阿爾茨海默癥靶基因及其藥物的預(yù)測(cè)研究

侯 吉，李小林，田衛(wèi)東

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)與計(jì)算生物學(xué)系，上海 200438; 2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局 上海 200135)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)又稱老年癡呆癥，是一種進(jìn)行性神經(jīng)障礙疾病，嚴(yán)重危害老年人身心健康[1]．記憶喪失，思維能力，推理能力下降以及個(gè)性和行為的變化是AD的主要特征[2]．其病理特征是在AD患者的大腦中形成細(xì)胞外淀粉樣斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)．主要原因是淀粉樣蛋白β肽(Aβ)的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致淀粉樣蛋白斑積聚．這種過量產(chǎn)生是由于親本淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的內(nèi)切蛋白，其被α-酶復(fù)合物，β-酶復(fù)合物和γ-酶復(fù)合物的分泌酶切割[3]．大腦中Aβ的產(chǎn)生增加和清除率降低會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)展過程中的突發(fā)事件級(jí)聯(lián)，包括突觸損傷，高磷酸化tau(p-tau)，線粒體結(jié)構(gòu)和功能變化，炎癥反應(yīng)，激素失衡，細(xì)胞周期變化和神經(jīng)元損失[4-6]．在全球范圍內(nèi)，大約有超過4000萬個(gè)60歲以上的老人患有阿爾茨海默癥，患者人數(shù)增長趨勢(shì)不斷上升，甚至每20年翻一番[7-8]．

近年來，AD的預(yù)防及治療的相關(guān)研究雖然已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，一些新的藥物也被陸續(xù)研發(fā)出來，但真正具有明顯臨床效果的卻是鳳毛麟角．因此，有必要對(duì)歷年來所有可用于治療AD的藥物進(jìn)行匯總整理，運(yùn)用生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)整合各層面的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效深入分析，預(yù)測(cè)未知的AD靶基因．對(duì)于進(jìn)一步指導(dǎo)AD藥物開發(fā)以及對(duì)已有藥物臨床綜合使用具有重要的意義．

1 數(shù)據(jù)和方法

1.1 數(shù)據(jù)的收集和處理

DrugBank數(shù)據(jù)庫是本文研究的核心．DrugBank(http：∥www.drugbank.ca)是一個(gè)綜合的在線數(shù)據(jù)庫，其中包含許多藥物及其相關(guān)作用機(jī)制以及廣泛的生物化學(xué)和藥理學(xué)信息．該數(shù)據(jù)庫將詳細(xì)的藥物(即化學(xué)、藥理和藥物)數(shù)據(jù)與綜合藥物靶標(biāo)(即序列、結(jié)構(gòu)和途徑)信息相結(jié)合．?dāng)?shù)據(jù)庫中總共包含了9591個(gè)藥品，包括美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的2037個(gè)小分子藥物，241個(gè)FDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)(蛋白質(zhì)、肽)藥物，96個(gè)營養(yǎng)藥物和6000多個(gè)實(shí)驗(yàn)藥物．此外，4661非冗余蛋白(即藥物靶標(biāo)、酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、載體)的序列與這些藥物的關(guān)系也被儲(chǔ)存在這些條目中．每個(gè)藥物數(shù)據(jù)條目包含超過200個(gè)數(shù)據(jù)字段，其中一半的信息是藥物、化學(xué)數(shù)據(jù)，另一半是藥物靶標(biāo)或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)．

本次研究從DrugBank數(shù)據(jù)庫中下載drugbank_all_full_database.xml.zip文件，解壓后得到full database.xml即DrugBank全藥物數(shù)據(jù)信息．通過DrugBank(http：∥www.drugbank.ca)的高級(jí)搜索功能找出所有可用于治療AD的藥物及其ID．而后通過數(shù)據(jù)匹配，從DrugBank全藥物數(shù)據(jù)信息中挖掘得到221個(gè)AD的靶基因．

1.2 功能富集分析

通過DAVID(https：∥david.ncifcrf.gov/)網(wǎng)站使用基因本體(Gene Ontology, GO)進(jìn)行功能富集分析，以P<0.05(FDR校正)為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到靶基因所參與的一系列生物學(xué)過程(Biological Process, BP)．進(jìn)一步通過Gene Ontology數(shù)據(jù)庫挖掘出這些生物過程中所有的相關(guān)基因，稱之為ADTarget_BP(AD Target from Biological Process)．同時(shí)，根據(jù)富集得到的生物學(xué)過程進(jìn)一步分析其與AD的聯(lián)系．

1.3 靶基因預(yù)測(cè)

μa是a基因的網(wǎng)絡(luò)原始平均距離：

其中N為所有網(wǎng)絡(luò)基因的總數(shù)(19038)．

最終可計(jì)算得到網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)基因關(guān)于某個(gè)疾病的權(quán)重：

K為所有疾病基因的總數(shù)[11]，在本研究中即為AD靶基因的個(gè)數(shù)(221)．

本研究將使用矯正后的距離Dadj來計(jì)算靶基因子網(wǎng)絡(luò)的平均距離和10000個(gè)隨機(jī)相同數(shù)量基因(221個(gè))子網(wǎng)絡(luò)的平均距離，并進(jìn)行比較．由此得出靶基因子網(wǎng)絡(luò)的平均距離是否較小，即靶基因在整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)中是否相對(duì)聚集．

對(duì)于聚集度較高的靶基因子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步使用GenePANDA預(yù)測(cè)AD的靶基因，由此獲得到更好的預(yù)測(cè)結(jié)果[11]．將AD的221個(gè)已知靶基因輸入GenePANDA預(yù)測(cè)工具，進(jìn)而得到網(wǎng)絡(luò)中所有19038個(gè)基因關(guān)于AD靶基因預(yù)測(cè)的分?jǐn)?shù)排名，分?jǐn)?shù)排名越高則代表預(yù)測(cè)基因和原始AD靶基因集的關(guān)系越密切．本次研究提取分?jǐn)?shù)排名前100的基因，而后將該基因集中包含的已知AD靶基因去除，得到GenePANDA初步預(yù)測(cè)的AD靶基因集．再將該基因集進(jìn)行整理，去除其中已知的靶基因，最后得到GenePANDA實(shí)際預(yù)測(cè)的AD靶基因集，稱之為ADTarget_GP(AD Target from GenePANDA)．將ADTarget_GP與ADTarget_BP取交集，得到最終預(yù)測(cè)的AD靶基因集，稱之為ADTarget_PT(AD Target from Predict)．

1.4 治療AD藥物預(yù)測(cè)

將預(yù)測(cè)得到的AD靶基因集合ADTarget_PT與DrugBank全藥物數(shù)據(jù)庫(full database.xml)進(jìn)行匹配，得到這些靶基因的相關(guān)藥物，該些藥物即為預(yù)測(cè)得到可用于治療AD的潛在藥物．

2 結(jié)果和分析

2.1 靶基因本體(Gene Ontology, GO)富集分析

在DAVID網(wǎng)站對(duì)221個(gè)AD的已知靶基因使用Gene Ontology做功能富集分析，以P<0.05(FDR校正)為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到顯著富集的78個(gè)生物學(xué)過程．

圖1 已知AD靶基因功能富集生物過程Fig.1 Functional enrichment biological process of known AD target genes從上到下包括GO：0007271，0035094，0042493，0007165，0098655，0007268，0007274，0001975，0007187，0071880，0035235，0007200，0045471，0042220，0035095，0007626，0006939，0019229，0031000，0008542，0045907，0060134，0014059，0007197，0070374，0007194，0007207，0032496，0006940，0007190，0008284，0042310，0045944，0043406，0007613，0007193，0009636，0008217，0007204，0007267，0007568，0006874，0001963，0042391，0006811，0043410，0045429，0000187，0006954，0001666，0007166，0050795，0001973，0001659，0008285，0019233，0030335，0042053，0042346，0045987，0007188，0042417，0001994，0007612，0000165，0048661，0006810，0051209，0071222，0007210，0030168，0042420，0031622，0038170，0048148，0070588，0050796，0032729.

由圖1可知，已知的AD靶基因主要與膽堿能傳遞、尼古丁反應(yīng)、藥物反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)、化學(xué)傳播、神經(jīng)肌肉突觸傳播等生物學(xué)過程相關(guān)．這些生物學(xué)過程已有多項(xiàng)被報(bào)道與AD有關(guān)．例如，實(shí)驗(yàn)證實(shí)尼古丁可在體外分解預(yù)先形成的β-淀粉樣蛋白原纖維[12]．而膽堿能傳遞更是與AD治療息息相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)新分子能夠通過靶向膽堿能系統(tǒng)，直接對(duì)膽堿受體進(jìn)行刺激并加入到乙酰膽堿酯酶抑制劑中，抑制β-淀粉樣蛋白聚集[13]．此外，與谷氨酸能功能障礙相關(guān)的化學(xué)生物學(xué)過程也與治療AD有密切關(guān)系[14]．而涉及神經(jīng)肌肉突觸傳播的生物學(xué)過程的突觸功能障礙和認(rèn)知衰退也被證明是阿爾茨海默病的早期特征[15]．盡管如此，富集的78個(gè)生物學(xué)過程仍有一些并未發(fā)現(xiàn)有與AD相關(guān)的直接研究證據(jù)，如陽性調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、鈣離子跨膜運(yùn)輸?shù)龋谖覀兊姆治鼋Y(jié)果，這些尚未有證據(jù)證明與AD相關(guān)的生物學(xué)功能特征，或許將是未來阿爾茨海默癥研究領(lǐng)域的新方向．

基于上述對(duì)78個(gè)生物學(xué)過程與AD相關(guān)性的分析，我們有理由相信參與這些生物過程的基因也與AD相關(guān)．而后通過編寫程序獲取78個(gè)生物學(xué)過程在GO數(shù)據(jù)庫中相關(guān)的所有基因，即ADTarget_BP，共3350個(gè)．

2.2 AD靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)AD的221個(gè)已知靶基因作網(wǎng)絡(luò)距離校正，得到Dadj，并計(jì)算得到AD靶基因子網(wǎng)絡(luò)的平均距離為0.7089，通過編寫程序從19038個(gè)基因中隨機(jī)抽取子網(wǎng)絡(luò)10000次，每次抽取與已知靶基因相同數(shù)量的221個(gè)基因，得出的子網(wǎng)絡(luò)平均距離分布見圖2(看54頁)．

由圖2可知，AD靶基因子網(wǎng)絡(luò)平均距離顯著小于隨機(jī)子網(wǎng)絡(luò)平均距離(P<10-4)，即AD靶基因在整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)中顯著聚集．因此使用GenePANDA對(duì)AD的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果將更可靠．

將收集到的221個(gè)AD靶基因輸入至GenePANDA預(yù)測(cè)工具后，我們得到整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)中所有關(guān)于AD靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果，即19038個(gè)基因的分值排名．本次研究截取分值排名前100的預(yù)測(cè)靶基因作為研究對(duì)象．將其中已知AD靶基因去除后，得到預(yù)測(cè)的AD靶基因集合，ADTarget_GP，共有86個(gè)基因．而后，將ADTarget_GP與上述ADTarget_BP取交集，最終得到預(yù)測(cè)的AD靶基因集，即ADTarget_PT，共有66個(gè)基因．對(duì)66個(gè)預(yù)測(cè)AD的靶基因進(jìn)行文獻(xiàn)查閱驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如表1所示．

圖2 已知AD靶基因子網(wǎng)絡(luò)示意圖及其平均距離Fig.2 Gene sub-network diagram and its average distance of known AD target genes

表1 阿爾茨海默癥預(yù)測(cè)靶基因驗(yàn)證結(jié)果表

通過查詢文獻(xiàn)，上述報(bào)道有用于治療AD的靶基因或與AD直接相關(guān)的基因共有30個(gè)基因．例如，氧雜雙環(huán)庚烯磺酸鹽通過激活GPER1，提供了針對(duì)增強(qiáng)膠質(zhì)細(xì)胞存活的保護(hù)，從而治療AD[16]．還有實(shí)驗(yàn)證明導(dǎo)致AD中海馬POMC電路缺陷的潛在細(xì)胞機(jī)制很重要，識(shí)別補(bǔ)充POMC衍生肽的儲(chǔ)存和維持MC4R活化的方法對(duì)于緩解海馬突觸可塑性損傷至關(guān)重要，因此POMC/MC4R電路是AD相關(guān)認(rèn)知功能障礙的潛在治療靶點(diǎn)[17]．M13家族的酶已被確定為腦內(nèi)Aβ分解代謝的主要介質(zhì)．因此，這些酶對(duì)AD具有顯著的病理和治療意義．而大腦中SSTR4作用的選擇性增強(qiáng)有可能通過調(diào)節(jié)這些酶來減輕毒性Aβ42寡聚體的積累[18]．另外，有研究證明GALR2參與對(duì)空間記憶障礙和海馬Aβ聚集的保護(hù)作用[19]．

2.3 治療AD藥物預(yù)測(cè)結(jié)果

上述文獻(xiàn)驗(yàn)證的研究結(jié)果表明預(yù)測(cè)得到的AD靶基因(ADTarget_PT)與AD密切相關(guān)，靶向這些基因的藥物則可潛在治療AD．因此，本研究進(jìn)一步從DrugBank藥物數(shù)據(jù)庫(full database.xml)中挖掘靶向66個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因的藥物，進(jìn)一步獲得我們預(yù)測(cè)靶基因的研究價(jià)值．在66個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因中，18個(gè)基因有對(duì)應(yīng)的靶向藥物．最終共得到44種可潛在用于治療AD的藥物，其中有10種藥物已被研究可用于治療AD，詳見表2．

表2 DrugBank中靶向預(yù)測(cè)基因的藥物

*： 已被研究可用于治療阿爾茨海默癥的藥物．

圖3 預(yù)測(cè)用于治療AD藥物分類圖Fig.3 Classification of predicted drugs for the treatment of AD

在這44種藥物中有21種藥物是可被用于治療抑郁癥、偏頭痛等疾病的神經(jīng)類治療藥物，另外23種藥物是可被用于治療艾滋病、哮喘等疾病的非神經(jīng)類治療藥物(圖3，看56頁)．在神經(jīng)類治療藥物中有阿米替林、奧氮平、氯氮平、阿莫沙平、α-氨基異丁酸和組胺共6種藥物對(duì)AD有治療作用．例如，阿米替林是預(yù)測(cè)得到的用于治療各型抑郁癥或抑郁狀態(tài)的神經(jīng)類治療藥物．有研究顯示，阿米替林在老年患者損傷的AD腦中具有顯著的治療作用，并且它顯示出作為治療AD的可耐受的新型治療劑的希望[20]．此外，阿莫沙平也是預(yù)測(cè)得到的神經(jīng)類治療藥物，它是一種二苯并氧氮卓三環(huán)類抗抑郁藥．研究表明，阿莫沙平通過多種HTR6介導(dǎo)的靶標(biāo)(包括β-arrestin2和CDK5)降低了Aβ的產(chǎn)生．阿莫沙平雖然不再是治療抑郁癥的一線藥物，但可能有益于治療AD，而進(jìn)一步用三氯乙酸(TCA)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾發(fā)現(xiàn)，它可作為治療AD的理想治療劑[21]．在非神經(jīng)類治療藥物中有地塞米松、吲哚美辛、舒林酸和酮洛芬共4種藥物對(duì)AD有治療作用．例如，地塞米松是一種抗炎糖皮質(zhì)激素，可用于治療哮喘、風(fēng)濕性疾病等．有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地塞米松在特異性位點(diǎn)顯著降低了由糖原合酶激酶-3β蛋白水平活性降低介導(dǎo)的tau磷酸化，在改善AD認(rèn)知障礙中起重要作用[22]．

3 討 論

本次AD靶基因和藥物的預(yù)測(cè)研究，通過整理其已知靶基因，使用功能富集分析、網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)、數(shù)據(jù)匹配和大量文獻(xiàn)查閱等方式得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為AD藥物的開發(fā)和臨床治療提供重要的參考意義．預(yù)測(cè)得到的66個(gè)基因中，一些基因是被上述文獻(xiàn)證實(shí)是有效作用于AD的靶基因或與AD直接相關(guān)的靶基因，一些基因則是與腦神經(jīng)相關(guān)的靶基因，而另一些雖沒有被報(bào)道，也為后續(xù)的科學(xué)研究提供可行性依據(jù)．

此外，AD藥物開發(fā)成本高，近幾年許多大公司諸如輝瑞(Pfizer)、強(qiáng)生(JNJ)、禮來(Eli Lilly)和羅氏(Roche)等均為此折戟，同時(shí)這些公司也因巨額的藥物開發(fā)成本而受到非常沉重的打擊．截至目前，始終沒有一款對(duì)AD完全有效，并且適用于所有患者的治療藥物．本次研究預(yù)測(cè)得到6種神經(jīng)類治療藥物和4種非神經(jīng)類治療藥物均已被研究可用于治療AD．Hirohata等研究得到非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs，NSAID)可以抑制來自Aβ的fAβ形成和體外預(yù)先形成的fAβ，對(duì)AD β-淀粉樣蛋白原纖維具有抗淀粉樣變性作用，可有望預(yù)防和治療AD[23]．而本研究預(yù)測(cè)得到可用與治療AD的4種非神經(jīng)類治療藥物除上述地塞米松外，余下3種藥物吲哚美辛、舒林酸和酮洛芬均屬于非甾體抗炎藥．而6種神經(jīng)類治療藥物中，α-氨基異丁酸被Gozes等研究證明可以保護(hù)神經(jīng)元抵抗AD相關(guān)的Aβ1-42毒性，抑制tau衍生肽的聚集[24]．而余下的5種預(yù)測(cè)藥物阿米替林、奧氮平、氯氮平、阿莫沙平和組胺均是靶向與AD有直接關(guān)系的HRH4基因(表2)．低劑量奧氮平似乎對(duì)于治療老年患者的AD引起的行為障礙和精神病癥狀而言是有效的，并有良好的耐受性[25]．而Choi等認(rèn)為氯氮平可作為AD治療多靶標(biāo)方法的候選者[26]．此外，有研究顯示組胺有利于AD病理的治療[27]．

預(yù)測(cè)藥物靶基因的一個(gè)應(yīng)用方面是幫助新藥物的開發(fā)[28]，而藥物靶基因的研究是開發(fā)新藥最重要的一個(gè)組成部分，研究人員可以根據(jù)預(yù)測(cè)的靶基因設(shè)計(jì)并合成作用化合物．隨后進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)，可以有效節(jié)約新藥開發(fā)的時(shí)間經(jīng)濟(jì)成本[29]．藥物靶基因預(yù)測(cè)的另一個(gè)應(yīng)用方面是藥物重新審視定位[28]，通過預(yù)測(cè)靶基因挖掘已知靶向藥物．盡管這些靶向藥物原本被用于治療其他疾病，但對(duì)它們進(jìn)行篩選、修飾或許能夠發(fā)現(xiàn)其具有治療AD的新用途[30]．

綜上所述，本研究預(yù)測(cè)得出的靶基因以及可潛在用于治療AD的藥物，將為AD的臨床藥物治療提供更多的選擇，也為后續(xù)的藥物開發(fā)提供新思路和線索．

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