05）。

表3 4組研究對象T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較（±s）

表3 4組研究對象T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較（±s）

注：a與直腸癌組比較，P＜0.05；b與直腸絨毛狀腺瘤組比較，P＜0.05；c與直腸增生型息肉組比較，P＜0.05

組別CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+

3 討論

MDSC是由粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和處于早期分化階段的髓系前體細(xì)胞組成的異質(zhì)性并具有分化潛能的細(xì)胞群。這些未成熟的髓細(xì)胞，可以通過多種途徑抑制機體的獲得性和天然抗腫瘤免疫，使腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫監(jiān)視和攻擊，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在腫瘤源性因子的誘導(dǎo)下，骨髓中的這些未成熟的前體細(xì)胞可遷移至肝臟、淋巴器官及外周血，并大量擴增、分化、成熟，抑制機體的腫瘤免疫[5]。至今為止尚未確定人類MDSC的分子標(biāo)志，在不同組織來源或同一組織來源、不同部位的腫瘤患者中，MDSC可能不盡相同。HLA-DR-CD33+CD11b+是當(dāng)前研究中報道較多的譜系標(biāo)志[6]。MDSC介導(dǎo)免疫抑制的機制可能為通過產(chǎn)生精氨酸酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶，產(chǎn)生大量的活性氧以及分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等[1]。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)了一類具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞，將其命名為Treg，可抑制自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制其免疫效應(yīng)，維持自身免疫耐受的狀態(tài)。Treg數(shù)量和功能的異常與機體的腫瘤免疫密切相關(guān)。腫瘤患者腫瘤組織以及外周血中Treg比例增加與腫瘤患者免疫功能低下有關(guān)。Treg比例增加時，其免疫抑制功能增強，使機體處于一種高度免疫耐受的狀態(tài)，從而為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了免疫逃逸的環(huán)境。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者中Treg細(xì)胞數(shù)量和比例增多[7]，提示機體正處于潛在的免疫抑制狀態(tài)。外周血中成熟的T淋巴細(xì)胞是機體免疫系統(tǒng)中功能最重要的細(xì)胞群，可分為CD4+和CD8+兩個亞群，在維持機體正常的免疫功能中發(fā)揮重要作用。研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[8]。腫瘤患者的T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生明顯變化，即CD4+T淋巴細(xì)胞減少，而CD8+T淋巴細(xì)胞增加，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值下降；且隨著腫瘤的進(jìn)展，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值進(jìn)一步下降，并可能出現(xiàn)倒置。

直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，早期發(fā)現(xiàn)是提高治愈率和生存率的關(guān)鍵。積極發(fā)現(xiàn)和治療癌前病變，可阻斷癌變進(jìn)程，預(yù)防直腸癌的發(fā)生。許多研究表明，大多數(shù)直腸癌是由腺瘤惡變而來的，即腺瘤—腺癌演變過程。目前已公認(rèn)直腸腺瘤是一種癌前病變，且認(rèn)為腺瘤癌變與腺瘤類型、瘤體大小和組織學(xué)類型有關(guān)。國內(nèi)外尚未有直腸癌及癌前病變患者M(jìn)DSC的研究報道，本研究首次就這一領(lǐng)域進(jìn)行探討。本研究結(jié)果顯示，與健康體檢者相比，直腸增生型息肉、直腸絨毛狀腺瘤、直腸癌患者外周血中MDSC比例均明顯增加；MDSC比例與性別、年齡無關(guān)；與健康體檢者相比，直腸增生性息肉、直腸絨毛狀腺瘤、直腸癌患者外周血中的Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值亦有明顯變化，且Treg比例及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的變化與MDSC比例的變化具有相關(guān)性。結(jié)果提示，在直腸腺瘤—直腸腺癌的發(fā)生演變過程中，MDSC可能通過誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生及CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例變化來抑制機體的細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而引起腫瘤的免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究提示MDSC可能通過調(diào)控Treg及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例來抑制機體的細(xì)胞免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，最終導(dǎo)致“直腸腺瘤—直腸腺癌”的演變過程。因此，在直腸癌的防治及綜合治療時，可以考慮聯(lián)合靶向MDSC療法[9-10]，以提高治療效果，改善患者的預(yù)后。

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