文心蘭PAD4基因克隆及表達(dá)分析

郭艷芳 王叢巧 李蓉 陳裕坤 賴鐘雄 王天池

摘? 要? 為了研究文心蘭（Oncidium hybridum）抗病相關(guān)基因PAD4在文心蘭抗病種質(zhì)資源培育中的功能，采用RT-PCR結(jié)合RACE法，從巧克力文心蘭（Oncidium Sharry Baby ‘Sweet Fragrance）中克隆得到一條全長(zhǎng)2 214 bp的基因的cDNA序列，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 894 bp，預(yù)測(cè)可編碼647個(gè)氨基酸，5′UTR長(zhǎng)度為65 bp，3′UTR長(zhǎng)度為255 bp。生物信息學(xué)分析表明：PAD4編碼的蛋白屬于水解酶超家族，有6個(gè)跨膜螺旋，無(wú)信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，文心蘭PAD4與同為蘭科植物的小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）、鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）、深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）親緣關(guān)系最近。同源分析結(jié)果顯示，與鐵皮石斛的PAD4蛋白同源性最高（78.08%）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，PAD4在文心蘭不同組織部位中都有表達(dá)，在假鱗莖中的表達(dá)量最高，其次是下端葉，在根中的表達(dá)量最低。接種軟腐病病原菌顯示，PAD4在感病文心蘭中表達(dá)量上調(diào)，侵染后4 h時(shí)快速響應(yīng)并達(dá)到最高值。SA（salicylic acid）和CaCl₂都能夠誘導(dǎo)PAD4的表達(dá)，都在24 h時(shí)達(dá)到最高峰。研究表明，PAD4基因可能在文心蘭抗病過(guò)程中有重要作用。

關(guān)鍵詞? 文心蘭;抗病;PAD4;基因克隆;表達(dá)分析中圖分類號(hào)? S31 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.016

文心蘭，蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬（Oncidium）植物的總稱，為全球重要的切花植物，其花序分支性好，花形優(yōu)美，花朵奇異可愛(ài)。巧克力文心蘭（OncidiumSharry Baby ‘Sweet Fragrance）作為文心蘭的一個(gè)栽培品種，花朵數(shù)可達(dá)百朵，花期長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)半月，開(kāi)花時(shí)又因其具有巧克力奶油香氣的顯著特征而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)^[1]，具有很高的市場(chǎng)價(jià)值。文心蘭切花高峰期集中于高溫高濕季節(jié)，在文心蘭栽培過(guò)程中極易感染軟腐病、褐斑病、根腐病等細(xì)菌性病害，炭疽病、圓斑病等真菌性病害以及病毒病^[2]。各種病害給文心蘭產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的損失，嚴(yán)重阻礙了文心蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于文心蘭及其近親種屬缺乏有效對(duì)抗文心蘭病害的抗病基因，通過(guò)常規(guī)育種來(lái)提高文心蘭的抗性比較困難^[3]，因此篩選抗性相關(guān)基因，培育抗性文心蘭品種對(duì)文心蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

植物受到病原菌侵染后可以通過(guò)植物系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）抵御病原菌的侵?jǐn)_，植物抗病基因（R）與病原菌無(wú)毒基因（avr）能夠相互識(shí)別，并通過(guò)R基因下游的一些基因整合不同的抗病信號(hào)，通過(guò)水楊酸途徑將抗病信號(hào)傳遞下去^[4-5]。PAD4作為一個(gè)抗病信號(hào)途徑基因，是在通過(guò)尋找突變體植株對(duì)脫毒的十字花科黑斑病菌增強(qiáng)了感病性基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的^[6]，其編碼一個(gè)核質(zhì)蛋白，序列與脂肪酶類似^[7]，與三酰甘油脂肪酶基因同源，屬于水楊酸信號(hào)途徑的上游基因，在系統(tǒng)獲得性抗性中，水楊酸是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵信號(hào)分子。水楊酸作為SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一種內(nèi)源信號(hào)分子，在植物的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用^[8]，其誘導(dǎo)的植物防御對(duì)抵抗病原體的侵?jǐn)_至關(guān)重要。PAD4作為依賴SA（salicylic acid）防御反應(yīng)的調(diào)控子^[9]，在抗病基因介導(dǎo)的植物抗性中起到重要的作用，能夠在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中抵御病菌的侵害及逆境脅迫。當(dāng)病原菌入侵植物組織后，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)移動(dòng)信號(hào)，通過(guò)植物維管系統(tǒng)激活末端組織來(lái)防御病害^[10]。在SA介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑中，病原菌對(duì)植物的侵染會(huì)使植物局部組織發(fā)生超敏反應(yīng)，誘導(dǎo)植物抗毒素等物質(zhì)的合成，并伴隨水楊酸水平提高，激發(fā)下游PR蛋白的表達(dá)，使植物獲得系統(tǒng)性抗性^[11-12]。PAD4控制植物防御信號(hào)的合成，對(duì)蔓延性植物病毒能產(chǎn)生抗性，研究表明外援噴施SA后能夠促進(jìn)PAD4大量表達(dá)^[13-14]，從而提高植物自身的抗病性。PAD4作為植物自身的抗病信號(hào)途徑基因在植物的抗病進(jìn)程中有著重要的地位，因此利用文心蘭本身的遺傳抗性在研究文心蘭病害中是值得嘗試的一種方式。目前對(duì)PAD4的研究多集中在水稻^[6]、茄子^[15]、煙草^[16]等植物上，在文心蘭中未見(jiàn)報(bào)道。本研究以巧克力文心蘭為材料，采用RACE-PCR技術(shù)克隆了巧克力文心蘭PAD4基因的全長(zhǎng)序列，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)文心蘭不同組織部位、病原菌侵染文心蘭不同時(shí)間和外源激素處理下PAD4基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，了解PAD4基因表達(dá)情況，為文心蘭的抗病性研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)以巧克力文心蘭組培苗為材料，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。取樣后用液氮預(yù)冷處理并保存于–80 ℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1? 文心蘭總RNA提取及其cDNA第一鏈合成? 采用Trizol UP RNA提取試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司）提取樣品總RNA，用Thermo超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA樣品濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其清晰度與完整性，保存于–80 ℃冰箱備用。采用GeneRacer^TM試劑盒（TaKaRa）將已經(jīng)提取的文心蘭總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA用于5′端的克隆，采用SMARTer RACE Kit試劑盒（TaKaRa）將已經(jīng)提取的文心蘭總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA用于3′端和保守區(qū)的克隆。用SYBR ExScript^TM（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將已經(jīng)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于熒光定量PCR分析。具體使用步驟見(jiàn)說(shuō)明書。

1.2.2PAD4基因全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增 ?從文心蘭轉(zhuǎn)錄組中獲得PAD4的部分核苷酸序列，采用DNAMAN 6.0在其開(kāi)放閱讀框（ORF）序列兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物PAD4-ORF-F和PAD4-ORF- R（表1），以巧克力文心蘭第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆該基因ORF序列。然后根據(jù)已知的ORF序列分別設(shè)計(jì)出2條3′RACE的特異性引物和2條5′RACE的特異性引物（表1），結(jié)合SMARTer RACE Kit 3′和3′巢式引物以及GeneRacer^TM5′和5′巢式引物，以巧克力文心蘭cDNA為模板，分別擴(kuò)增出3′和5′端序列，用DNAMAN 6.0進(jìn)行全長(zhǎng)拼接。以上所用引物均由華大基因科技公司合成。

PCR反應(yīng)采用25 μL體系：Dream Taq^TMGreen PCR Master Mix （2×） 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL，模版cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL。保守區(qū)克隆PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸2 min 30 s，34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min并4 ℃保存。3′和5′端克隆PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、55～59 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min并4 ℃保存。

1.2.3? TA克隆與測(cè)序? 所有的PCR產(chǎn)物均用1%凝膠電泳，然后將目標(biāo)片段的PCR產(chǎn)物采用Gel/PCR Extraction Kit進(jìn)行膠回收，連接PMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中進(jìn)行TA 克隆并挑選陽(yáng)性克隆搖菌，然后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，將帶有目的條帶的菌液送至華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4? 文心蘭PAD4生物信息學(xué)分析? 利用NCBI的ORF Finder對(duì)PAD4的cDNA序列的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行查找;通過(guò)NCBI Conserved Domain Search預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;采用ExPASy- ProtParam tool進(jìn)行氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測(cè);利用Signal P4.1Server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽;用TMpred Server進(jìn)行蛋白跨膜預(yù)測(cè);用PSORT WWW Server進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);用KinasePhos預(yù)測(cè)蛋白的磷酸位點(diǎn);通過(guò)COLIS Server進(jìn)行卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析;分別用SOMPA和SWISS-MODEL對(duì)PAD4基因編碼的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。采用MEGA 6.0 Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序搜索PAD4蛋白的相似性序列并進(jìn)行同源比對(duì)。

1.2.5? 文心蘭PAD4基因的表達(dá)分析? 以Actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則和獲得的序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物PAD4-QF和PAD4-QR（表1），進(jìn)行PAD4的表達(dá)模式分析。提取文心蘭不同組織部位（根、假鱗莖、上端葉、下端葉、花）的總RNA備用。用實(shí)驗(yàn)室保存的軟腐病病菌侵染文心蘭假鱗莖，于侵染前的0 h與侵染后的4、8、12 h取樣。分別用1 μmol/L SA、0.5 μmol/L CaCl₂噴施文心蘭組培苗葉片，噴施直至葉片流水為止，然后在處理前的0 h與處理后的1、3、6、12、24、48 h分別取葉片，所有樣品取樣后立即用液氮速凍保存于–80 ℃?zhèn)溆?。采用Trizol UP RNA試劑盒提取所有樣品的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，然后用Thermo超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA樣品濃度與OD值。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模版用于定量PCR實(shí)驗(yàn)。將cDNA樣本混合物進(jìn)行5倍梯度稀釋，分別對(duì)PAD4基因和內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線和擴(kuò)增曲線以確定引物特異性和擴(kuò)增效率。將所有樣品的cDNA 稀釋10倍作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。采用SYBR premix Ex Taq^TMⅡkit（TaKaRa）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)采用20 μL體系：2× SYBR 10 μL，ddH₂O 7.4 μL，cDNA模版1 μL，上下游引物各0.8 μL，每種處理做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用羅氏LightCycler 480儀器，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s，40次循環(huán)。依據(jù)2^–??Ct法計(jì)算PAD4基因的相對(duì)表達(dá)量。

2? 結(jié)果與分析

2.1巧克力文心蘭cDNA全長(zhǎng)序列的獲得

以巧克力文心蘭的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及驗(yàn)證PAD4基因的ORF序列，電泳顯示目的片段大小約1 800 bp（圖1-A），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證ORF長(zhǎng)度為1 894 bp。以PAD4-GSP1和PAD4- GSP2為特異引物，進(jìn)行3′RACE巢式PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)得到一條500 bp左右的目的片段（圖1-B），測(cè)序顯示其長(zhǎng)度448 bp;以PAD4-GSPa和PAD4-GSPb為特異引物，進(jìn)行5′RACE巢式

PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)得到一條600 bp左右的條帶（圖1-C），測(cè)序顯示其長(zhǎng)度為606 bp。將獲得的5′端、3′端和ORF序列利用DANMAN 6.0軟件進(jìn)行拼接，共得到2 214 bp的全長(zhǎng)序列，包括1 894 bp的ORF，編碼蛋白由647個(gè)氨基酸組成，5′-UTR為65 bp，3′-UTR為255 bp，polyA尾巴為33 bp（圖2）。經(jīng)BLAST分析表明，該片段與多種植物尤其是蘭科植物的PAD4基因具有很高的同源性，初步認(rèn)定它是文心蘭PAD4基因的片段。

2.2 ?PAD4的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

用ExPASy-ProtParam tool進(jìn)行氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C₃₁₉₂ H₅₀₀₄ N₈₆₄ O₉₀₅ S₄₄，相對(duì)分子質(zhì)量為71 374.73，理論等電點(diǎn)為8.27，不穩(wěn)定系數(shù)51.91，Grand average of hydropathicity （GRAVY）值為–0.074，脂肪族指數(shù)為87.99。NCBI-CDD預(yù)測(cè)到該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域在1～631肽鏈區(qū)間，屬于水解酶超家族;利用Signal P4.1Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽顯示PAD4不含信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。用PSORT Prediction分析預(yù)測(cè)顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上（可信度：0.820）;用TMpred Server進(jìn)行蛋白跨膜預(yù)測(cè)，顯示PAD4蛋白屬于跨膜蛋白，有6個(gè)跨膜螺旋。用KinasePhos預(yù)測(cè)蛋白的磷酸位點(diǎn)表明PAD4蛋白有10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，含有9個(gè)絲氨酸、1個(gè)蘇氨酸，沒(méi)有絡(luò)氨酸。用COLIS Server進(jìn)行卷曲螺旋結(jié)構(gòu)分析，顯示PAD4沒(méi)有形成卷曲螺旋結(jié)。通過(guò)SOMPA在線軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，顯示其編碼蛋白的氨基酸序列中有354處α-螺旋（alpha helix）、50處外延伸鏈（extended strand）、17處β-轉(zhuǎn)角（beta turn）和210處無(wú)規(guī)則卷曲（random coil），分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的56.10%、7.92%、2.69%和33.28%。因此α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是PAD4的主要結(jié)構(gòu)原件。利用 SWISS- MODEL軟件預(yù)測(cè)文心蘭PAD4蛋白的三維結(jié)構(gòu)，從圖3可以看出PAD4蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件還是螺旋和卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.3 ?PAD4的同源性序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為了研究PAD4的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，PAD4與同為蘭科植物的鐵皮石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭親緣關(guān)系最近，歸在同一分支（圖4）。利用NCBI中的BLAST程序?qū)⑽男奶mPAD4編碼的氨基酸序列與其他6個(gè)物種的PAD4編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示文心蘭PAD4與鐵皮石斛PAD4相似度高達(dá)78.08%，與小蘭嶼蝴蝶蘭PAD4相似度為75.31%，與深圳擬蘭、鳳仙花、油棕、野果芭蕉相似度也都在50%以上，比對(duì)發(fā)現(xiàn)文心蘭PAD4蛋白與其他6種植物蛋白在C端的序列保守性更高，在蘭科植物的進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性（圖5）。

2.4 文心蘭PAD4基因的表達(dá)特性

熒光定量結(jié)果顯示，PAD4基因在文心蘭不同組織部位的表達(dá)差異顯著。在根、假鱗莖、上端葉、下端葉和花中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最低，在假鱗莖中表達(dá)量最高，是根中表達(dá)量的3倍，在下端葉中表達(dá)量略微低于假鱗莖，也接近在根中表達(dá)量的3倍，其次是上端葉和花（圖6）。軟腐病病菌侵染文心蘭假鱗莖后，PAD4的表達(dá)量先上調(diào)后下降，在4 h時(shí)達(dá)到最高值，8 h時(shí)降到最低（圖7），說(shuō)明PAD4在軟腐病的侵染過(guò)程中對(duì)病原菌比較敏感，在接種部位能夠快速響應(yīng)軟腐病菌的侵染并作出表達(dá)。1 μmol/L SA噴施文心蘭葉片能夠誘導(dǎo)PAD4的表達(dá)，PAD4的表達(dá)量先上升再下降，再上升再下降，出現(xiàn)2個(gè)峰值，6 h時(shí)PAD4的表達(dá)量達(dá)到第一個(gè)高峰，12 h時(shí)PAD4的表達(dá)量下降到最低然后開(kāi)始上升，24 h時(shí)PAD4的表達(dá)量達(dá)到最高值，約為0 h的3.5倍，然后開(kāi)始下降，整體呈“M”趨勢(shì)。0.5 μmol/L CaCl₂噴施文心蘭葉片能夠顯著誘導(dǎo)PAD4的表達(dá)，PAD4的表達(dá)量先下降再上升再下降，CaCl₂噴施文心蘭葉片1 h后表達(dá)量略微下降然后開(kāi)始上升，24 h達(dá)到最高值然后開(kāi)始下降，最高值約為0 h的7倍（圖8）。SA信號(hào)通路作為植物調(diào)控誘導(dǎo)抗性的重要通路，參與植物的抗病過(guò)程，Ca²⁺信號(hào)參與SA防御途徑，同時(shí)又作為細(xì)胞的第二信使參與植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)中^[17-18]，SA和CaCl₂處理植株后PAD4的表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明PAD4在文心蘭抗病過(guò)程中起到正調(diào)控的作用。

3? 討論

3.1? PAD4是一個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)膜的水解酶超家族蛋白

本研究基于文心蘭轉(zhuǎn)錄組中找到抗性相關(guān)基因PAD4并對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，得到全長(zhǎng)為2 214 bp文心蘭PAD4基因，其中該基因CDS長(zhǎng)1 894 bp，預(yù)測(cè)可編碼647個(gè)氨基酸，PAD4不含信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。通過(guò)對(duì)PAD4蛋白分析顯示PAD4蛋白脂肪族指數(shù)高達(dá)87.99，屬于水解酶超家族。PAD4與同屬于水解酶家族的EDS1為互作蛋白，它們的N端都有與?；饷竿吹慕Y(jié)構(gòu)域^[19]，兩者協(xié)同作用能夠促進(jìn)SA的積累增加水楊酸誘導(dǎo)的植物防御并放大PAD4的功效，使PAD4的功能保持穩(wěn)定^[20-21]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PAD4和EDS1結(jié)合后還能夠在鈣信號(hào)的影響下激活水楊酸合成途徑中的關(guān)鍵酶ICS1（isochorismate synthase 1）從而誘導(dǎo)SA的合成參與植物抗病的過(guò)程^[22]。PAD4在文心蘭不同組織部位表達(dá)量差異較大，在假鱗莖中表達(dá)量最高，在下端葉和上端葉的表達(dá)量都超過(guò)根的2倍，但在上端葉沒(méi)有下端葉的高，這可能與下端葉的位置接近于假鱗莖有關(guān)，在花中的表達(dá)量接近于在根中表達(dá)量的1.5倍，說(shuō)明該基因?qū)儆诮M織特異性表達(dá)模式。

3.2? PAD4通過(guò)水楊酸信號(hào)途徑在文心蘭抗病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用

SA途徑作為植物主要的防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，有很多防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)SA的生成積累，最終影響植物的抗病反應(yīng)。PAD4作為調(diào)控SA途徑的信號(hào)蛋白，是由抗性基因介導(dǎo)的觸發(fā)性免疫反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)劑^[23]，通過(guò)SA介導(dǎo)的抗病途徑來(lái)提高植物的抗性。研究表明在應(yīng)答某些信號(hào)時(shí)，PAD4對(duì)于激活SA表達(dá)是必需的，不同的抗性基因通過(guò)不同的途徑介導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)。軟腐病病菌接種文心蘭假鱗莖后，PAD4的表達(dá)量在4 h時(shí)快速上調(diào)，說(shuō)明PAD4在接種部位快速響應(yīng)并達(dá)到最高值，文心蘭在受到軟腐病侵染后接種部位的PAD4基因立即響應(yīng)病菌的侵染，說(shuō)明PAD4可能會(huì)在文心蘭抗病過(guò)程中發(fā)揮作用。水楊酸作為植物抗病途徑中的重要信號(hào)要素，在病原物相互作用過(guò)程中，植物體內(nèi)發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)，PAD4在SA和CaCl₂的處理下表達(dá)量整體上調(diào)，SA可以通過(guò)正反饋環(huán)路來(lái)增加PAD4的表達(dá)，同時(shí)PAD4又可以促進(jìn)水楊酸的積累，激發(fā)植物的防御體系使植物產(chǎn)生抗病性反應(yīng)^[24]。Ca²⁺作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)信使能夠參與水楊酸的合成來(lái)提高植物的抗病性^[25]，研究表明，外援Ca²⁺的處理能夠提高SA誘導(dǎo)番茄抗灰霉病的能力^[26]，同時(shí)也可以增加PAL、POL等抗病性酶活性和促進(jìn)酚類物質(zhì)與木質(zhì)素等抗病物質(zhì)的積累來(lái)增強(qiáng)植物抗病性^[27]，PAD4在CaCl₂的處理下做出響應(yīng)，說(shuō)明PAD4參與文心蘭的抗病反應(yīng)中。

3.3 ?PAD4參與植物的其他抗性活動(dòng)

植物抗病信號(hào)途徑復(fù)雜多樣，整體呈網(wǎng)絡(luò)狀的各個(gè)途徑交叉互作，PAD4與其他病原基因相互作用在植物抗病反應(yīng)中。PDA4在植物抗性的研究中，不僅能夠增加植物對(duì)病原菌的抗病性，而且在植物抗病蟲(chóng)和植物抗衰老方面也有一定的作用，在擬南芥中PAD4能夠伴隨著植物韌皮部的防御機(jī)制來(lái)調(diào)控葉片的早衰，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)韌皮部蚜蟲(chóng)的防御機(jī)制來(lái)限制蚜蟲(chóng)對(duì)植物的傷害^[28-29]，調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)，在干旱脅迫下的生存中發(fā)揮重要作用^[30]。通過(guò)對(duì)文心蘭PAD4 基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析，了解PAD4在文心蘭健康植株與感病植株中的表達(dá)情況，下一步可以進(jìn)行文心蘭PAD4基因敲除或通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步研究文心蘭PAD4的抗病性，為文心蘭抗病新種質(zhì)的培育提供進(jìn)一步的研究基礎(chǔ)。

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