橄欖多酚類物質研究進展

賴瑞聯(lián) 陳瑾 馮新

摘? 要? 橄欖是中國傳統(tǒng)的藥用植物，其中多酚類物質是橄欖重要的功效成分之一。目前，橄欖多酚類物質研究較為廣泛，常用的提取方法包括溫浸法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超聲與微波協(xié)同輔助提取法等，分離純化后采用液相色譜或液質聯(lián)用技術鑒定多酚類物質的種類和成分，并對其抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、抗癌抑癌、解酒護肝和提高機體免疫等方面的藥理活性進行驗證。此外，橄欖多酚類物質合成和代謝分子機理也已經被初步闡釋。基于上述研究報道，本文進一步對橄欖多酚類物質后續(xù)研究方向和產業(yè)化開發(fā)利用前景進行展望。

關鍵詞? 橄欖;多酚;研究進展;藥理活性中圖分類號? S667.5 ?????文獻標識碼? A

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.029

橄欖（Canarium album（Lour.） Raeusch.）是我國熱帶亞熱帶地區(qū)特色名貴果樹，也是國家衛(wèi)計委公布的藥食同源作物之一^[1]。中國是橄欖種質資源起源和主要分布中心，福建、廣東、廣西、云南、海南、臺灣和浙江等南部?。▍^(qū)）均有橄欖分布和栽培，此外，越南、緬甸和馬來西亞等東南亞國家也有少量橄欖分布^[2-3]。橄欖作為我國南方傳統(tǒng)藥用果樹和重要經濟作物，已經融入當?shù)氐拿袼缀臀幕?，橄欖產業(yè)科技創(chuàng)新、種質資源挖掘、功效成分開發(fā)利用等也越來越受關注。

我國橄欖種質資源極為豐富，為更好實現(xiàn)種質資源的創(chuàng)新利用，并將資源優(yōu)勢轉化為經濟優(yōu)勢，除篩選更符合大眾口味的鮮食橄欖品種，還需關注橄欖功效成分及其附加產品的創(chuàng)新與開發(fā)利用^[4]。研究表明，橄欖具有解酒保肝^[5-6]、抗菌消炎^[7]、提高機體免疫^[8]、抗氧化^[9]、抗癌抑癌^[10-11]、修復關節(jié)軟骨^[12]等藥理活性。而橄欖的功效成分種類和含量豐富，主要包括精油^[13]、類黃酮^[14-15]、多糖^[9]、多酚^[16]、礦質元素^[17]、萜類物質^[6]及氨基酸^[18]等，其組成成分和分子結構均有相關報道。其中，多酚類物質是橄欖最重要且含量最高的功效成分，也是影響橄欖鮮食品質的核心指標之一^[19-22]。目前，橄欖多酚類物質研究也取得了較大進展^[23-25]。本文主要從提取分離、純化鑒定、藥理活性及分子生物學等幾個方面對國內外橄欖多酚類物質研究概況展開綜述，并對橄欖多酚類物質后續(xù)研究方向和產業(yè)化開發(fā)利用前景進行展望。

1 ?橄欖多酚類物質的提取分離

多酚類物質是來源于莽草酸途徑與苯丙氨酸途徑的一類具有芳環(huán)結構并結合一個或多個羥基的化合物^[26]。由于多酚類物質富含羥基，其通常能溶于水且易溶于甲醇、乙醇和丙酮等極性較大的有機溶劑，而在有氧與高溫條件下易被氧化為醌^[27]。因此，橄欖多酚類物質提取時大多使用水、乙醇或丙酮溶液作為提取液，且提取溫度通常介于20～72 ℃。根據(jù)浸提過程中輔助手段不同，橄欖多酚類物質提取方法大致分為5類，見圖1。提取橄欖多酚類物質后，通常采用酒石酸鐵法、福林酚試劑法和紫外分光光度計法進行含量測定。向麗等^[28]初步建立了基于福林酚比色法橄欖多酚類物質測定體系：酚試劑1.5 mL、10% Na₂CO₃6 mL，于30 ℃下反應60 min，置于765 nm波長下測定。而謝倩等^[29]對酒石酸鐵法、福林酚試劑法和紫外分光光度計法進行比較，結果發(fā)現(xiàn)3種方法均具有良好的重復性，其中紫外分光光度計法操作簡便且成本不高，可作為橄欖多酚類物質測定的理想方法。

圖1橄欖多酚類物質的提取過程

Fig. 1? Extraction process of polyphenols inC. album

1.1 溫浸法

溫浸法是指在利用水或乙醇溶液作為溶劑提取橄欖多酚類物質時，通過水浴等方法為提取體系提供一定的溫度，從而促進提取液與物料接觸的一種提取方法。這種方法的優(yōu)點在于操作簡單且不需要復雜的設備，但提取時間較長。影響溫浸法提取橄欖多酚類物質效果的關鍵因素包括提取溫度、溶劑的種類與濃度、提取時間、料液比等（表1）。綜合提取效果與操作過程的便捷程度，適合橄欖果肉多酚類物質提取的溫浸法提取工藝為：去核果實干燥粉末以1∶20的料液比投入60%～70%丙酮水溶液中，在20～30 ℃的環(huán)境下攪拌60 min，提取得率可達到16.9%;而橄欖葉片多酚類物質提取的最佳溫浸法提取工藝為：烘干葉片粉末以1∶25的比例投入50%的乙醇溶液中，提取3次，提取144 min，其得率約14.7%。此外，采用賢景春等^[30]建立的溫浸提取法測定橄欖根中多酚類物質含量為6.015 mg/g，也說明橄欖根中的多酚類物質含量較低。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是指將提取體系置于一定頻率的超聲波環(huán)境下，利用超聲波的空化效應、熱效應及機械作用促進多酚類物質溶解到溶劑中的一種提取方法。這種方法具有提取時間短、效率高等優(yōu)點，同時避免高溫對多酚類物質的破壞，但提取噪音大，并且當提取量較多時，需較大的設備提供充分功率的超聲波。超聲波輔助提取法影響因素較多，包括溶劑的種類與濃度、超聲波功率、提取時間和料液比等（表2）。經過多次優(yōu)化，從提取效果與可操作性上看，適合橄欖果肉多酚類物質提取的超聲波輔助法提取工藝為：去核果實干燥粉末以1∶20的料液比投入60%～70%丙酮水溶液中，置于80 W功率的超聲環(huán)境中提取25 min，其多酚提取率可達到17.8%。而孔佳祥等^[40]的方法提取橄欖葉片總多酚類物質得率約為8.9%。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提法是將提取體系置于一定的微波環(huán)境下，利用微波的穿透及內部迅速加熱的特性，使橄欖多酚類物質快速轉移到提取體系。該方法提取時間短、能耗小且避免了長時間加熱對多酚的損耗，但提取操作煩瑣，成本較高^[44]。目前，微波輔助提取法在橄欖中的研究和應用較少，何志勇等^[45]通過試驗初步篩選了適宜微波輔助提取橄欖多酚類物質的工藝為：在1∶20的料液比中，將橄欖材料投入60%～70%的丙酮水溶液中，在340 W的微波中提取5 s，其多酚提取得率約為18.6%。

1.4 超聲與微波協(xié)同輔助提取法

超聲與微波協(xié)同輔助提取法是同時利用超聲波與微波的優(yōu)點，優(yōu)化最佳體系提取橄欖多酚類物質。目前，超聲與微波協(xié)同輔助提取法在橄欖中也有不少研究報道。何志勇等^[45]建立了基于超聲與微波協(xié)同輔助的橄欖多酚類物質提取方法，即橄欖干燥果實粉末按照1∶10～1∶15投入60%～80%乙醇水溶液中，設定超聲波功率為50 W，微波功率為100～600 W，提取0.5～3 min。項昭保等^[46]則采用響應面法進行工藝優(yōu)化，進一步篩選出最適體系：橄欖干燥果實粉末按照1∶30投入62%乙醇水溶液中，設定超聲波功率330 W，微波功率550 W，提取4.4 min，使橄欖多酚類物質提取效率大幅度提高。

1.5 亞臨界水提法

亞臨界水提法是指在一定的壓力下，以溫度處于100 ℃至臨界溫度范圍的亞臨界水為溶劑，進行橄欖多酚類物質提取的一種方法。這種方法不需使用有機溶劑，更為環(huán)保，但提取時需要使用密閉的提取設備，壓力與體積的乘積一般會超過3 MPa/L，具有一定的危險性，且操作程序更為煩瑣^[47]。目前已知的橄欖多酚類物質亞臨界水提法具體提取工藝為：將果肉干燥粉1∶20～1∶30的料液比投入萃取釜中，設定壓力為5～10 MPa，溫度為200～270 ℃，提取時間為20～60 min^[48]。

2 ?橄欖多酚類物質的純化鑒定與化學結構分析

2.1 橄欖多酚類物質的純化與鑒定

橄欖多酚類物質的純化與鑒定根據(jù)目的可分為兩類，一類是將橄欖提取液初步除雜純化獲得粗提物，然后采用液相色譜的方法鑒定提取物中已知的多酚類物質;另一類是通過固液分離-萃取分相-柱層析梯度洗脫從而獲得橄欖多酚，然后通過液相與質譜聯(lián)用技術對橄欖多酚的種類和成分進行鑒定。

2.1.1? 果肉多酚類物質純化與鑒定 ?目前已鑒定的橄欖果肉多酚類物質主要包括沒食子酸、綠原酸、短葉蘇木酚酸、芥子酸、金絲桃苷、穗花杉雙黃酮、槲皮素和香豆酸等34種（表3）。此外，何志勇等^[43]還發(fā)現(xiàn)了橄欖果肉中另外5種不確定的多酚類物質，其中2種可能互為異構體的鞣花酸，2種6-羥基聯(lián)苯二甲酸衍生物及1種相對分子質量為348的未知多酚類物質?；陂蠙於喾宇愇镔|分離鑒定技術，在橄欖高功效品種篩選時，林玉芳等^[49]采用高效液相色譜法對不同橄欖品種多酚類化合物組分含量進行比較分析，確定了‘馬坑22號為高鞣花酸含量品種，‘檀頭為高蘆丁品種，而‘霞溪本同時富含2種組分。

2.1.2? 葉片多酚類物質純化與鑒定 ?橄欖葉片多酚類物質純化與鑒定研究報道相對較少。鄭賢民^[38]和王宗舉^[56]等通過大孔吸附樹脂分離法對橄欖葉片提取液中的多酚類物質進行研究，分別將多酚類物質的純度提高到了68.52%和71.20%，并通過液相色譜鑒定獲得橄欖葉片中沒食子酸、槲皮素、穗花杉雙黃酮和蘆丁等4種多酚類物質。

2.2 橄欖多酚類物質的化學結構分析

根據(jù)已有報道，目前鑒定獲得橄欖葉片和果肉中34種已知多酚類化合物，采用Integle中的InDraw模塊對其化學結構進行查詢與繪制，結果見圖2。

3 ?橄欖多酚類物質的藥理活性研究

3.1 解酒護肝

橄欖汁液素有解酒保肝的功效。張怡等^[5]通過對酒精性肝損傷的小鼠喂食橄欖汁后發(fā)現(xiàn)，橄欖汁及其透析液能夠顯著降低血清谷丙轉氨酶和脂質過氧化物，有效激活全血超氧化物歧化酶和乙醇脫氫酶，而橄欖透析液中包含大量多酚類物質，其中類黃酮物質含量最高，證明橄欖多酚類物質具有解酒保肝藥理活性。此外，Ito等^[57]利用橄欖中分離純化獲得的幾種多酚類物質，對離體培養(yǎng)的小鼠肝細胞進行抗毒肝素活性試驗認為，短葉蘇木酚、金絲桃苷、鞣花酸及3，3′-二甲氧基鞣花酸這4種多酚類物質可能在保肝護肝過程中發(fā)揮主要作用。

3.2 抗氧化

二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）和鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）測定是橄欖多酚自由基清除能力和抗氧化活性鑒定中常用的方法^[32]。研究表明，橄欖多酚類物質具有較強的2，2′-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基（ABTS⁺·）、DPPH·、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O₂^-·）和亞硝酸鹽（NO₂^-）清除能力及鐵離子還原能力，可作為天然的食品抗氧化劑^[58-60]。此外，Kuo等^[61]也發(fā)現(xiàn)橄欖乙醇水溶液提取物的抗氧化效果和自由基清除能力與提取液中多酚類物質存在量效關系。而在具體抗氧化成分鑒定中，呂鎮(zhèn)城^[54]、林鈺郡^[62]和Chang^[63]等研究認為，橄欖多酚類物質的抗氧化主要組分包括槲皮素、山奈酚、鞣花酸、沒食子酸、3-O-沒食子酸奎寧酸、老鸛草素及異柯里拉京等。此外，利用不同溶劑提取時，80%丙酮溶劑獲得的橄欖多酚類物質具有更高的抗氧化活性，而其具體影響因素則有待進一步研究^[64]。

3.3 抗癌抑癌

脂質代謝是人體代謝的重要組成部分，脂類代謝紊亂可能引發(fā)機體癌變。Liu等^[10]研究發(fā)現(xiàn)，橄欖中的多酚能夠激活肝癌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，下調固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP-1）和脂肪酸結合酶（FAS）表達，同時上調過氧化物媒體增殖物活化受體（PPAR-α）表達，從而抑制細胞中脂質過度積累，起到抗癌抑癌的生理功能。此外，向麗等^[11]也通過試驗發(fā)現(xiàn)，橄欖多酚類物質能夠有效抑制人宮頸癌Hela細胞增殖，同時激活caspase-3表達，從而促進癌細胞凋亡，結果進一步說明橄欖多酚

類物質具有抗癌抑癌功能。

3.4 抗病毒

Duan^[8]等研究表明，橄欖果實乙酸乙酯提取物能夠抑制人體免疫缺陷病毒（HIV）糖蛋白跨膜單元gp41中介導HIV病毒侵染目標細胞的結構——六螺旋束的形成，并通過進一步鑒定發(fā)現(xiàn)沒食子酸是提取物中的主要功能成分之一。此外，橄欖多酚類物質能夠明顯抑制乙肝病毒HBsAg/HBeAg在HepG22細胞中的自我復制，具有抗乙肝病毒的藥理活性，且對正常細胞無毒害作用，而發(fā)揮這種抗性的組分主要是沒食子酸和鞣花酸^[65-66]。

3.5 其他

橄欖多酚類物質在降低血糖、提高機體免疫和抗菌消炎等方面同樣具有很好的功效。張潤普等^[67]研究發(fā)現(xiàn)，喂食橄欖多酚類物質可顯著增加大鼠骨密度和骨鈣含量。王瑤等^[68]研究表明，橄欖多酚類物質對口腔頜面常見的致病菌也有較好的抑菌作用。此外，橄欖多酚能夠抑制機體α葡萄糖苷酶活性及恢復胰島素分泌，從而抑制糖尿病小鼠血糖升高^[69]。

4 ?橄欖多酚類物質合成和代謝的分子機理研究

橄欖分子生物學研究起步較晚，其多酚類物質合成和代謝機理報道較少。王云梅^[70]和張慶舉^[71]等首先對橄欖葉多酚代謝途徑上游基因進行克隆，獲得了對-香豆酸輔酶A連接酶C4H、苯丙氨酸解氨酶PAL、肉桂酸-4-羥化酶4CL、黃烷酮- 3-羥化酶F3H、查爾酮異構酶CHI和查爾酮合成酶CHS等基因序列，并通過生物信息學分析初步揭示了橄欖多酚代謝機理。隨后，賴瑞聯(lián)等^[72]開展橄欖CHI基因密碼子特征分析，為其基因功能和分子進化研究提供了科學依據(jù)。而黃敏杰等^[73]通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，橄欖類黃酮3′-羥化酶F3′H基因與多酚類物質在果實發(fā)育過程中的變化趨勢相符，驗證其在多酚合成和代謝中發(fā)揮重要調控功能。此外，隨著現(xiàn)代高通量測序研究和應用的不斷深入，李安玉^[74]以多酚類物質含量差異較大的‘長營和‘清欖橄欖為材料，初步挖掘出橄欖兒茶酚胺氧位甲基轉移酶COMT、肉桂醇脫氫酶CAD、過氧化物酶POD、丙二烯氧化環(huán)化酶AOC、酪氨酸轉氨酶TAT、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶HPPD、黃酮醇合成酶FLS、黃酮3-O-單氧酶F3M和阿魏酸-5-羥基化酶F5H等一系列橄欖多酚代謝關鍵基因，進一步揭示了橄欖多酚類物質合成和代謝分子機理。

5 ?展望

5.1 橄欖多酚類物質組分和基礎應用研究

大量研究結果表明，橄欖多酚類物質在抗菌消炎、保肝護肝、抗癌抑癌、降低血糖和提高機體免疫等方面具有良好的藥理活性，開發(fā)應用市場前景廣闊。然而，目前橄欖多酚類物質研究和應用還處在初級階段，對其中發(fā)揮具體藥理活性的組分研究較淺，許多橄欖多酚結構和種類也并不明確，仍有必要進一步結合質譜和核磁共振技術鑒定結構并加以開發(fā)利用，提高橄欖多酚類物質的利用效率。另一方面，橄欖不同品種間多酚含量和種類差異較大，需要加大橄欖種質間多酚類物質基礎數(shù)據(jù)挖掘，為橄欖高功效品種篩選提供參考。此外，橄欖多酚類物質提取分離方法種類多樣，在產業(yè)開發(fā)時關注提取效果的同時，也需要結合食品安全標準，注重提取產物的安全性和規(guī)范化，保證橄欖多酚類物質可食性，開發(fā)橄欖多酚天然保健食品、天然保鮮劑和抗氧化劑。

5.2 橄欖多酚類物質合成和代謝分子機制闡釋

生物體中，數(shù)量性狀及其特征質量性狀的改變起源于基因差異表達。目前，橄欖多酚類物質合成和代謝相關分子機理研究較少，其關鍵節(jié)點基因和代謝調控網(wǎng)絡尚不明確，在后續(xù)研究中可以結合現(xiàn)代高通量測序技術開展mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA組學研究，橄欖基因組草圖構建以及橄欖多酚代謝組學關聯(lián)分析，進一步闡釋橄欖多酚類物質合成和代謝的分子機制。此外，結合SNP等第3代分子標記技術對橄欖多酚類物質合成相關位點進行準確定位，可為橄欖高功效定向育種提供分子輔助技術。

5.3 橄欖多酚類物質藥理活性開發(fā)

在藥理活性研究方面，在橄欖多酚類物質組分分離純化和結構鑒定的基礎上，可采用CAP-e法^[75]（基于紅血球細胞抗氧化保護能力，Cell— based antioxidant protection in erythrocytes）、CAA法^[76]（細胞抗氧化活性，Cellular antioxidant activity）等，結合氧化損傷細胞模型法，開展不同結構多酚的抗氧化活性研究，進一步明確橄欖多酚類物質的藥理活性。

綜合分析，目前橄欖多酚類物質研究和利用水平較低，后續(xù)應主要開展以下幾個方面研究：一是橄欖多酚的高效制備工藝和穩(wěn)態(tài)化技術開發(fā);二是橄欖多酚種類的分離純化和結構鑒定;三是橄欖高多酚含量種質篩選與多酚合成機理闡釋，四是橄欖多酚的藥理活性挖掘，最后進行橄欖多酚相關功能性產品的開發(fā)應用。隨著這些工作的開展，橄欖多酚類物質的研究與利用體系將更加完善，作為一種新型天然活性物質發(fā)揮廣闊的市場前景。

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