不同濃度表兒茶素沒食子酸酯對體外培養(yǎng)成骨細胞的影響

謝睿鋒 李 巖 王 東

1.山西醫(yī)科大學，山西太原 030000；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，山西太原 030000

隨著人類壽命的逐漸延長，我國開始進入老齡化國家。骨質(zhì)疏松癥越來越突出地影響老年人的生活質(zhì)量。隨著學者對于氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中的進一步研究，應(yīng)用抗氧化劑茶多酚預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松逐步成為國內(nèi)外研究的新熱點之一。有證據(jù)顯示茶多酚具有抗氧化的作用，可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而減少骨量流失，從而起到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用[1，2]。茶多酚中含有75%～80%的兒茶素，有研究已證實在兒茶素成分中表兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechgin gallate，EGCG）是其中含量最多并且藥用活性最強的成分[3]。本研究通過分離和培養(yǎng)新生SD大鼠顱骨誘導的成骨細胞，研究在體外環(huán)境下EGCG對新生SD大鼠成骨細胞的作用，尋找EGCG的作用濃度，即促進濃度或抑制濃度，為EGCG應(yīng)用于臨床預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

出生3 d內(nèi)的SD大鼠，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。EGCG、Ⅱ型膠原酶、胰酶（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，USA）；胎牛血清（四季青生物工程材料有限公司）；成骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒 （賽業(yè)生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（同仁化學研究所）；VEGF ELISA試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取新生3 d以內(nèi)的健康SD大鼠，處死后在無菌條件下切下顱骨，剝除骨膜等軟組織，將顱骨充分剪碎，PBS沖洗，加入1%的胰蛋白酶消化10 min后加DMEM培養(yǎng)基終止消化，棄去消化液；加入0.2%膠原酶Ⅱ處理30 min，棄去消化液；加入0.2%膠原酶Ⅱ處理60 min，將消化液移入15 mL離心管中，室溫條件下1500 r/min離心5 min；棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 3.5 mL培養(yǎng)液，制成細胞懸液，將細胞懸液移入細胞培養(yǎng)瓶中，放于37℃、5%CO2分壓的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)過程中，常規(guī)隔天換液。待細胞鋪滿瓶底后吸出培養(yǎng)液，用0.25%的胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。使用第三代細胞進行實驗。 用成骨誘導液將 EGCG 配制為：0、1、10、20、30、40 μmol/L。

1.2.2 細胞增殖分析 經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化的第三代干細胞，以細胞數(shù)5×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中， 每孔 100 μL， 孔中分別加入濃度為 0、1、10、20、30和40 μmol/L的EGCG+成骨細胞誘導液，在37℃，體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)；以未行EGCG培養(yǎng)的為空白對照。分別在第 1、4、7、10 天向每孔加入 10 μL的CCK-8溶液，將細胞培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.3 礦化結(jié)節(jié)染色 經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后的第三代細胞，以細胞數(shù)2.5×105個/mL，接種于2塊24孔板中，每孔1 mL，待細胞鋪至孔底70%以上時，更換濃度依次為 0、1、10、20、30 和 40 μmol/L 的EGCG+成骨細胞誘導液，常規(guī)3 d換液1次。分別于誘導培養(yǎng)7 d和14 d吸去培養(yǎng)液，PBS洗 2遍，4% 多聚甲醛固定30 min。采用茜素紅和硝酸銀兩種方法染色，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況，照相保存結(jié)果。

1.2.4 提取細胞蛋白 經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后的第三代細胞，以細胞數(shù)2×106/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL，待細胞鋪至孔底70%以上時，更換濃度依次為 0、1、10、20、30 和 40 μmol/L 的 EGCG+成骨細胞誘導液，常規(guī)3 d換液1次。分別于誘導培養(yǎng)7 d和14 d吸去培養(yǎng)液，提取細胞蛋白，測定蛋白濃度后置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 血管內(nèi)皮生長因子分泌量測定 分別取7 d和14 d提取的蛋白液，于血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA酶標板每孔中各加入標準品（標準品濃度分別為 4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/mL）或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分搖勻后在37℃水浴鍋中培養(yǎng)40 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干；每孔中加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白除外），將反應(yīng)板充分搖勻后37℃水浴鍋中培養(yǎng)20 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干；每孔中加入酶標抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置于 37℃水浴鍋中培養(yǎng) 10 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干；每孔中加入底物工作液100μL，置于37℃在暗處反應(yīng)15min；每孔加入100 μL終止液搖勻，于酶標儀上450 nm處測定吸收度值，并根據(jù)標準曲線計算樣品中VEGF的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對成骨細胞增殖的影響

見圖1。加入EGCG第1天開始出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，隨著培養(yǎng)時間的進展以（10～20）μmol/L濃度組之間增殖作用最強，明顯高于0 μmol/L濃度組。而在30 μmol/L濃度組增殖率開始下降，40 μmol/L濃度組增殖率明顯下降，說明高濃度EGCG對大鼠成骨細胞有抑制作用。各檢測時間點不同EGCG濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表1。此實驗至少重復(fù)三次，均得到相似的結(jié)果。

2.2 礦化結(jié)節(jié)染色分析

見圖2。成骨誘導培養(yǎng)7 d和14 d后，分別用茜素紅染色和硝酸銀染色，可見（10～20）μmol/L濃度組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于其他濃度組。各濃度組間礦化結(jié)節(jié)數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。此實驗至少重復(fù)三次，并且均得到相似的結(jié)果（使用圖像處理系統(tǒng)ImageJ對礦化結(jié)節(jié)沉積區(qū)域進行量化），見表2。

圖1 CCK-8分析成骨細胞在不同濃度EGCG中培養(yǎng)1 d、4 d、7 d、10 d細胞增殖結(jié)果

表1 CCK-8細胞增殖-毒性試驗數(shù)據(jù)（450 nm處的吸光度）（x±s）

圖2 EGCG對成骨細胞礦化的影響

表2 礦化結(jié)節(jié)數(shù)量 （x±s，個/孔）

2.3 ELISA測定VEGF含量

見圖3。在不同濃度EGCG培養(yǎng)液中培養(yǎng)成骨細胞，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）含量同一時間點1 μmol/L EGCG濃度組和空白對照組相比開始出現(xiàn)輕微的促進作用，（10～20）μmol/L濃度組表現(xiàn)出明顯的促進作用，而30 μmol/L及以上濃度組則開始出現(xiàn)抑制作用；隨著培養(yǎng)時間的延長，（10～20）μmol/L濃度組 VEGF含量明顯高于其他各組，40 μmol/L濃度組的抑制作用更加明顯；差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見表3。此實驗至少重復(fù)三次，均得到相似的結(jié)果。

圖3 ELISA測定VEGF含量

表3 ELISA測定VEGF含量（450 nm處的吸光度）（x±s）

3 討論

隨著老齡人口的逐漸增加，骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率出現(xiàn)大幅度提高，嚴重影響著老年人的生活質(zhì)量。國內(nèi)外的研究已證明氧化應(yīng)激與骨質(zhì)疏松發(fā)病有著重要聯(lián)系，體內(nèi)的成骨細胞、破骨細胞等氧敏感細胞的活性和功能均受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species， ROS）的影響[4]。

成骨細胞與破骨細胞的細胞功能的動態(tài)平衡是保證骨骼正常生長的重要前提，當這種平衡被氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧打破時，成骨細胞凋亡增加，成骨細胞數(shù)量減少[5-7]，破骨細胞凋亡被抑制[8-11]，導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

綠茶通過其茶多酚的抗氧化和清除自由基的活性可以起到調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)食欲及大腦功能的作用[12]，常喝綠茶被證實可以降低多種疾病的發(fā)生率，如腫瘤、心血管疾病、糖尿病、過敏癥、哮喘、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肥胖癥等[13-16]。國外研究表明經(jīng)常喝綠茶習慣的絕經(jīng)期婦女，其骨密度高于不經(jīng)常喝茶的絕經(jīng)期婦女[17-19]。同時在臺灣也有類似的相關(guān)報道[20]。

在分子生物學機制方面，有研究顯示EGCG是可以通過目前已知的控制骨骼發(fā)育和骨量的最重要途徑Wnt/β-catenin信號通路來增加ALP活性從而提高成骨細胞的活性[21]。對于破骨細胞的研究顯示EGCG通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9來抑制破骨細胞的活性[22]。

本研究結(jié)果顯示：當體外培養(yǎng)成骨細胞的環(huán)境中存在較低濃度（1 μmol/L）EGCG時，對成骨細胞的生長僅出現(xiàn)輕微的促進作用；當EGCG濃度達到（10～20）μmol/L時表現(xiàn)為對成骨細胞明顯的促進增殖的作用，并且這種促進增殖的作用有隨著作用時間的延長而增強的趨勢，說明該濃度是對成骨細胞最佳的促進濃度；當EGCG濃度達到30 μmol/L及以上時出現(xiàn)對細胞的毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為對成骨細胞生長的抑制作用，同樣抑制作用隨時間的延長而增強。

根據(jù)本研究結(jié)果，當血漿中存在低濃度的EGCG時，開始表現(xiàn)出促進成骨細胞增殖分化的作用，當濃度達到（10～20）μmol/L時，這種促進增殖的作用最明顯，證明該濃度為對體外培養(yǎng)成骨細胞的最佳促進濃度，因此可以認為老年人每天有規(guī)律的飲用綠茶以增加血漿EGCG濃度，從而有效刺激成骨細胞增殖分化，并最終礦化形成骨組織。但是飲用綠茶的量需要適當，當超過促進濃度后，EGCG對成骨細胞的抑制作用開始出現(xiàn)，將會適得其反。

綜上所述，EGCG可以作為成骨細胞生長促進因子，為防治骨質(zhì)疏松提供了一條新途徑。

[參考文獻]

[1]ManoIagas SC．Defense：Scavenging H2O2while making cholesterol[J]．Endocrinology，2008，149（7）：3267-3273.

[2]Shen CL，Wang P，Guerrieri J，et al．Protective effect of green tea polyphenols on bone in middle-aged female rats[J].Osteoporosis Int，2008，19（7）：979-990.

[3]Kim HS，Quon MJ，Kim JA.New insights into the mechanisms of polyphenols beyond antioxidant properties：Lessons from the green tea polyphenol，epigallocatechin 3-gallate[J].Redox Biology，2014，10（2）：187-195.

[4]Mario M，Pamela P，Matteo F，et al.Laser-induced osteoblast proliferation is mediated by ROS production[J].Lasers in Medical Science，2014，29 （4）：1463-1467.

[5]Shen CL，Wang P，Guerrieri J，et al.Protective effect of green tea polyphenols on bone loss in middle-aged female rats[J].Osteoporosis Int，2008，19（7）：979-990.

[6]Baur A，Henkel J，Bloch W，et al.Effect of exercise on bone and articular cartilage in heterozygous manganese superoxide dismutase（SOD2） deficient mice[J].Free Radical Research，2011，45（5）：550-558.

[7]Arai M，Shibata Y，Pugdee K，et al.Effects of reactive oxygen species （ROS）on antioxidant system and osteoblastic differentiation in MC3T3-E1 cells[J].IUBMB Life，2007，59（1）： 27-33.

[8]Bai XC，Lu D，Liu AL，et al.Reactive oxygen species stimulates receptor activator of NF-kappa B ligand expression in osteoblast[J].Biol Chem，2005，280（17）：1497-1506.

[9]Vaaraniemi J，Hallleen JM，Kaarlonen K，et al.Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts[J].Bone Miner Res，2004，19（9）：1432-1440.

[10]Hyeon S，Lee H，Yang Y，et al.Nrf2 deficiency induces oxidative stress and promotes RANKL-induced osteoclast differentiation[J].Free Radic Biology and Medicine，2013，65（6）：789-799.

[11]Kanzaki H，Shinohara F，Kajiya M，et al.The Keap1/Nrf2 protein axis plays a role in osteoclast differentiation by regulatingintracellularreactiveoxygenspeciessignaling[J].Biol Chem，2013，288（32）：23009-23020.

[12]Chung-Hwan Chen，Mei-Ling Ho，Je-Ken Chang，et al.Green tea catechin enhances osteogenesis in a bone marrow mesenchymal stem cell line[J].Osteoporos Int，2005，16（12）：2039-2045.

[13]Liao S，Kao YH，Hiipakka RA.Green tea：Biochemical and biological basis for health benefits[J].Vitam Horm，2001，62（1）：1-94.

[14]YangCS，YangGY，ChungJY，etal.Teaand tea polyphenols in cancer prevention[J].Journal of Nutrition，Springer US，2001，130（2S Suppl）：39-53.

[15]Kao YH，Hiipakka RA，Liao S.Modulation of obesity by a green tea catechin[J].Am J Clin Nutr，2000，72（5）：1232-1234.

[16]Chen Z，Pettinger MB，Ritenbaugh C，et al.Habitual tea consumption and risk of osteoporosis：A prospective study in the women’s health initiative observational cohort[J].Am J Epidemiol，2003，158（8）：772-781.

[17]Hegarty VM，May HM，Khaw KT.Tea drinking and bone mineral density in older women[J].Am J Clin Nutr，2000，71（4）：1003-1007.

[18]HooverPA，WebberCE，BeaumontLF，etal.Postmenopausal bone mineral density：Relationship to calcium intake， calcium absorption， Residual estrogen， body composition，and physical activity[J].Can J Physiol Pharmacol，1996，74（8）：911-917.

[19]Wu CH，Yang YC，Yao WJ，et al.Epidemiological evidence of increased bone mineral density in habitual tea drinkers[J].Arch Intern Med，2002，162（9）：1001-1006.

[20]Mount JG，Muzylak M，Allen S，et al.Evidence that the canonical Wnt signaling pathway regulates deer antler regeneration[J].Dev Dyn，2006，235（5）：1390-1399.

[21]Natsume H，Adachi S，Takai S.（-）-epigallocatechin gallate attenuates the induction of HSP27 stimulated by sphingosine 1-phosphate via suppression of phosphatidyoinositol 3-kinase/Akt pathway in osteoblasts[J].Int J Mol Med，2009，34（1）：197-203.

[22]Oka Y，Iwai S，Amano H，et al.Tea polyphenols inhibit rat osteoclast formation and differentiation[J].J Pharmacol Sci，2012，118（1）：55-64.