豬腸型大腸桿菌病的診斷方法

賈良梁 陳建康 羅靜如

本文是“豬腸型大腸桿菌病的診斷、治療和耐藥性》的第二部分，主要介紹豬腸型大腸桿菌病的診斷方法，組織病理學特征以及鑒別診斷方法。

中圖分類號：S855.1

文獻標志碼：C

文章編號：1001-0769（2018）10-0005-08

1診斷方法

新生仔豬和斷奶仔豬腸型大腸桿菌病的診斷包含不同診斷程序的聯(lián)合應(yīng)用，從觀察臨床癥狀和眼觀病變開始，隨后進行適當?shù)募毦鷮W調(diào)查以及對分離的細菌菌株定性。

1.1臨床癥狀、眼觀病變和采樣

由于腸毒性大腸桿菌造成的新生仔豬腹瀉最常見于O～4日齡的仔豬，通常呈地方性流行;頭胎母豬所產(chǎn)仔豬可能更易感染，因為它們?nèi)鄙俦粍用庖叩谋Ｗo。

由大腸桿菌造成的斷奶仔豬突然腹瀉通常見于斷奶后2周～3周的仔豬，但是見于斷奶后6周～8周的仔豬也并非特例。

當腸毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）造成新生仔豬腹瀉時，我們可以觀察到發(fā)病仔豬會出現(xiàn)大量水樣或含有凝乳塊的腹瀉，散發(fā)出特征性氣味，顏色通常呈白色或黃色。

由ETEC引發(fā)的斷奶仔豬大腸桿菌病通以淡黃色、灰色或淡粉色水樣腹瀉和特征性氣味為特征，病情通常持續(xù)l周（圖1）。

感染豬通常表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退和被毛粗亂黏濕。發(fā)病豬可能會出現(xiàn)突然死亡，尤其是在疾病暴發(fā)伊始。死豬通常脫水，且眼窩深陷;小腸通常擴張、輕度水腫和充血（圖2）。新生仔豬或斷奶仔豬發(fā)生大腸桿菌病后，胃通常膨脹，且分別充滿凝乳塊或干飼料，基底部充血（圖3）。腸系膜淋巴結(jié)腫大，且通常充血。這些病變雖然不具有特異性病征，但仍提示腸型大腸桿菌病。因此，對患有大腸桿菌病的新生仔豬和斷奶仔豬進行剖檢，可幫助病理學者選擇后續(xù)的實驗室檢查方法。

最有效的方法是選擇腹瀉發(fā)病時間不足12 h～24 h的一定數(shù)量（3頭～5頭）的未治療病豬，處以安樂死并進行精準剖檢，從而評價眼觀病變（評價小腸、結(jié)腸、回腸瓣膜、腸系膜淋巴結(jié)）并采樣。采集未剖開且兩端系扎的小腸（尤其是回腸和空腸）和大腸樣本，并送至實驗室（新鮮樣本用于細菌學檢驗，10%福爾馬林緩沖液固定的樣本用于組織學檢查），細菌學檢驗要求分離引發(fā)疫病的致病性大腸桿菌菌株，定量（進行或不進行純化培養(yǎng)）、定性和評估對抗生素的敏感性（圖4）。新鮮樣本應(yīng)當在4℃下儲存，且應(yīng)在采樣后24 h內(nèi)送達實驗室保存。

近期自發(fā)死亡的仔豬也可以用于微生物學分析。由于機體死亡后消化道會迅速自體分解，因此從死亡后4 h～6 h的仔豬上采集的組織樣本通常不適合進行組織病理學分析。如果安樂死或近期死亡的豬未表現(xiàn)出腸型大腸桿菌病的典型臨床癥狀，建議對3頭～5頭豬采集糞便樣本（直接從動物體內(nèi)采集而不是采集排泄在地板上的糞便）或直腸拭子（圖5）。

對多種檢查結(jié)果匯總后方能確診，包括：細菌學定量測定、致病因子鑒定（通常采用PCR方法），以及將病理學檢查作為補充分析，從而對觀察到的顯微病變與檢測到的病原進行綜合的判讀。圖5列出了在診斷腸型大腸桿菌病時應(yīng)當遵循的診斷樹狀圖和診斷標準。

1.2細菌分離株的細菌學檢測和鑒定

腸型大腸桿菌病的診斷是以腸道管腔內(nèi)容物（首選）或直腸拭子樣本的細菌學檢測為基礎(chǔ)的。樣本應(yīng)接種于血瓊脂和麥康凱瓊脂或者其他對腸桿菌科細菌具有選擇性的培養(yǎng)基，如HE瓊脂。這些選擇性培養(yǎng)基可以將能夠發(fā)酵乳糖（如大腸桿菌）的與不能發(fā)酵乳糖的革蘭氏陰性腸桿菌區(qū)分開。固體培養(yǎng)基上的菌落在培養(yǎng)1 d內(nèi)達到它們原有的大小，有光滑型或粗糙型或黏液型的區(qū)別。血瓊脂上菌落的生長特征以及在選擇性培養(yǎng)基上的乳糖發(fā)酵能夠給出第一個判別性標志。特別是，不僅在新生仔豬腹瀉上而且在斷奶仔豬腹瀉中，溶血菌落的存在通常被用作ETEC腹瀉的快速診斷工具（圖6）?？偟膩碚f，從新生仔豬大腸桿菌病病例中分離的ETEC在血瓊脂平板上可能會出現(xiàn)溶血（ETEC F4陽性）或非溶血（ETEC F5、ETEC F6和ETEC F41）菌落。從斷奶仔豬腹瀉病例中分離的ETEC雖然也可觀察到非溶血菌株，但大多數(shù)為溶血菌株（ETEC F4或ETEC F18）。在最近的一項研究中，研究人員報告稱從鑒定為ETEC的斷奶仔豬腹瀉病例中分離到的大腸桿菌菌株有97.6%為溶血菌株。剩余的2.4%非溶血ETEC分離株在法國、意大利和德國分離到，擁有相同的致病型別：F4、STa和STb，這些分離株全部進行了溶血活性檢測。

檢出致病菌株并不說明該病存在于每個病例中，當然，正如上述報道中的那樣，致病性大腸桿菌也可能從健康宿主的腸道棲居環(huán)境中分離到。

因此，對診斷結(jié)果的評估只有在同時考慮了臨床癥狀和病理學觀察結(jié)果這兩種情況后，再結(jié)合分離到的致病性大腸桿菌的定量分析結(jié)果才能給出。因此，分離自小腸（回腸和空腸）的純培養(yǎng)物或接近純培養(yǎng)物中高濃度的致病性大腸桿菌是腸型大腸桿菌病的標志。由于幾乎所有的ETECF4或ETEC F18都是溶血的，出現(xiàn)溶血菌落純培養(yǎng)物可以作為新生仔豬大腸桿菌?。‥TEC F4）或斷奶仔豬大腸桿菌病（ETECF4或ETEC F18）的假定性診斷依據(jù)。

對用抗生素治療的動物其細菌學檢測陰性結(jié)果的判讀不可靠，因此需要對未治療豬進行重新檢查。

鑒定分離株編碼菌毛和毒素的毒力基因?qū)τ诖_定其在所觀察到的臨床癥狀中的作用至關(guān)重要。當前，在診斷程序中，許多實驗室用基因型分析[如聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction， PCR）]檢測編碼毒力因子的基因，從而對該分離株定性。市場上已經(jīng)提供可識別ETEC編碼毒素（STa，STb、LT和EASTl）和菌毛（F4、F5、F6、F18和F41）、腸道致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E.coli， EPEC）外膜蛋白族或黏附素、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌STEC（與水腫病有關(guān)的大腸桿菌）菌株Stx2e毒素的基因引物，并可用于PCR以進行日常診斷。有趣的是某些F18菌株既能產(chǎn)生腸毒素又可產(chǎn)生Stx2e毒素。這些菌株被歸為ETEC而非STEC，因為它們在臨床上引發(fā)的斷奶仔豬腹瀉遠多于水腫病。

應(yīng)用終點PCR直接鑒定病豬樣本中毒力因子，而不是對各個分離株進行半定量細菌學檢測和分型，可能會使判讀變得困難且不可靠。這種診斷方法并不能對病原進行定量，可以給出屬于出現(xiàn)在樣本中的各種大腸桿菌菌株的所有可檢測毒力因子的混合結(jié)果，結(jié)果無法將這些因子組合起來。此外，不能排除檢測到其他腸桿菌科細菌的相似毒力因子基因。例如，對分離自墨西哥兒童腹瀉病例的細菌菌株進行的研究表明，一株被鑒定為M.morganii菌株的ST毒素基因與大腸桿菌的一個ST毒素基因100%相同。研究人員先前報道的可編碼LT毒素的基因?qū)儆趶母篂a游客糞便樣本中分離的M.morganii菌株。

定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）的發(fā)展已經(jīng)成為一項可以單獨進行或與細菌學檢測一起進行的切實可行的診斷方法。Stahl和其同事報道，當與培養(yǎng)來自腹瀉豬糞便樣本中的大腸桿菌F4和E18方法相比較時，此qPCR方法具有更高的靈敏性。細菌培養(yǎng)法未能檢測到致病性大腸桿菌，而采用此方法后34%的樣本呈F4-qPCR和/或F18-qPCR陽性。當檢測到的大腸桿菌F4和/或大腸桿菌F18含量高于l0⁷CFU/g時，表明培養(yǎng)了大量的條件致病性大腸桿菌。雖然用qPCR對致病性大腸桿菌進行定量檢測是一種診斷腸型大腸桿菌病的有應(yīng)用前景的方法，但是半定量細菌學檢測方法對于引發(fā)大腸桿菌病的大腸桿菌菌株的分離和抗菌藥敏感性實驗仍具有至關(guān)重要的作用。

通常，F(xiàn)4陽性大腸桿菌的暴發(fā)在任何時候往往只有一種菌株參與，哪怕我們在同一次暴發(fā)中觀察到了混合感染且分離到了不同的致病型別菌株。在這些病例中，一種致病型別菌株很可能在任何暴發(fā)中占據(jù)著主導作用。因此，最合適的做法是，在定量細菌學檢測之后且與檢測成本相稱的情況下，對從發(fā)病豬群中不同豬上分離到的更多分離株進行分型，從而確定某一次暴發(fā)的腸型大腸桿菌病病例是否涉及一種以上的致病型別。例如，明智的做法是檢測來自5頭典型腹瀉豬的樣本并對根據(jù)培養(yǎng)和生化特性選擇的3個分離株進行定型。雖然，這種方法不會給出確切的結(jié)果，但是其的確會提高所獲結(jié)果的可信度。

在斷奶仔豬腹瀉暴發(fā)期間，研究人員按照上述報道的采樣方法對歐洲160個豬群進行了一項研究，結(jié)果研究人員在該次暴發(fā)中觀察到了13%的患病豬有混合感染（ETECF4和ETEC F18）（數(shù)據(jù)未發(fā)表）（圖7）。

致病性大腸桿菌也可以通過O抗原（細胞壁LPS）的血清分型進行鑒定，因為少數(shù)特異性0血清群能夠引發(fā)該?。ū?）。

H抗原（鞭毛蛋白抗原）和0抗原的所有血清分型，以及除此之外K抗原（莢膜多糖）的鑒定，是所有血清型標準的鑒定方法，但是通常在少數(shù)參考實驗室中進行。

一個血清群中不同的菌落可能已經(jīng)進化，產(chǎn)生了不同致病基因，造成與特定地區(qū)或國家有關(guān)的克隆變異。例如，與全球范圍內(nèi)菌毛F18 ab相關(guān)的ETEC 0139血清群，通常會在澳大利亞引發(fā)斷奶仔豬腹瀉，在歐洲引發(fā)豬的OD，而與世界范圍內(nèi)豬中的斷奶仔豬腹瀉相關(guān)的優(yōu)勢血清群是0149（表2）。

2 組織病理學

對福爾馬林固定、石蠟包埋的組織（應(yīng)該包括回腸、空腸和大腸）進行組織病理學檢測可以用作大腸桿菌病確診的一種補充性調(diào)查法。在發(fā)生新生仔豬大腸桿菌病的仔豬體內(nèi)，我們可以觀察到F4陽性腸毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）附著于空腸和回腸的大部分腸黏膜上皮細胞刷狀緣膜上，而其他ETEC主要附著于空腸遠端或回腸。其他變化包括血管充血、出血和炎性細胞（腸道固有層中的中性粒細胞和巨噬細胞）數(shù)量增多。ETEC型斷奶仔豬腹瀉（Postweaning Diarrhoea，PWD）的顯微病變以在回腸和很少一直在空腸段頂層絨毛上皮細胞的斑點（patch）上觀察到的細菌層為特征。在腸道固有層淺表部位可觀察到絨毛輕度萎縮和中性粒細胞數(shù)量增多。免疫組織化學法和原位雜交熒光法可以用作確診觀察到的顯微病變的病原學方法。

表3列出了用于鑒定分離自新生仔豬和斷奶仔豬大腸桿菌病病例的大腸桿菌菌株的標準和方法。

3 鑒別診斷（表4）

豬暴發(fā)的腸道病通常是由多因子引起的。注重診斷和隨后的控制措施而不考慮所有可能的鑒別診斷或涉及的多種因素可能會誤導執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師的判斷。新生仔豬和斷奶仔豬大腸桿菌病的診斷評價要求采用相似的標準診斷程序。如果剖檢時觀察到的病變非常具有指向性，那么診斷路徑很容易執(zhí)行，這適用于腸型大腸桿菌病。根據(jù)記錄到的病理損傷，細菌學檢測通常可以對得到的初步結(jié)論輕易確診。仔豬斷奶前的腹瀉比斷奶后的腹瀉更易直接地鑒定、治療和預防。尤其是ETEC造成的新生仔豬腹瀉必須與引發(fā)腹瀉的其他病原相區(qū)別，如艱難梭菌、A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、腸內(nèi)冠狀病毒[傳染性胃腸炎病毒（Transmissible GastroenteritisVirus，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemic Diarrhea Virus，PEDV）]和輪狀病毒（A群、B群和C群）。對于年齡大于7日齡的仔豬，它們的鑒別診斷還應(yīng)該考慮由豬等孢子球蟲造成的球蟲病。

ETEC造成的斷奶仔豬腹瀉應(yīng)與已經(jīng)在仔豬中確診過的其他腹瀉的病因相區(qū)別，如腸道致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）、腸內(nèi)冠狀病毒（TGEV、PEDV）、輪狀病毒（A群、B群和C群）、沙門氏菌、引發(fā)增生性腸病的胞內(nèi)勞森菌和短螺旋體屬（表5）。