下調(diào)TPX2表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

郟愛華，金健，王彥秋，彭慧芳

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2神經(jīng)分子實驗室，河南 洛陽 471000

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，具有早期發(fā)病隱匿、進(jìn)展速度快等特點，其發(fā)病率和病死率在全部婦科腫瘤中位居前列[1]。卵巢癌細(xì)胞惡性增殖、凋亡減少是卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的重要基礎(chǔ)，而卵巢癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜，癌基因過度表達(dá)、抑癌基因表達(dá)缺失是卵巢癌發(fā)生的關(guān)鍵[2]。Xklp2靶蛋白（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）與微管蛋白有關(guān)，在生物機體細(xì)胞中心體的功能發(fā)揮中具有重要作用，其在多種腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織[3-4]。有研究顯示，TPX2參與膀胱癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖與調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)TPX2表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5-6]。目前，關(guān)于TPX2表達(dá)下調(diào)對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響尚不明確，本研究以卵巢癌細(xì)胞為研究對象，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染TPX2小干擾RNA下調(diào)細(xì)胞中TPX2的表達(dá)，并通過MTT比色法、細(xì)胞克隆實驗等方法明確TPX2表達(dá)下調(diào)對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，以期為研究卵巢癌的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

卵巢癌細(xì)胞SKO-V3購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time-PCR，qRT-PCR）試劑盒購自大連Takara生物工程公司；；cDNA合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）單克隆抗體購自美國Epitomic公司；TPX2單克隆抗體購自美國Santa公司；TPX2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由南京金斯瑞公司合成；TPX2 siRNA和siRNA control購自英國Abbexa公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)公司；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、磷酸化的STAT3（p-STAT3）單克隆抗體購自美國Abacm公司；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體購自美國Sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細(xì)胞分組及培養(yǎng)

SKO-V3采用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。SKO-V3濃度約為60%時，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA和siRNA control，分別作為干擾組和陰性組，同時以不作轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48 h后，分別采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表達(dá)水平，步驟見1.4.1和1.4.2。

1.4 實驗方法

1.4.1 qRT-PCR檢測 對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h，采用Trizol法提取細(xì)胞中的RNA，步驟按照RNA提取試劑盒說明書操作。提取的RNA使用無核糖核酸酶水溶解，保存在-80℃溫度下。吸取RNA樣品，采用微量核酸定量儀測定波長為260 nm和波長為280 nm時光密度（optical density，OD）的比值，比值范圍為1.8～2.0說明提取的RNA質(zhì)量較好。使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用qRT-PCR技術(shù)檢測TPX2 mRNA的水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用相對定量法計算，用2-△△Ct計算TPX2 mRNA的水平。TPX2上游引物為5'-ACCTTGCCCTACTAAGATT-3'，下 游 引 物 為 5'-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3'。GAPDH上游引物為 5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3-3'，下游引物為5'-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3'。PCR反應(yīng)體系按試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4.2 Western blot檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，對照組、陰性組和干擾組提取細(xì)胞總蛋白，步驟參照蛋白濃度提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品和上樣緩沖液混合后于100℃煮沸5 min。采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。每孔中添加40 μg蛋白，在110 V條件下電泳2 h。取出凝膠，在90 V、4℃的條件下把蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。封閉：5%胎牛血清白蛋白，室溫孵育60 min。一抗孵育：將NC膜放置在1∶900稀釋的一抗中，4℃孵育過夜。二抗孵育：將NC膜放置在1∶3000稀釋的二抗中，室溫條件下反應(yīng)1 h。DAB顯色，曝光后，用Quantity one分析目的條帶及內(nèi)參GAPDH的灰度值。目的蛋白水平=目的條帶灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4.3 MTT比色法實驗 將對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞接種到96孔板中，每個孔中加入3000個細(xì)胞，100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)5個重復(fù)孔，孵育48 h。在每個孔中添加MTT溶液20 μl，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，將孔內(nèi)的液體吸除干凈后，每個孔中添加150 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，孵育振蕩反應(yīng)10 min，用全自動酶標(biāo)儀檢測492 nm處的OD值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4.4 平板克隆實驗 將對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞種植到平皿中，于每個平皿中加入200個細(xì)胞，細(xì)胞液體積為10 ml，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h后，肉眼可以觀察到細(xì)胞克隆出現(xiàn)，采用4%的多聚甲醛固定，吉姆薩染色后，干燥，計算克隆形成數(shù)目和克隆形成率。實驗重復(fù)3次，取均值?？寺⌒纬陕?（克隆形成數(shù)目/接種細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞中加入冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗細(xì)胞后，與500 μl結(jié)合緩沖液混勻，再加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μl，在避光、室溫條件下孵育20 min。立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4.6 Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平檢測 對照組、陰性組和干擾組的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞蛋白，采用Western blot法檢測細(xì)胞中 Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值；p-STAT3以STAT3為內(nèi)參，計算p-STAT3/STAT3比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA后細(xì)胞中TPX2 mRNA、TPX2蛋白的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA后，對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞中TPX2 mRNA的表達(dá)水平分別為（1.00±0.12）、（1.02±0.09）、（0.21±0.02），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=225.988，P﹤0.05）；對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞中TPX2蛋白的表達(dá)水平分別為（1.15±0.13）、（1.13±0.12）、（0.36±0.04），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=55.505，P﹤0.05）。陰性組與對照組細(xì)胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。干擾組細(xì)胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白的表達(dá)水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖1）

圖1 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中TPX2的表達(dá)

2.2 下調(diào)TPX2對細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響

對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞的OD值分別為（0.85±0.06）、（0.84±0.08）、（0.46±0.05），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=35.592，P﹤0.01）；對照組、陰性組和干擾組的細(xì)胞克隆形成率分別為（41.36±0.42）%、（40.69±0.51）%、（26.54±0.22）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1300.177，P﹤0.01）。陰性組與對照組細(xì)胞的OD值和克隆形成率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。干擾組細(xì)胞的OD值和克隆形成率均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。

2.3 下調(diào)TPX2對細(xì)胞凋亡的影響

對照組、陰性組和干擾組的細(xì)胞凋亡率分別為（9.24±0.84）%、（9.32±0.80）%、（33.51±3.12）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=158.962，P﹤0.01）。陰性組與對照組的細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。干擾組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖2）

圖2 下調(diào)TPX2對細(xì)胞凋亡的影響

2.4 下調(diào)TPX2對細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

對照組、陰性組和干擾組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA和 p-STAT3/STAT3蛋白的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。陰性組與對照組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。干擾組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平明顯高于對照組，而Bcl-2、PCNA、p-STAT3/STAT3水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖3、表1）

圖3 下調(diào)TPX2對細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

TPX2在哺乳動物微管相關(guān)蛋白的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用，能夠作用于著絲粒，從而影響微管的形成、組裝及細(xì)胞的有絲分裂[7]。近年來的研究顯示，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞染色體20q11.2持續(xù)擴(kuò)增導(dǎo)致TPX2的表達(dá)水平升高，同樣在胰腺導(dǎo)管癌中發(fā)現(xiàn)TPX2 mRNA和TPX2蛋白過度表達(dá)，推測TPX2可能是腫瘤治療和診斷的潛在靶點[8-9]。在膀胱癌細(xì)胞T24中抑制TPX2表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞的增殖速度降低，并且細(xì)胞的凋亡率升高，細(xì)胞中Caspase的活化水平也提高[10]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)TPX2表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力均下降，而細(xì)胞凋亡率升高，說明下調(diào)TPX2表達(dá)可以發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

表1 下調(diào)TPX2后各組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表1 下調(diào)TPX2后各組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PCNA、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

組別對照組陰性組干擾組F值P值Bcl-2 0.95±0.08 0.93±0.12 0.21±0.03 73.714 0.000 Cleaved Caspase-3 0.40±0.06 0.41±0.07 1.04±0.10 65.400 0.000 PCNA 0.74±0.08 0.75±0.07 0.26±0.03 57.861 0.000 p-STAT3/STAT3 0.85±0.06 0.84±0.04 0.13±0.02 273.911 0.000

細(xì)胞的增殖與凋亡是一個復(fù)雜的過程，受多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，是細(xì)胞內(nèi)多種因子共同作用的結(jié)果[11]。Caspase級聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞凋亡，是目前研究較為透徹的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其含有多個蛋白成員，根據(jù)其作用的不同可以分為凋亡起始因子、執(zhí)行因子等，其中，Caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用，其活化形成Cleaved Caspase-3后，標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段[12]。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的成員，其表達(dá)水平升高后可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。PCNA存在于增殖細(xì)胞中，與細(xì)胞內(nèi)的DNA合成有關(guān)，其表達(dá)水平的高低可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)[14]。有研究顯示，卵巢癌組織中Bcl-2水平升高，Cleaved Caspase-3水平降低，PCNA水平升高，PCNA、Caspase-3水平的高低與卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)[15-16]。本研究顯示，下調(diào)TPX2后的卵巢癌細(xì)胞中PCNA和Bcl-2水平下降，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高，說明下調(diào)TPX2可能通過誘導(dǎo)Caspase-3活化、抑制Bcl-2表達(dá)從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，通過降低PCNA的表達(dá)水平抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞內(nèi)存在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞正常生物學(xué)特性的發(fā)揮中具有重要作用[17]。STAT3信號通路在生命體正常的組織和器官中均有表達(dá)，其磷酸化水平升高后可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞的凋亡[18]。在卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路過度激活，阻斷STAT3信號通路后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)TPX2表達(dá)可以阻斷STAT3的磷酸化，抑制STAT3信號通路的激活，這提示下調(diào)TPX2表達(dá)可能通過抑制STAT3信號通路的激活從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)TPX2表達(dá)可以降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞中Caspase-3活化，抑制細(xì)胞中Bcl-2、PCNA的表達(dá)和STAT3信號通路的激活。TPX2可能是治療卵巢癌的潛在靶點，這為卵巢癌發(fā)病機制的研究奠定了基礎(chǔ)，但對于其具體的作用機制仍然需要進(jìn)一步深入的探討。

參考文獻(xiàn)

[1]Claus EB,Schildkraut JM,Thompson WD,et al.The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer[J].Cancer,1996,77(11):2318-2324.

[2]Negri E,Tzonou A,Beral V,et al.Hormonal therapy for menopause and ovarian cancer in a collaborative re-analysis of European studies[J].Int J Cancer,1999,80(6):848-851.

[3]Gupta A,Jain R,Wahi D,et al.Abrogation of AuroraATPX2 by novel natural inhibitors:molecular dynamicsbased mechanistic analysis[J].J Recept Signal Transduct Res,2015,35(6):626-633.

[4]Niu H,Gong L,Tian X,et al.Low expression of miR-491 promotes esophageal cancer cell invasion by targeting TPX2[J].Cell Physiol Biochem,2015,36(6):2263-2273.

[5]李美玲,張業(yè)玲,丁曉,等.人宮頸癌Hela細(xì)胞TPX2基因沉默對放射敏感性的影響[J].山東醫(yī)藥,2017,57(2):47-49.

[6]Yan L,Li S,Xu C,et al.Target protein for Xklp2(TPX2),a microtubule-related protein,contributes to malignant phenotype in bladder carcinoma[J].Tumour Biol,2013,34(6):4089-4100.

[7]Wei JH,Zhang ZC,Wynn RM,et al.GM130 regulates golgi-derived spindle assembly by activating TPX2 and capturing microtubules[J].Cell,2015,162(2):287-299.

[8]Schneider MA,Christopoulos P,Muley T,et al.AURKA,DLGAP5,TPX2,KIF11 and CKAP5:five specific mitosisassociated genes correlate with poor prognosis for nonsmall cell lung cancer patients[J].Int J Oncol,2017,50(2):365-372.

[9]Warner SL,Stephens BJ,Nwokenkwo S,et al.Validation of TPX2 as a potential therapeutic target in pancreatic cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(21):6519-6528.

[10]閆亮.TPX2在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其初步分子機制研究[D].鄭州:鄭州大學(xué),2014.

[11]于洋洋,梁明輝.丹皮酚對肝癌細(xì)胞增殖凋亡及JAKSTAT信號通路的影響[J].中國老年學(xué),2017,37(7):1591-1593.

[12]Yang CS,Matsuura K,Huang NJ,et al.Fatty acid synthase inhibition engages a novel caspase-2 regulatory mechanism to induce ovarian cancer cell death[J].Oncogene,2015,34(25):3264-3272.

[13]Koukourakis MI,Giatromanolaki A,O’Byrne KJ,et al.Potential role of bcl-2 as a suppressor of tumour angiogenesis in non-small-cell lung cancer[J].Int J Cancer,1997,74(6):565-570.

[14]Li X,Liu X,Cui D,et al.Clinical significance of nucleostemin and proliferating cell nuclear antigen protein expression in non-small cell lung cancer[J].J BUON,2015,20(4):1088-1093.

[15]銀鐸,劉彤.卵巢上皮性腫瘤組織中Caspase-3,bcl-2的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(8):55-58.

[16]Dias MC,Furtado KS,Rodrigues MA,et al.Effects of Ginkgo biloba on chemically-induced mammary tumors in rats receiving tamoxifen[J].BMC Complement Altern Med,2013,13:93.

[17]De Simone V,Franzè E,Ronchetti G,et al.Th17-type cytokines,IL-6 and TNF-α synergistically activate STAT3 and NF-kB to promote colorectal cancer cell growth[J].Oncogene,2015,34(27):3493-3503.

[18]Jiang J,Li Z,Yu C,et al.MiR-1181 inhibits stem cell-like phenotypes and suppresses SOX2 and STAT3 in human pancreatic cancer[J].Cancer Lett,2015,356(2 Pt B):962-970.

[19]陳亮,盛修貴.IL-6/STAT3信號通路與卵巢癌關(guān)系研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(15):1253-1256.

[20]方禛浩,諶鏨,李妍靜,等.NF-κB和STAT3對宮頸癌作用的研究進(jìn)展[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2013,14(1):81-83.