多聚ADP-核糖結合蛋白的鑒定

沈莉芳,張 弛,吳家雪

(復旦大學 生命科學學院，上海200438)

ADP-核糖基化是一種在高等真核生物中普遍存在的蛋白翻譯后修飾．該修飾由ADP-核糖基轉移酶家族的成員催化，從底物β-NAD+轉移ADP-核糖部分到受體蛋白上，從而調節(jié)這些蛋白的功能．ADP-核糖基團可以以單個的ADP-核糖(MAR)或以聚合鏈多聚ADP-核糖(PAR))的形式存在．目前已經發(fā)現(xiàn)PAR在染色質重塑、DNA損傷修復、基因轉錄、蛋白質降解和細胞死亡中發(fā)揮重要作用[1-3]．

PAR的功能除了調節(jié)底物外，還可以作為介導兩個蛋白之間相互作用的平臺起作用．例如，許多DNA損傷應答因子，如ALC1[4-5]和CHFR[6]在DNA損傷時能夠被招募到DNA損傷位點，這種募集作用取決于它們與DNA損傷位點上被PAR修飾蛋白的結合，并且能被ADP-核糖基轉移酶(poly(ADP-ribose)polymerases, PARPs)抑制劑抑制．這種相互作用主要由PAR和PAR結合結構域的結合來介導．目前已經報道了一些PAR結合結構域．這些結構域包括Marco結構域[4]，WWE結構域[7]，PAR結合鋅指結構域(PBZ)[6,8-10]，BRCT結構域[11]，F(xiàn)HA結構域[11]，OB-折疊結構域[12]，PIN結構域[13]和RNA識別基序(RRM)[14]．

鑒定PAR修飾蛋白或PAR結合蛋白對于探索PAR的功能非常重要．但是由于目前大規(guī)模檢測PAR修飾位點技術的缺乏，在文獻和數(shù)據(jù)庫中報道的PAR修飾蛋白或PAR結合蛋白還比較少．基于質譜的蛋白質組學已經成為鑒定復雜的PAR結合蛋白的關鍵技術[15-17]．最近有研究表明利用抗體，PAR結合結構域或NAD+類似物沉淀相關的PAR修飾蛋白，并進行質譜分析可以得到大量的PAR修飾或者PAR結合蛋白[18-22]．然而，通過這些方法鑒定的蛋白絕大部分是被PAR修飾的蛋白，缺少直接與PAR結合蛋白的信息．

本論文中，我們通過利用PAR修飾的PARP1或PARP1分別進行pull-down試驗和質譜分析來比較分別與PARP1或PAR-PARP1結合的蛋白，得到PAR特異結合蛋白．結果表明，我們鑒定到大量PAR結合蛋白，并進行進一步的驗證．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和質粒

人腎上皮細胞來源的HEK 293T細胞系和人肝癌細胞來源的QGY-7703細胞系獲自中國科學院上海細胞庫．載體pGEX-4T-1或修飾的SBP載體由本實驗室保存．

1.1.2 主要試劑

DNA聚合酶，限制性內切酶，T4DNA連接酶體系(New England Biolabs)，質粒小量抽提試劑盒，PCR產物純化試劑盒和柱離心式凝膠回收純化試劑盒(Axygen)，谷胱甘肽瓊脂糖珠4B(Amersham),胎牛血清(Gibco),100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素(Euroclone),DMEM培養(yǎng)基(Hyclone),辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔抗體(Calbiochem)，抗體抗-PAR多抗(Thermo)，ECL顯色試劑盒(Santa Cruze).

1.1.3 siRNA

HRP2干擾siRNA寡核苷酸購自上海吉瑪生物公司．HRP-2的siRNA寡核苷酸正向序列是： si-HRP-2#1： 5’-GCCCAACAAGAGGAAAGGC-3’;si-HRP-2#2： 5’-GCUGCACAGUGAGAUCAAG-3’．陰性對照序列為： 對照： 5’-ACAGACUUCGGAGUACCUG-3’．根據(jù)說明書，使用Oligofectamine(Invitrogen)將siRNA轉染入細胞．

1.2 方法

1.2.1 體外ADP-核糖基化

GST-PARP1融合蛋白與PAR核糖基化緩沖液(100mmol/L Tris-HCl(pH7.8)，12.5mmol/L NAD+，10mmol/L MgCl2，50μg寡脫氧核糖核苷酸(5’-GGAATTCC-3’)和10mmol/L DTT)或者不含NAD+的PAR核糖基化緩沖液混合，并于30℃條件下孵育30min．通過GST抗體或者PAR抗體進行免疫印跡分析PARP1的自我修飾．

1.2.2 PAR的合成和純化

PAR合成緩沖液1mL(100mmol/L Tris-HCl pH 7.8, 10mmol/L MgCl2，12.5mmol/L NAD+，10mmol/L DTT，50μg寡脫氧核糖核苷酸(5’-GGAATTCC-3’)，100μg GST-PARP1)，37℃孵育1h，加入20mL預冷的20% TCA終止．加入DNA酶Ⅰ去除寡核苷酸DNA，并經蛋白酶K消化蛋白后，用乙醇沉淀并純化[6]．

1.2.3 GST pull-down實驗

收集HEK 293T細胞，用含有0.5% NP-40，100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和1mmol/L EDTA的細胞裂解緩沖液裂解細胞．將細胞裂解液與GST融合蛋白(GST-PARP1或被PAR修飾的GST-PARP1)在4℃孵育2h，然后加入谷胱甘肽瓊脂糖珠4B再結合2h．通過離心的方法，收集谷胱甘肽瓊脂糖珠，并用細胞裂解液將非特異結合的蛋白去除．加入SDS上樣液，98℃加熱10min后，進行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍(CBB)染色．最后將相應的泳道進行切割，并送到質譜分析平臺進行質譜鑒定．

1.2.4 蛋白的表達和純化

按照之前報道的方法[6]在昆蟲細胞中表達并純化得到GST-PARP1蛋白．而GST-HRP2，CDK9，EWSR，F(xiàn)XR1，PWWP和PWWP突變蛋白在大腸桿菌E.coliBL21中表達并純化．簡而言之，將轉入PGEX-4T-HRP2或其他基因的E.coliBL21培養(yǎng)到OD到0.6左右，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并在20℃誘導表達誘導表達6h．離心收集細菌后，通過超聲破碎細胞，高速離心后收集上清液體，再加入谷胱甘肽瓊脂糖珠4B在4℃結合2h，然后用含有還原性谷胱甘肽的洗脫液將GST融合蛋白從谷胱甘肽瓊脂糖珠4B洗脫下來，并通過SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色來分析融合蛋白．

1.2.5 斑點印跡和體外結合實驗

將GST融合蛋白各2.5μL點樣在0.22μm硝酸纖維素膜上，自然風干后，用1×TBST(20mmol/L Tris-HCl，0.3mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 8.0)配置的5%的脫脂牛奶在室溫下封閉40min；室溫下將PAR聚合物與結合GST融合蛋白的膜孵育1h，然后用含高濃度氯化鈉(50mmol/L)的1×TBST洗膜4次，自然風干；將膜與用TBST稀釋的抗PAR多克隆抗體(HRP標記)孵育1h，然后用TBST溶液洗膜3次，最后進行顯色爆光．

1.2.6 細胞存活率測定

將細胞接種到60mm的培養(yǎng)皿上，然后分別用對照siRNA或HRP-2 siRNA轉染．轉染24h后，加入DNA損傷藥物CPT或MMS處理細胞．每3天更換1次培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)10d．通過比較培養(yǎng)皿中形成的細胞克隆數(shù)來計算存活的細胞數(shù)量．

1.2.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)取自3個獨立實驗的均值±標準差．有意義的差異通過Studentt檢驗進行評估．P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義．

2 結 果

2.1 多聚ADP-核糖結合的蛋白的鑒定

從昆蟲細胞中表達并純化GST-PARP1，考馬斯亮藍染色表明獲得的GST-PARP1比較純，大小為140kDa左右，與預期一致(圖1(a))．通過體外PAR反應，并分別利用PAR抗體和GST抗體進行Western blot分析，表明獲得的GST-PARP1在體外具有很強的酶活性，幾乎所有的GST-PARP1能夠在體外進行自我PAR修飾(圖1(b))．

為了鑒定PAR結合蛋白，我們將GST-PARP1或PAR修飾的GST-PARP1蛋白分別與HEK 293T細胞的裂解液孵育，然后用谷胱甘肽瓊脂糖珠進行沉淀．通過質譜分析GST-PARP1和PAR修飾的GST-PARP1結合的蛋白．表1列出了部分質譜分析得到的特異與被PAR修飾的GST-PARP1結合的蛋白．在這些僅特異性結合PAR修飾的GST-PARP1的蛋白中，有部分已被報道與PAR結合，如SFPQ，NONO，F(xiàn)US，TAF15，RBMX，PARP2，CHFR和ALC1[5-6,21,23-24]，部分是第一次發(fā)現(xiàn)與PAR結合．為了進一步驗證這些蛋白與PAR的結合，我們表達并純化了GST融合的CDK9，F(xiàn)XR2，EWSR1和HRP2蛋白(圖1(c))．然后通過Dot blot方法體外檢測GST-CDK9，F(xiàn)XR2，EWSR1和HRP2與PAR的相互作用，并用抗GST和抗PAR的抗體進行Western blot分析，結果表明這4個蛋白都能在體外與PAR結合(圖1(d))．

圖1 PAR結合蛋白的鑒定Fig.1 Identification of PAR-binding proteins(a) GST-PARP1的SDS-PAGE凝膠電泳及考馬斯亮藍染色；(b) Western blot驗證GST-PARP1的體外自我修飾；(c) GST-CDK9,FXR1,HRP2和EWSR1的SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色；(d) Dot blot驗證GST-CDK9, FXR1, HRP2和EWSR1與PAR體外結合.

編號蛋白名稱+PAR-PAR是否已報道編號蛋白名稱+PAR-PAR是否已報道1PARP1152164是14C22orf28101否2XRCC52323是15EWSR191否3XRCC62322是16FAM98A91否4SFPQ282是17PABPC190否5DDX3X271否18HNRNPUL181否6NONO192是19FXR170否7DDX5182否20FXR240否8FUS171是21FMR140否9SUPT16H172是22HRP230否10DDX1140否23ALC130是11KHDRBS1121否24CHFR30是12RBM14121否25CDK920否13TAF15120是

2.2 PWWP域是一個PAR結合結構域

在這些新的PAR結合蛋白中，HRP-2屬于肝癌衍生生長因子相關蛋白家族(HDGF家族)．該家族包括HDGF，HDGFL1，LEDGF，HRP-2和HRP-3．該家族的蛋白在N末端都有保守的PWWP/HATH結構域[25-27]．之前，我們發(fā)現(xiàn)HRP-2和HRP-3在肝癌(HCC)細胞中上調，并促進HCC細胞的生長和存活，表明它們在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[28-29]．有趣的是，有報道發(fā)現(xiàn)HDGF與PARP1相關[30]．我們還發(fā)現(xiàn)HDGF存在于PAR修飾的GST-PARP1結合的蛋白復合物中，而不存在于GST-PARP1結合的蛋白復合物中．HDGF和HRP-2在N末端都含有非常保守的PWWP結構域，暗示HRP-2與PAR的相互作用很大可能依賴于其PWWP結構域．

為了驗證這一假設，我們構建了SBP標簽標記的全長HRP-2(HRP-2 WT)和PWWP結構域缺失突變體HRP-2(HRP-2 MT)的質粒，并將其轉染到HEK 293T細胞中．將PAR修飾的GST-PARP1分別與表達HRP-2 WT或HRP-2 MT的HEK 293T細胞的細胞裂解液共孵育，然后用谷胱甘肽-瓊脂糖珠進行沉淀并用Flag抗體進行Western blot分析．如圖2(a)所示，PAR修飾的GST-PARP1能與野生型的HRP-2相互作用，而不與PWWP結構域缺失突變體HRP-2相互作用，表明HRP-2的PWWP結構域是HRP2與PAR相互作用必需的．

為了進一步驗證這一假設，我們克隆、表達并純化了所有HDGF家族成員的PWWP結構域，并進行PAR體外結合實驗．如圖2(b)和圖2(c)(看40頁)所示，HDGF家族蛋白的PWWP結構域都與PAR具有強烈的相互作用．為進一步證實這種相互作用，我們表達并純化了HRP-2的PWWP結構域的截斷突變體蛋白，并檢測了這些截斷體蛋白與PAR的相互作用．如圖2(d)和圖2(e)(看40頁)所示，缺失PWWP結構域的N末端或C末端完全抑制了PWWP結構域和PAR之間的相互作用．這些結果表明，HDGF蛋白家族的PWWP結構域是PAR結合結構域．

圖2 PWWP結構域是個PAR結合結構域Fig.2 PWWP domains is a PAR binding module(a) HRP2的PWWP結構域與PAR修飾的PARP1相互作用；(b) HDGF家族的PWWP結構域的SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色；(c) Dot blot鑒定PWWP結構域與PAR的體外結合；(d) PWWP結構域及其突變體的SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色；(e) Dot blot鑒定PWWP結構域及其突變體與PAR體外結合．

2.3 HRP-2缺失突變細胞對DNA損傷劑敏感

之前的研究表明很多PAR結合蛋白能在DNA損傷時被招募到DNA損傷位點，從而參與DNA損傷應答[4-5,8,11]．我們檢測了HRP-2是否能在激光誘導DNA損傷的細胞中被招募到DNA損傷部位．雖然陽性對照CHFR能快速地定位于激光誘導的DNA損傷處，但是在激光處理細胞引起DNA損傷后，GFP-HRP2的定位沒有明顯變化，表明HRP2在DNA損傷時不能被招募到DNA損傷位點(數(shù)據(jù)未顯示)．

圖3 HRP-2表達水平被其 siRNA顯著抑制Fig.3 Expression of HRP-2 was inhibited by its siRNA

接著我們檢測HRP-2缺失細胞對DNA損傷藥物的敏感性．前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)HRP-2特異siRNA能顯著降低其在肝癌細胞中的表達[29]．因此，我們將HRP-2特異siRNA或對照siRNA分別轉入QGY-7703，并用Western blot的方法來檢測其表達情況．如圖3所示，相對于對照細胞，HRP-2特異siRNA轉染的細胞，其HRP-2的表達水平顯著降低．

然后我們用DNA損傷藥物CPT和MMS處理轉染HRP-2特異siRNA或對照siRNA的細胞，并通過CKK8試劑盒來檢測細胞的存活率．如圖4所示，DNA損傷劑CPT或MMS處理后，相對于對照組細胞，HRP-2缺失細胞的存活率明顯降低，表明HRP-2缺失細胞對DNA損傷劑非常敏感，HRP-2可能在DNA損傷修復中具有重要的功能．這并不奇怪，許多蛋白參與DNA損傷修復，但并不定位到DNA損傷位點例如，最近報道的53BP1的相互作用蛋白TIRR盡管在DNA損傷后不能被招募到DNA損傷部位，但是TIRR缺失細胞對DNA損傷劑呈現(xiàn)敏感性[31]．

圖4 HRP-2消減細胞對DNA損傷藥物敏感Fig.4 HRP-2 depletion cells are sensitive to DNA damage agent(a) HRP-2消減細胞對DNA損傷藥物MMS敏感；(b) HRP-2消減細胞對DNA損傷藥物CPT敏感．

3 結 論

本研究中，我們通過親和純化和質譜分析的方法鑒定了大量與PAR特異結合的蛋白，并在體外進一步驗證了所鑒定的CDK9、EWSR1、FXR1和HRP2與PAR的結合．在此基礎上，我們還發(fā)現(xiàn)HDGF家族成員的PWWP結構域是一個PAR結合結構域；而且HRP-2消減能導致細胞對DNA損傷藥物敏感，表明HRP2可能參與了DNA損傷修復過程．這些結果為進一步研究PAR及其相互作用蛋白的功能打下了堅實的基礎．

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