拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NRRL—B593在三種不同培養(yǎng)基中乙醇脫氫酶活力的測定

朱曉 鄒琪琪 張鋒

摘 要：拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii〗）NRRL-B593在葡萄糖基質中可以代謝產(chǎn)生丁醇、乙醇、異丙醇。乙醇脫氫酶（ADH）是產(chǎn)生醇類的關鍵酶，比較了拜氏梭菌（C. beijerinckii）NRRL-B593在葡萄糖基質與氨基酸基質中ADH活性，為進一步研究該菌株的代謝及表達調(diào)控提供理論基礎。首先通過監(jiān)測C.beijerinckii NRRL-B593在不同培養(yǎng)基中D600值，繪制生長曲線，后在8000 r/min，10min下收集對數(shù)期與穩(wěn)定期的細胞，利用厭氧型細胞破碎儀French Press獲得無細胞抽提物（CFE），最后通過Bradford法測量蛋白質含量，在厭氧條件下利用丙酮為底物，NADPH依賴型的氧化反應測其酶活力。結果顯示，穩(wěn)定期的ADH酶活力遠遠高于對數(shù)期酶活力高，氨基酸培養(yǎng)基中的ADH酶活力高于葡萄糖培養(yǎng)基。

關鍵詞：拜氏梭菌；乙醇脫氫酶；代謝；培養(yǎng)基

中圖分類號：Q93文獻標識碼：A

Abstract：Clostridium beijerinckii NRRL-B593 grows on glucose and is capable of producing butanol， ethanol and isopropanol. Alcohol dehydrogenase （ADH） is a key enzyme catalyzing the production of alcohols.This article compared its ADH activities when it would grow on carbohydrates and peptides，and did the foundation for futher studying AHD. Clostridium beijerinckii NRRL-B593growth was monitored using optical density at 600 nm. The growth curves were obtained using different substrates. Cells grown at log phase and stationary phase were harvested using centrifugation（8000×g，10mins）， and cell free extract （CFE） was prepared using a French Press. Protein concentration was determined using the Bio-Rad assay.The ADH activity was measured under anaerobic conditions following the acetone-dependent oxidation of NADPH.ADH activity in the CFE fromC. beijerinckii NRRL-B593 cells grown on tryptone was higher than that from the cells grown on glucose.

Keywords：Clostridium beijerinckii NRRL-B593；ADH；metabolism； substrates

在C. beijerinckii所有菌株中，乙醇脫氫酶負責催化產(chǎn)生丁醇和乙醇，而有些菌株像C. beijerinckii NRRL-B593能利用乙醇脫氫酶催化丙酮產(chǎn)生異丙醇[1]，這些代謝產(chǎn)物在工業(yè)、食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中應用廣泛，而且乙醇脫氫酶可用于醫(yī)學分析、工業(yè)生產(chǎn)等方面[2]。目前我國高純度的乙醇脫氫酶尚需依賴進口，價格昂貴。通過微生物發(fā)酵獲取乙醇脫氫酶，是實現(xiàn)其大規(guī)?；a(chǎn)的一條重要途徑[3]。乙醇脫氫酶是一種含鋅金屬酶，其活性位點含有兩個反應性巰基以及一個組氨酸殘基，需要NAD （H）、NADP（H）作輔酶轉移電子進行催化反應，而在C. beijerinckii NRRL-B593中依靠NADPH作為輔酶[4]，是醇類代謝的關鍵酶。國內(nèi)外文獻已經(jīng)報道對Clostridium beijerinckii NRRL-B593在葡萄糖基質中酶活力的研究，YAN[5]等人利用混合培養(yǎng)基測得乙醇脫氫酶活力（丙酮反應成異丙醇）最高為0.25μmol·min-1·mg-1，但是在無葡萄糖培養(yǎng)基例如蛋白胨培養(yǎng)基中C.beijerinckii NRRL-B593的ADH的酶活力的研究尚未見報道。實驗比較了該菌株在三種不同培養(yǎng)基中ADH酶活力，為深入研究該菌株的代謝及ADH酶活性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NRRL-B593來自于加拿大滑鐵盧大學生物系實驗室。

混合培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，酵母浸出液10g/L，葡萄糖5g/L，無機鹽溶液40mL/L，刃天青0.001g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5g/L。

葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L，無機鹽溶液40mL/L，刃天青1mg/L。

蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，無機鹽溶液40mL/L，刃天青1mg/L。

MBI Sigma 3-18K離心機，Manifold，厭氧破碎細胞儀French Press FA-078A 120 VAC，60 Hz（美國fisher scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將上述三種不同培養(yǎng)基分別倒入100mL小瓶中，121℃下 20min滅菌，在Manifold中脫氣1h，后打開氮氣罐注入氮氣 7min，然后脫氣7min，循環(huán)3次，確保瓶中的氧氣被氮氣取代。從Manifold上取下小瓶，最后加入L-cysteine-HCl，溶液由紅色變?yōu)榈S色或者無色，證明瓶中處于無氧狀態(tài)，調(diào)整pH到7，接入1%菌液（混合培養(yǎng)基中對數(shù)時期細胞），30℃恒溫培養(yǎng)，測定D600，獲得不同培養(yǎng)基的生長曲線（見圖1）。

1.2.2 收集細胞及ADH酶活力的測定

收集對數(shù)期和穩(wěn)定期時期的細胞，將菌液倒入50ml離心管，4℃，8000 r/min，10min離心，收集細胞，1g菌體加入到5ml已脫氣的溶菌液中，繼續(xù)脫氣進氣，使瓶中充滿氮氣，利用厭氧細胞破碎儀破碎細胞，后以丙酮作底物，NADPH做輔酶測其ADH酶活力。

Acetone + NADPH + H+ NADP+ + H2O + 2-propanol

[JP+1]帶塞比色皿提前脫氣2min后進氣2min，重復兩次，與分光光度計相連的水浴鍋，提前調(diào)到45℃。首先將已脫氣的測量緩沖液2mL加入到帶塞比色皿中，放入分光光度計中預熱到45℃，然后加入20 μL 1M丙酮溶液和40 μL 0.2mM NADPH溶液，混勻后加入100 μL無細胞抽提物，快速混勻后放入恒溫分光光度計中，每隔10s連續(xù)測量3min 340nm下的吸光光度值，無丙酮或者無NADPH作為陰性對照，計算ADH酶活力[6]。

ADH 酶活力的定義（U）：在45℃，pH 7.5下，每分鐘轉化1μM NADPH變?yōu)楫惐挤Q為一個酶活力單位

1.2.3 Bradford法測蛋白質濃度

Bradford[7]法用來測定溶菌細胞液的蛋白質含量，100μL溶菌細胞液13000 r/min，5min離心后取上清液，取10μL無細胞抽提物置于離心管中，加入790μL無菌水，200μL BioRad，室溫下30min后測其595nm下的吸光值。

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 該菌株在不同培養(yǎng)基中的生長曲線

從圖中可見，在葡萄糖基質中生長最慢，在混合培養(yǎng)基中生長最快，蛋白胨培養(yǎng)基介于中間。

2.1.2 該菌株在混合培養(yǎng)基中穩(wěn)定期和對數(shù)期的ADH酶活力大小

由于混合培養(yǎng)基中的細胞更容易收集，以在混合培養(yǎng)基為例，比較穩(wěn)定期與對數(shù)期的酶活力，由圖可見穩(wěn)定期吸光值下降很快，比酶活力分別為0.172U/mg，0.0386U/mg。

酶活力 = U =ΔA340/minx加樣總體積（mL）6.22x樣品體積（mL）

比酶活力 = U/mg=U（總活力）蛋白質含量（mg）

酶比活力是指每毫克蛋白質所具有的酶活力單位數(shù)

2.1.3 該菌株在不同培養(yǎng)基中的穩(wěn)定期ADH酶活力的大小

在以上優(yōu)化條件的基礎上，比較不同培養(yǎng)基的酶活力，由圖可見，三種培養(yǎng)基在340nm下吸光值變化較為一致，比酶活力分別為0.172U/mg，0.137U/mg，0.107U/mg。綜上所述，蛋白胨培養(yǎng)基中的酶活力高于葡萄糖基質中的ADH酶活力，但低于混合培養(yǎng)基。說明C. beijerinckii NRRL-B593能利用蛋白質生成丙酮酸，進而形成醇類等代謝產(chǎn)物，后續(xù)實驗將比較不同培養(yǎng)基的ADH酶活力與代謝產(chǎn)物之間的關系。

3 討論

結果顯示Clostridium beijerinckii NRRL-B593在混合培養(yǎng)基中生長最快，蛋白胨培養(yǎng)基介于中間，在全葡萄糖培養(yǎng)基中生長最緩慢。說明蛋白質培養(yǎng)基相比葡萄糖培養(yǎng)基更利于該菌株的生長，而混合培養(yǎng)基中兼有糖類與蛋白質，滿足了該菌株生長所需要的所有的營養(yǎng)成分，因此在混合培養(yǎng)基中的生長速度最優(yōu)。

該菌株在穩(wěn)定期ADH酶活力遠遠高于對數(shù)時期酶活力。說明該菌株在穩(wěn)定時期更易積累代謝產(chǎn)物。通過比較三種培養(yǎng)基中ADH酶活力的大小，蛋白胨培養(yǎng)基中的酶活力要高于葡糖糖基質中的酶活力，酶比活力達0.137U/mg，說明蛋白胨培養(yǎng)基更適于該菌株的代謝，可以為以后發(fā)酵利用蛋白質廢棄物和獲得高產(chǎn)ADH酶提供良好的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Kasap， M.Nitrogen metabolism and solvent production in Clostridium beijerinckii B593.Dissertation：Virginia Polytechnic Institute and State University.2002.

[2] Hiu， S.F.， Zhu， C.X.， Yan， R.T.， and Chen， J.S.Butanol-Ethanol Dehydrogenase and Butanol-Ethanol-Isopropanol Dehydrogenase： Different Alcohol Dehydrogenases in Two Strains of Clostridium beijerinckii （Clostridium butylicum）. Appl. and Environ. Microbiol.1987，53（4）： 697-703.

[3]孫珊，汪維云.一株拜氏梭菌利用甘蔗廢糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇[D].生物加工過程，2012，10（03）：6-11.

[4]Chen， J.S.Alcohol dehydrogenase： multiplicity and relatedness in the solvent-producing clostridia. FEMS microbiology reviews，1995，17（3）： 263-273.

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[6] Ismaiel， A.A.， Zhu， C.X.， Colby， G.D.， Chen， J.S.Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of C. beijerinckii. Journal of Bacteriology，1993，175（16）： 5097-5105.

[7] Bradford， M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.1976，72： 248-254.

作者簡介：朱曉（1991-），女，碩士，主要研究方向：微生物發(fā)酵。