蘑菇種植中污染菌產(chǎn)黃青霉的拮抗菌篩選及中藥和多菌靈對其抑制作用的研究

王藝璇 吳文杰 戴斯婷

摘 要：本實驗為減少蘑菇種植中產(chǎn)黃青霉的污染，進行了從土壤中分離純化出了產(chǎn)黃青霉的拮抗菌，及中藥黃柏、苦參及多菌靈和中藥正交對污染菌的抑制作用等實驗。從而需找一種生物防治或中藥和農(nóng)藥結(jié)合防治的環(huán)保方法，以此來解決農(nóng)藥對環(huán)境造成的污染及食用菌上的農(nóng)藥殘留問題。實驗結(jié)果表明，中藥與多菌靈結(jié)合使用，比中藥單獨使用對產(chǎn)黃青霉的抑制效果更明顯。其中，黃柏與多菌靈的最佳組合濃度是黃柏濃度為0.25g/mL，多菌靈濃度為0.1%。苦參與多菌靈的最佳組合濃度是苦參濃度為0.016g/mL，多菌靈濃度為0.1%。土壤中通過直接堆砌法分離出的接抗菌經(jīng)鏡檢，可以初步確定是屬于根霉屬。

關(guān)鍵詞：蘑菇；產(chǎn)黃青霉；中藥；拮抗菌；抑制

蘑菇，是人們較為熟知一種食用菌。各地的叫法都不同，統(tǒng)稱為蘑菇。蘑菇富含18種氨基酸和多種維生素，礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、無機質(zhì)等營養(yǎng)成分。具有益氣開胃，拖痘疹，抗癌及降血糖等作用。蘑菇是冬季種植的食用菌[1]，蘑菇還是有一定的經(jīng)濟價值及營養(yǎng)食用價值。但在種植食用菌的時候，其最大的敵人是雜菌污染，輕則減產(chǎn)，重則絕收，會給菇農(nóng)造成不小的經(jīng)濟損失。其中，產(chǎn)黃青霉的污染是在眾多污染中比較嚴重的雜菌污染。一般菇農(nóng)采取的措施都是噴灑農(nóng)藥，雖能使污染得到有效的處理，但往往都會造成農(nóng)藥殘留，直接影響到質(zhì)量。隨著人們環(huán)保意識的增加，還有對農(nóng)藥負面影響的了解，既能達到高效殺死作物污染菌又能維護生態(tài)平衡以得到安全優(yōu)質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品稱為人們關(guān)注的焦點[3][4]。尋求中藥或中藥與農(nóng)藥相結(jié)合，通過減少農(nóng)藥含量來減少對環(huán)境的污染是本研究的目的。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

廣東省微生物菌種保藏中心購買的產(chǎn)黃青霉真空冷凍干燥菌種；白蘑菇；泉州市區(qū)中藥店購買的黃柏、苦參；有效成分為50%的可濕性粉劑多菌靈；PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基，實驗室自備；堿性品紅、美藍晶體，氫氧化鉀等，購于泉州化學(xué)藥品店。

1.2 儀器

培養(yǎng)基制備需要的各種玻璃器材[5]，移液槍，水浴鍋（數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-6國華企業(yè)），恒溫箱（生化培養(yǎng)箱SPX-25OB-Z，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-30 SII立式壓力蒸汽滅菌器），恒溫振蕩器（國華企業(yè)SHA-B），無菌臺（SW-CJ-IF潔凈工作臺）等。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 產(chǎn)黃青霉真空冷凍干燥菌種的菌種活化

菌株恢復(fù)培養(yǎng)：用無菌的移液槍吸取適宜無菌水滴入安瓿瓶管內(nèi)，輕輕震蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。后吸取該菌液滴加在已無菌PDA平板上，涂布，在28℃的恒溫箱中培養(yǎng)，獲得純種產(chǎn)黃青霉[6]。

2.2 拮抗菌的篩選及鑒別

土壤分離微生物：選取土樣，然后參考《現(xiàn)代食品微生物學(xué)實驗技術(shù)》中的土壤微生物分離、純化的實驗方法，獲得各種微生物[5]。

拮抗實驗：采用直接堆砌法觀察抑菌圈的大小進行篩選：獲得純種產(chǎn)黃青霉后挑取單個菌落于液體培養(yǎng)基進行恒溫振蕩培養(yǎng)，24h后分別稀釋成10倍、100倍、1000倍制成不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，再用移液槍分別吸取產(chǎn)黃青霉的菌懸液100μL均勻涂布在PDA平板上，依次挑取從土壤中分離、純化的單個菌落放入已經(jīng)涂布了產(chǎn)黃青霉的PDA平板中，在適宜的溫度下培養(yǎng)。觀察有無拮抗現(xiàn)象，有無抑菌圈，來篩選出拮抗菌[7]。因?qū)嶒炂鞑挠邢?，且分離、純化的微生物種類又多，所以最初篩選時，每種從土壤中分離出的菌落做一個平板，有疑似拮抗效果的在做3個重復(fù)。

鑒別：通過形態(tài)的觀察[7]以及鏡檢，確定拮抗菌所在的屬，進行初步確定。

2.3 中藥濃度的確定及制備

中藥的熬煮：稱取100g中藥（黃柏/苦參），加適量蒸餾水浸泡30min，用大火煮沸，在小火保持微沸30min，過濾，濾液備用。藥渣再加適量蒸餾水煎煮30min，濾過，將兩次的濾液合并，用水浴鍋濃縮至100mL，此時的中藥生藥量為1g/mL[8]。

濃度的稀釋：取10支無菌試管，依次編號，分別在2～10號管中加無菌蒸餾水10mL。取1g/mL的中藥原液20mL于1號管中，從1號管中取10mL于2號管中，混勻，再從2號管中取出10mL稀釋液加到3號管中混勻。照此方法稀釋至第9號管，取出10mL棄掉。第10號管只有無菌蒸餾水做空白對照[8]。

2.4 中藥對蘑菇菌絲生長的影響

蘑菇菌懸液的制備：將購買于市場上的白蘑菇，用酒精將表面清洗干凈后，用滅菌的鑷子將蘑菇的子實體剪碎成細小塊，泡在無菌蒸餾水中，得到蘑菇的菌懸液[9]。

中藥對蘑菇菌絲生長的影響：將蘑菇的菌懸液100μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，后用采用打孔法，在培養(yǎng)基上打孔，分別在孔內(nèi)注入各種濃度的中藥藥液100μL，并標記。接種完成后，將平板放在28℃的恒溫箱中培養(yǎng)。每個濃度做3個平板，每個平板上有兩個重復(fù)。

2.5 多菌靈與中藥正交實驗

多菌靈濃度的設(shè)置：根據(jù)周傳富等人的研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈的濃度不宜超過0.3%，否則會抑制食用菌菌絲的生長[10]。同時徐方旭、楊文欽等人的研究則表明食用菌中應(yīng)首選多菌靈、克霉靈和生石灰等，其主要使用體積分數(shù)為0.07%～0.10%，對個別食用菌可選擇性地使用體積分數(shù)為0.20%的藥物，在生產(chǎn)上不能盲目使用[11][12][13][14]。根據(jù)中藥對產(chǎn)黃青霉的抑制作用來篩選出有抑制作用的濃度，在根據(jù)文獻來具體設(shè)置需要的多菌靈的濃度。一般在0.1%～0.2%之間。

正交試驗的設(shè)置：根據(jù)篩選出的中藥濃度，并以此設(shè)置的多菌靈濃度，參考統(tǒng)計書[15]上的正交表，設(shè)置正交試驗。

2.6 結(jié)果與分析

（1）拮抗菌的確定。

接抗菌的篩選結(jié)果：從土壤中分離純化的各種微生物分別接種在涂布了1*10-2濃度的產(chǎn)黃青霉的PDA平板上，其中編號為b的平板上有明顯的抑菌圈，其余平板均無抑菌圈。

形態(tài)觀察：接種在PDA培養(yǎng)皿上，放在28℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后就發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面已經(jīng)全部覆蓋了白色的菌絲，且無定形菌落。繼續(xù)培養(yǎng)一段時間以后，白色菌絲慢慢變成淡灰色的菌絲。

鏡檢：采用堿氏品紅染液和呂氏堿性美蘭兩種分別對拮抗菌進行簡單染色[5]，后在顯微鏡下由低—高倍鏡觀察。發(fā)現(xiàn)拮抗菌的菌絲無隔膜，有分枝、假根、孢子囊。

（2）拮抗菌對蘑菇菌絲生長的影響。

拮抗菌對蘑菇菌絲生長的影響：在涂布了蘑菇菌懸液的PDA平板上，接種b號平板上挑取的單個菌落，放于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后，可觀察到?jīng)]有抑菌圈如圖4。說明從土壤中分離出的產(chǎn)黃青霉的拮抗菌對蘑菇菌絲的生長并無抑制作用。

（3）中藥對產(chǎn)黃青霉生長的影響。

黃柏對產(chǎn)黃青霉生長的影響：接種24h后可以觀察到所有平板都布滿了產(chǎn)黃青霉的白色菌絲，其中只有2、3號平板有明顯的抑菌圈，對應(yīng)的即是黃柏的濃度分別為0.5g/mL、0.25g/mL。

苦參對產(chǎn)黃青霉生長的影響：在涂布了10-2濃度的產(chǎn)黃青霉的平板上，經(jīng)過24h可以觀察到同樣布滿了白色菌絲，其中只有6、7、8三個平板有明顯的抑菌圈，即對應(yīng)苦參的濃度為0.016g/mL、0.008g/mL、0.004g/mL。

（4）中藥對蘑菇菌絲生長的影響。

黃柏對蘑菇菌絲生長的影響：接種24h后，可以明顯看到PDA平板上布滿菌絲，在注滿黃柏藥液的孔洞周圍有明顯的抑菌圈，但黃柏濃度不同，抑菌圈的大小也不同。黃柏濃度為0.25g/mL時，蘑菇菌絲的抑菌圈直徑為1.12cm左右，而濃度為0.5g/mL時，蘑菇菌絲的抑菌圈直徑為1.32cm左右。

苦參對蘑菇菌絲生長的影響：同樣接種24h后可以明顯看到PDA平板上布滿菌絲，孔洞的周圍同樣有明顯的抑菌圈。接種六號管苦參的平板上抑菌圈的直徑大小大概為1.23cm，接七號管苦參的抑菌圈直徑在1.48cm左右，而接八號管苦參的抑菌圈直徑大概在1.30cm。

（5）多菌靈與中藥正交對產(chǎn)黃青霉生長的影響。

結(jié)果表明：在黃柏與多菌靈正交中，P=0.001<0.01，所以黃柏與多菌靈共同作用中最佳組合濃度對產(chǎn)黃青霉的抑制具有極顯著影響，即黃柏濃度為0.25g/mL，多菌靈濃度為0.1%。

結(jié)果表明：在苦參與多菌靈正交中，P=0.993>0.05，所以苦參和多菌靈共同作用的最佳對產(chǎn)黃青霉的抑制沒有顯著影響。

3 結(jié)論

黃柏和苦參在一定濃度的時候?qū)Ξa(chǎn)黃青霉還是有一定的抑制作用，并且特定濃度的抑制效果還是很明顯的。黃柏的十個濃度梯度中，只有0.5g/mL、0.25g/mL兩個濃度對產(chǎn)黃青霉有抑制效果，其中0.5g/mL的效果最好，抑菌圈的直徑大小平均達到1cm，0.25g/mL的抑制效果略差些。而苦參的只有0.016g/mL、0.008g/mL、0.004g/mL三個濃度對產(chǎn)黃青霉有抑制效果，其中效果最好的是0.004g/mL，抑菌圈平均直徑達到2.0cm。黃柏與農(nóng)藥多菌靈共同作用的效果會明顯些，其最佳濃度組合為黃柏濃度為0.25g/mL，多菌靈濃度為0.1%。拮抗菌對產(chǎn)黃青霉的抑制效果，從抑菌圈來看，平均直徑是1.6cm，而藥劑對產(chǎn)黃青霉作用產(chǎn)生的抑菌圈的平均直徑是1.85cm。從數(shù)據(jù)上來看，還是藥劑對污染菌的抑制效果強些。但效果并不會差太多，如果從環(huán)境保護方面來說，使用拮抗菌來減少污染菌產(chǎn)黃青霉更為理想。

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項目名稱：福建省中青年教師教育研究課題“泉州市食用菌栽培中有效抗霉抗菌的綠色防控技術(shù)研究”項目編號：JA12276