淺析紅細(xì)胞凝集抑制試驗的影響因素

胡燕玲 高習(xí)文

摘要：在獸用生物制品特別是獸用疫苗產(chǎn)品檢驗過程中，紅細(xì)胞凝集抑制試驗在禽滅活疫苗效力檢驗和禽抗體效價測定中應(yīng)用廣泛，是一個非常基礎(chǔ)的常規(guī)的試驗。但是在試驗操作中由于其影響因素較多，很容易造成試驗結(jié)果的偏差，對檢驗結(jié)果造成影響，因此就紅細(xì)胞凝集抑制試驗的影響因素進(jìn)行分析，給疫苗檢驗操作人員提供參考，以減少彎路。

關(guān)鍵詞：紅細(xì)胞凝集抑制試驗；影響因素；獸用生物制品

中圖分類號：S852.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）08-0014-01

紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）的原理為雞紅細(xì)胞表面存在受體，而某些病毒如雞新城疫病毒等能與雞紅細(xì)胞表面受體結(jié)合而產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，稱為紅細(xì)胞凝集（HA），而當(dāng)這種病毒與相應(yīng)的特異性抗體相結(jié)合后，這種凝集現(xiàn)象則被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制試驗。試驗依據(jù)：中國獸藥典（2015年版）三部附錄3404。根據(jù)經(jīng)驗，有以下幾個主要影響因素需要檢驗人員在試驗中注意。

1 試劑及器材

整個實驗過程中均應(yīng)按照獸藥典要求使用PBS（O.l mol/L，pH 7.0—7.2，下同），而不是生理鹽水，因PBS緩沖能力較好，實驗結(jié)果較為穩(wěn)定。

操作過程中使用的器材有：50孔反應(yīng)板、96孔反應(yīng)板、移液器、槍頭、平皿或移液槽等。

移液器應(yīng)選用品牌的單道或多道移液器，配套使用品牌移液器槍頭，若槍頭不配套則加液量可能不準(zhǔn)，影響實驗結(jié)果。使用過程中應(yīng)嚴(yán)格按照移液器說明書要求使用，使用后應(yīng)旋至最大刻度處保存，并定期校驗，合格方可使用。槍頭應(yīng)一次性使用，不能清洗后再重復(fù)使用。反應(yīng)板、平皿或移液槽等均應(yīng)清潔，使用后應(yīng)立即清洗干凈。若條件允許可選用一次性使用反應(yīng)板或器皿，一次性使用。對于重復(fù)使用的50孔或96孔反應(yīng)板，應(yīng)在試驗操作結(jié)束后立即清洗。清洗方法為：棄去液體（棄人含有消毒液的盆或桶中），用純化水沖洗各孔，用75%酒精棉球擦拭各孔，然后用純化水沖洗干凈，烘干或自然晾干后備用。注意用棉球擦拭反應(yīng)板時，應(yīng)避免刮傷反應(yīng)孔。對于初學(xué)者建議使用50孔板進(jìn)行試驗，反應(yīng)結(jié)果觀察更為清晰準(zhǔn)確，易判定。

2 1%雞紅細(xì)胞懸液

若配制的1%紅細(xì)胞濃度偏高，則紅細(xì)胞凝集試驗（HA）反應(yīng)結(jié)果血凝價會偏低，紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）反應(yīng)結(jié)果抗體效價偏高；若配制的1%紅細(xì)胞濃度偏低，則紅細(xì)胞凝集試驗（HA）反應(yīng)結(jié)果血凝價會偏高，紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）反應(yīng)結(jié)果抗體效價偏低。因此紅細(xì)胞配制濃度對反應(yīng)結(jié)果的影響至關(guān)重要。而影響紅細(xì)胞懸液濃度的因素分別有紅細(xì)胞保護(hù)液（阿氏液）、采血過程，紅細(xì)胞離心配制過程等。

2.1 阿氏液

阿氏液成分為檸檬酸鈉8g，檸檬酸0.325 g葡萄糖20.5g，氯化鈉4.2 g加純化水至1000 mL。

因檸檬酸的用量較少，稱量要求較為精確，因此應(yīng)選擇至少精確至0.001 g的電子天平進(jìn)行稱量；因其中含有較多的葡萄糖，因此不宜采用較高的溫度和壓力進(jìn)行滅菌，適宜的方法為流通蒸氣滅菌3次，每次30 min，可室溫保存使用。

2.2 采血過程

最好選用2～4只2～6月齡的SPF雞，用一次性或滅菌的5 mL注射器，翅下靜脈采血，抽取血液時速度不能太快也不能太慢，避免溶血及凝血，采血后應(yīng)立即取下針頭將血液緩緩?fù)迫氲攘康陌⑹弦夯蚵远嘤谘毫康陌⑹弦褐?，輕輕搖勻備用。應(yīng)避免用針頭直接將血液推入阿氏液中，防止造成溶血。采血后應(yīng)用干棉球按壓采血部位進(jìn)行止血。

2.3 1%紅細(xì)胞配制

采血后血液置阿氏液中4℃保存或直接離心。離心時應(yīng)采用1500 r/min離心5—10 min，然后用PBS洗滌3～4次。盡量不使用生理鹽水洗滌，因PBS有緩沖作用，能避免在離心過程中造成溶血。每次洗滌時應(yīng)盡可能的棄凈上清，在最后一次離心過程中時間一定要達(dá)到10 min以上，使紅細(xì)胞沉積較為堅實。因無法完全棄凈紅細(xì)胞泥上層的白細(xì)胞層及上清，因此在最后吸取紅細(xì)胞泥時，應(yīng)將吸管或吸頭插入離心管底部吸取，確保抽取的全部為紅細(xì)胞，加入紅細(xì)胞后應(yīng)在瓶中無紅細(xì)胞泥處反復(fù)輕輕吹吸洗凈吸管或吸頭中黏附的紅細(xì)胞。配制好的紅細(xì)胞放置2～8℃保存，3～5日內(nèi)使用，若有條件紅細(xì)胞盡可能現(xiàn)用現(xiàn)配。對1%紅細(xì)胞懸液可按中國獸藥典（2015年版）三部附錄3404附注要求進(jìn)行標(biāo)定，確保配制濃度準(zhǔn)確。

3 4倍血凝素對試驗結(jié)果的影響

在紅細(xì)胞凝集抑制試驗中的關(guān)鍵為4倍血凝素的配制，需要準(zhǔn)確測定血凝素的凝集價并對配制的4倍血凝素進(jìn)行檢驗。4倍血凝素配制濃度如果不準(zhǔn)確則紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果會有很大的影響。配制濃度偏高，則紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果偏低；配制濃度偏低，則紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果偏高。 在操作過程中需要注意是為了和后續(xù)抑制試驗反應(yīng)體系液體量保持一致，在血凝素凝集價測定和4倍血凝素檢驗過程中需要補(bǔ)加的PBS（具體請參照中國獸藥典2015年版三部附錄）。此外配制好的血凝素可在2～8℃條件下儲存，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配；原液應(yīng)避免反復(fù)凍融，可先分裝成小包裝進(jìn)行凍存。每次試驗均應(yīng)先測定血凝素凝集價，避免因使用不同的紅細(xì)胞或其他實驗因素變動造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。

4 操作過程

加液時嚴(yán)格按照移液器的使用方法，采用多吸少打或全排的加液方式均可，確保加液量準(zhǔn)確。

加液過程應(yīng)避免將液體加到孔外或濺出孔外，造成反應(yīng)體系量不準(zhǔn)確，每次加液時，應(yīng)避免槍頭接觸反應(yīng)板孔內(nèi)液面。

在稀釋過程中，吹吸混勻次數(shù)應(yīng)至少6次，槍頭深入液面深度應(yīng)適中，避免吸空和濺出。在吹吸混勻后移液時，應(yīng)排凈吸頭內(nèi)液體，重新吸取準(zhǔn)確量加入下一孔繼續(xù)混勻稀釋。紅細(xì)胞在使用前應(yīng)搖勻，加樣孔較多時，應(yīng)注意經(jīng)常搖勻。在整個操作過程中應(yīng)隨時注意移液器液面位置，確保加液量準(zhǔn)確。

5 反應(yīng)環(huán)境溫度及判定方法

紅細(xì)胞凝集和紅細(xì)胞凝集抑制試驗要求實驗反應(yīng)溫度為室溫（15～25℃）或2～8℃。室溫條件下，20—40 min即可判定，2～8℃條件下需要40～60 min可判定結(jié)果。環(huán)境溫度較高，則紅細(xì)胞凝集試驗及紅細(xì)胞凝集抑制試驗反應(yīng)的時間較短；環(huán)境溫度較低，則紅細(xì)胞凝集試驗及紅細(xì)胞凝集抑制試驗反應(yīng)的時間較長。判定方法為：在特定溫度及規(guī)定的時間內(nèi)，以紅細(xì)胞對照在反應(yīng)板底部形成邊緣光滑的圓點（即呈顯著紐扣狀）時開始判定.以完全凝集（100%凝集）或完全抑制（lOO%）的最高稀釋倍數(shù)作為反應(yīng)終點。