一種測定巴西橡膠樹樹皮中過氧化氫含量的方法

楊署光 陳月異 李言 張世鑫 史敏晶

摘? 要? 研究植物體內(nèi)H₂O₂的含量變化有助于確認(rèn)植物提高非生物脅迫耐性的生物技術(shù)策略。Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好，廣泛用于植物H₂O₂測定，但不同研究所用的反應(yīng)條件不一致。在本研究中，系統(tǒng)優(yōu)化了Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的反應(yīng)條件，并比較了丙酮提取法和TCA提取法對橡膠樹萌條韌皮部H₂O₂的提取效果。結(jié)果表明，丙酮提取法穩(wěn)定性差，TCA提取法穩(wěn)定性好。本研究報道了一種簡單、快速的測定橡膠樹樹皮H₂O₂的方法，為進一步研究橡膠樹中H₂O₂的生理功能打下良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 橡膠樹;樹皮;過氧化氫;測定中圖分類號? S794.1 ?????文獻標(biāo)識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.009

活性氧（ROS）包括羥基自由基（HO×）、單線態(tài)氧（¹O₂）、超氧陰離子（O₂^-）和過氧化氫（H₂O₂）幾種形式^[1]，其中H₂O₂是相對穩(wěn)定的一種活性氧。植物在生物/非生物脅迫下，活性氧產(chǎn)生過剩，從而激活各種脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑加強植物對生物/非生物脅迫的抗性。研究表明，H₂O₂是一種有效的信號分子，在植物生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)中具有重要的生理功能^[2];H₂O₂是脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心成員，通過H₂O₂免疫能增強植物對非生物脅迫的抵抗能力^[3]。因此，研究植物體內(nèi)H₂O₂的含量變化有助于確認(rèn)植物提高非生物脅迫耐性的生物技術(shù)策略。

最近研究發(fā)現(xiàn)，機械傷害誘導(dǎo)橡膠樹萌條的次生乳管分化依賴H₂O₂^[4]。此外，割膠是天然橡膠生產(chǎn)的必需環(huán)節(jié)，也是橡膠樹樹皮遭遇的機械傷害。受傷的樹皮組織中產(chǎn)生的H₂O₂對于傷口愈合可能有重要的調(diào)節(jié)作用。

Matsubara等^[5]在測定血清中自由脂肪酸（FFA）含量時建立了一種測定H₂O₂的Ti（Ⅳ）- PAR-H₂O₂比色法，該方法靈敏度高、特異性強，被廣泛用于植物內(nèi)源H₂O₂含量測定。以此為基礎(chǔ)報道了2種常用的植物H₂O₂提取測定方法：Patterson等^[6]報道的5%三氯乙酸（5%TCA）提取、活性炭（0.1 g/mL）脫色的Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法，以及呂波等^[7]、劉俊等^[8]報道的丙酮提取、萃取脫色的Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法。但在用Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法測定植物H₂O₂時，因植物種類和組織的不同，不同研究所用的植物H₂O₂樣品制備方法和Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的反應(yīng)條件不一致^{[5-6， 8-9]}。為此，本研究系統(tǒng)的探索了pH、溫育時間、光照、過氧化氫酶（CAT）等因素對Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂復(fù)合物形成和吸光值的影響，評價了報道的2種植物H₂O₂常用提取方法（丙酮提取法和5% TCA提取法）對橡膠樹萌條韌皮部H₂O₂的提取效果，以期建立一種簡單、快速和重復(fù)性好的橡膠樹樹皮中H₂O₂含量的測定方法，為進一步研究橡膠樹中H₂O₂的生理功能打下良好基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 巴西橡膠樹無性系CATAS7- 33-97一年生萌條（3-5蓬葉），穩(wěn)定期頂蓬的節(jié)間韌皮部。

1.1.2? 主要試劑和儀器? 所用試劑均為分析純。其中TiCl₄溶液購自Sigma公司，4-（2-吡啶偶氮）-間苯二酚（PAR，4-（2-pyridylazo） resorcinol）購自上海生工，過氧化氫酶（CAT）購自Solarbio公司，HCl溶液、NaOH、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄等為國產(chǎn)分析純。比色用分光光度計為BioMate 5（Thermo，America）。

1.2? 方法

1.2.1? Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的條件優(yōu)化 ?Ti（Ⅳ）-PAR試劑配制參照Matsubara等^[5]的方法，Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色反應(yīng)體系參照劉俊等^[8]的方法：反應(yīng)體系為3 mL，以H₂O為空白、3 mL Ti-PAR體系（H₂O 1 mL、0.2 mol/L PBS 1 mL、0.2 mmol/L Ti-PAR 1 mL）為對照、3 mL Ti-PAR- H₂O₂體系（H₂O₂1 mL、0.2 mol/L PBS 1 mL、0.2 mmol/L Ti-PAR 1 mL）為樣品，測定508 nm處的吸光值（A_{508 nm}）。用對照與空白之間的ΔA_{508 nm}值代表Ti-PAR的吸光值，樣品與對照之間的ΔA_{508 nm}值代表Ti-PAR-H₂O₂的吸光值。以1 mol/L Na₂HPO₄和1 mol/L NaH₂PO₄為母液，根據(jù)《分子克隆實驗指南》^[10]中的方法配制出pH分別為6.0、7.0、7.4、7.8、8.0的0.2 mol/L PBS緩沖液。用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0的PBS緩沖液，分別配制pH為9.0、10.0、11.0、12.0的PBS緩沖液。用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0的PBS緩沖液，配制pH為5.0的PBS緩沖液。以水為空白掃描300～ 600 nm的吸收光譜，確定PAR（0.031 25 mmol/L）、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂的吸收光譜。

（1）0.2 mol/L PBS緩沖液的pH對PAR、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物吸收光譜的影響。在不同的pH條件下建立0.05 μmol H₂O₂（1 mL 50 μmol/L H₂O₂）的比色體系，以水為空白掃描300～600 nm的吸收光譜，確定PAR（0.031 25 mmol/L）、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂的吸收光譜。

（2）0.2 mol/L PBS緩沖液的pH對H₂O₂測定的影響。在不同的pH條件下建立0.05 μmol H₂O₂的比色體系，確定Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物形成的最適pH。

（3）45 ℃加熱時間對Ti-PAR消除以及Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的影響。建立pH 7.8和pH 12.0條件下0.05 μmol H₂O₂的比色體系，確定Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物形成以及Ti-PAR消除的最佳溫育時間。

（4）Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的檢測限（LOD）、定量限（LOQ）分析。在pH 7.8條件下，建立0.05 μmol H₂O₂的比色體系（10次重復(fù)），從而得到10次結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），參照Takanami等^[11]、Simth等^[12]的方法，分別用標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍和10倍表示檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。

（5）Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的光穩(wěn)定性檢驗分析。在pH 7.8條件下，建立0.05 μmol H₂O₂的比色體系（10次重復(fù)），反應(yīng)結(jié)束（記為0 h）后平分為2組，分別在室溫避光和室溫非避光條件下放置0、6、12、24 h后測定508 nm的吸光度，研究Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的光穩(wěn)定性和時間穩(wěn)定性。

（6）Ti-PAR-H₂O₂法測定H₂O₂的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。在pH 7.8條件下，建立0.0～0.1 μmol H₂O₂的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于植物樣本中H₂O₂的定量分析。

（7）過氧化氫酶（CAT）用量的確定。在pH 7.8條件下，在1 mL 100 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)H₂O₂（0.1 μmol H₂O₂）水溶液中加入不同量的CAT（0、10、20、30、40、50、60 μg，1 μg/μL），30 ℃消化10 min后建立比色體系，確定消化0.1 μmol H₂O₂所需的過氧化氫酶（CAT）量。

1.2.2? 巴西橡膠樹CATAS-7-33-97萌條樹皮中H₂O₂的提取和含量測定? 方法Ⅰ：丙酮提取、萃取脫色的Ti-PAR-H₂O₂比色法，采用呂波等^[7]、劉俊等^[8]的方法。在液氮下將樣品研磨成粉，取0.2 g粉末，加3 mL冷丙酮充分混勻，冰上萃取10 min，期間間歇渦混3～4次;4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取1 mL丙酮提取物，加3 mL萃取劑（CCl₄∶CHCl₃=3∶1，V/V），混勻，再加入5 mL滅菌ddH₂O，立即渦混，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上層水相為H₂O₂待測液;各取1 mL待測液，一份作空白，加入50 ?L（1 ?g/?L）過氧化氫酶（CAT），30 ℃保溫10 min;另一份待測液，加入50 ?L水;分別加入1 mL 0.2 mol/L pH 7.8的PBS緩沖溶液和1 mL 0.2 mmol/L的Ti（Ⅳ）-PAR顯色劑，室溫反應(yīng)10 min，45 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，測508 nm的吸光值，根據(jù)ΔA_{508 nm}值計算H₂O₂含量。

方法Ⅱ：5% TCA提取的Ti-PAR-H₂O₂比色法。參照Patterson等^[6]、Zhou等^[13]的方法，本研究建立了不使用活性炭的5% TCA提取法^[4]。在液氮下將樣品研磨成粉，取0.1 g粉末，加5 mL 5% TCA充分混勻，冰上萃取10 min，期間間歇渦混3～4次;4 ℃、12 000 r/min離心10 min;取上清1.5 mL，加1.5 mL 5% TCA稀釋2倍，加等體積（3 mL）0.2 mol/L Na₂HPO₄（Sodium Phosphate，pH 12.6）溶液調(diào)節(jié)pH到8.0左右;4 ℃、12 000 r/min、離心10 min;各取2 mL待測液，一份作空白，加入50 ?L（1 ?g/?L）過氧化氫酶（CAT），30 ℃保溫10 min;另一份待測液，加入50 ?L水;分別加入1 mL 0.2 mmol/L的Ti（Ⅳ）-PAR顯色劑，室溫反應(yīng)10 min，45 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，測508 nm的吸光值，根據(jù)ΔA_{508 nm}值計算H₂O₂的含量。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003軟件作圖，利用SPSS?比較均值?單因素ANOVA?R-E-G-Q（Q）檢驗對結(jié)果進行差異顯著性分析：標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著（p<0.01），標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著（p<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的條件優(yōu)化

2.1.1 ?0.2 mol/L PBS緩沖液的pH對PAR、Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物吸收光譜的影響

結(jié)果表明，pH在5.0～11.0范圍時，Ti-PAR、Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的吸收光譜一致，在此以pH 7.8的結(jié)果作代表，而pH 12.0的吸收光譜大不相同。由圖1可以看出，PAR（圖1-1）的最大吸收波長為413 nm，Ti-PAR（圖1-4）的最大吸收波長為481 nm，Ti-PAR-H₂O₂（圖1-3）的最大吸收波長為508 nm;當(dāng)pH≤11.0時，45 ℃溫育能消除多余的Ti-PAR，僅出現(xiàn)1個類似于PAR的吸收峰，從而消除Ti-PAR反應(yīng)試劑對H₂O₂測定的干

擾（圖1-2）;但當(dāng)pH為12.0時，45 ℃溫育未能完全消除多余的Ti-PAR，Ti-PAR在508 nm處仍有很強的吸收，強烈干擾H₂O₂測定（圖1-4），從而導(dǎo)致Ti-PAR-H₂O₂的最大吸收波長提前到500 nm，測定結(jié)果偏高（圖1-5）。結(jié)果表明，在合適的pH條件下，加熱能充分消除多余Ti-PAR對測定結(jié)果的干擾。

2.1.2? 0.2 mol/L PBS緩沖液的pH對H₂O₂測定的影響? 由圖2-A的結(jié)果可以看出，pH<11.0時，對照的吸光度低，表明Ti-PAR對測定結(jié)果的干擾小;pH>11.0時，對照的吸光度升高，表明Ti-PAR對測定結(jié)果的干擾大;pH<7.0時，H₂O₂的測定結(jié)果偏低，pH為7.0～11.0時，H₂O₂的測定結(jié)果相對穩(wěn)定并且在pH為7.4～8.0時測定結(jié)果最高;pH>11.0時，H₂O₂的測定結(jié)果偏低;pH>11.0時，隨著Ti-PAR干擾的增加，反應(yīng)體系的吸光度隨之增加。pH為7.4、7.8、8.0時對照、樣品以及它們之間的差值差異不顯著，重復(fù)性好。因此Ti- PAR-H₂O₂法的最適pH為7.4～8.0。在植物材料H₂O₂測定中本研究采用的pH為7.8。

2.1.3? 加熱時間對Ti-PAR消除以及Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的影響? 將反應(yīng)體系室溫反應(yīng)10 min后，在45 ℃下溫育不同時間。結(jié)果表明，pH為7.8時（圖2-B），反應(yīng)體系中加入Ti-PAR后，多余的Ti-PAR很快消除，室溫10 min就能消除大部分多余的Ti-PAR，并且45 ℃溫育5 min就足以消除多余的Ti-PAR，使對照反應(yīng)獲得穩(wěn)定的較低的吸光度;而pH為12（圖2-C）時，反應(yīng)體系中

加入Ti-PAR后，雖然對照反應(yīng)很快就獲得穩(wěn)定的吸光度，但仍然保持很高的水平，是pH 7.8時的6倍以上，并且延長加熱時間到620 min也無法消除Ti-PAR對H₂O₂測定的干擾，說明在強堿性條件下Ti-PAR比較穩(wěn)定（與圖2-A的結(jié)果一致）。另一方面，不同的溫育時間之間Ti-PAR-H₂O₂三元復(fù)合物的吸光度差異不大，說明Ti-PAR-H₂O₂三元復(fù)合物形成速度快并且具有優(yōu)良的溫度穩(wěn)定性。溫育的作用一方面是消除多余Ti-PAR對測定結(jié)果的干擾，另一方面是促進Ti-PAR-H₂O₂三元復(fù)合物的顯色反應(yīng)。因此在植物材料H₂O₂測定中本研究采用的是室溫反應(yīng)10 min，45 ℃、20 min，使H₂O₂完全形成Ti-PAR-H₂O₂三元復(fù)合物。

2.1.4? Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的檢測限（LOD）、定量限（LOQ）檢驗分析? 用本方法測定H₂O₂，吸光值A_{508 nm}的LOD和LOQ的值分別為0.020和0.066，H₂O₂濃度的LOD和LOQ的值分別為1.6 μmol/L和5.3 μmol/L。

2.1.5? Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物的光穩(wěn)定性檢驗分析 ?圖2-D的結(jié)果表明，每個時間點中蔽光與否的結(jié)果均無顯著差異，說明Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物在光線下具有良好的穩(wěn)定性;蔽光條件下各時間點間的結(jié)果無顯著差異，非蔽光條件下各時間點間的結(jié)果也幾乎無顯著差異（雖然放置24 h的結(jié)果與0 h的結(jié)果達到0.05的顯著水平，但差異很小），說明Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.6? Ti-PAR-H₂O₂法測定H₂O₂的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=12.528x，R²=0.998 7（圖2-E），其中y表示A_{508 nm}的吸光值，x表示H₂O₂的量（單位μmol）。

2.1.7? 過氧化氫酶（CAT）用量的確定? 圖2-F的結(jié)果表明，隨著CAT用量增加，ΔA_{508 nm}的值減少;CAT用量從30 μg增加到60 μg，測定結(jié)果無差異，表明30 μg CAT就能完全消化1 mL 100 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)H₂O₂水溶液中的H₂O₂（含量為0.1 μmol，ΔA_{508 nm}為1.236±0.0081）。在植物材料H₂O₂測定中，以加入CAT消化的樣品為對照，將未加CAT的反應(yīng)體系的A_{508 nm}控制在1.0以內(nèi)，因此體系中的CAT用量30 μg已足夠，為了保證對照體系中的H₂O₂被CAT完全消化，實際反應(yīng)時加入的CAT量為50 μg。

2.2? 巴西橡膠樹CATAS-7-33-97萌條韌皮部中H₂O₂的提取和含量測定

本研究用2種方法測定了巴西橡膠樹CATAS- 7-33-97萌條韌皮部的H₂O₂含量（圖3）。結(jié)果表明，方法Ⅰ得到的樣品待測液（萃取后的上層水相）在508 nm處的吸光值幾乎為零，而有機相（萃取劑）在508 nm處的吸光值為0.416 7，說明萃取能有效去除色素，用此方法測得萌條韌皮部的H₂O₂含量為1.86 ?mol/g（鮮重）左右，但隨著提取時間延長到3 d，該方法幾乎測不到H₂O₂含量，說明此方法的穩(wěn)定性不好，丙酮不能完全抑制橡膠樹樹皮中的CAT酶活性;方法Ⅱ得到的樣品待測液（5% TCA提取相）在508 nm處的吸光值也很低，說明用5% TCA為提取液，經(jīng)過本文的制備流程，樣品中幾乎沒有色素的干擾，用此方法測得萌條韌皮部的H₂O₂含量為3.99 ?mol/g（鮮重）左右，并且隨著提取時間延長到3 d，H₂O₂含量幾乎不變，說明此方法的穩(wěn)定性好，5% TCA能完全抑制橡膠樹樹皮中的CAT酶活性。

3? 討論

3.1? 生物體中H₂O₂含量測定的分光光度法

H₂O₂含量測定的分光光度法主要有3種。第一種是Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法^{[6， 14-16]}：H₂O₂與Ti（Ⅳ）離子在堿性條件下形成Ti（Ⅳ）-H₂O₂沉淀，溶于5%硫酸后在410 nm處有最大的光吸收;經(jīng)丙酮提取、Ti（Ⅳ）沉淀H₂O₂、丙酮洗滌脫色，測得正常條件下黃瓜子葉H₂O₂含量差異大，為0.75～ 6.82 ?mol/g（鮮重）^[15-16]。第二種是醌亞胺比色法^{[13， 17]}：H₂O₂在過氧化物酶的作用下與4-氨酰安替比林和苯酚反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物醌亞胺，在505 nm處有最大的光吸收^[17];經(jīng)5% TCA提取、0.15 g活性炭脫色，測得8種植物葉片H₂O₂為0.2～0.8 ?mol/g（鮮重）^[13]。第三種是Ti（Ⅳ）- PAR-H₂O₂比色法^[5-6]：H₂O₂與Ti（Ⅳ）-PAR反應(yīng)形成三元復(fù)合物，在508 nm處有最大的光吸收^[5];經(jīng)5% TCA提取、0.7 g活性炭脫色，測得5種植物葉片中H₂O₂為0.1～0.6 ?mol/g（鮮重）^[6]，經(jīng)丙酮提取、萃取脫色，測得5種植物葉片H₂O₂為0.1～0.8 ?mol/g（鮮重）^[7-8]。

Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的靈敏度約是醌亞胺比色法的5倍^[5]、Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法的38.5倍^[7]。Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法的特異性最差，標(biāo)準(zhǔn)的Ti（Ⅳ）-H₂O₂復(fù)合物的吸收光譜是以410 nm為中心的峰，而測定植物葉片提取物中H₂O₂時沒有獲得類似的吸收峰，認(rèn)為吸光度A₄₁₀大部分來自色素等干擾物質(zhì)^[6]，對小麥葉片的研究表明，96.8%的A₄₁₀來自背景和色素^[7]，因此，此方法大都過高估計葉片中的H₂O₂水平;醌亞胺比色法的顏色形成需要過氧化物酶，已知過氧化物酶促進色原體如4-氨酰安替比林-苯酚和其他還原性物質(zhì)如抗壞血酸等的氧化，由于過氧化物酶的不完全選擇性，還原性物質(zhì)如抗壞血酸通過H₂O₂明顯抑制色原體顏色的形成，顯著降低H₂O₂的回收率^{[13， 17]};Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂法通過Ti（Ⅳ）-PAR試劑的顏色形成不需要過氧化物酶，因此，吸光度幾乎不受還原性物質(zhì)如抗壞血酸的影響^[5]。醌亞胺的光吸收在反應(yīng)起始后5～20 min內(nèi)保持穩(wěn)定^[13];Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂復(fù)合物在反應(yīng)起始后的幾分鐘內(nèi)就能獲得穩(wěn)定的吸光值，在室溫下可保持穩(wěn)定超過24 h^[5]。

Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性都最好。本文系統(tǒng)地探索了該方法的反應(yīng)條件。結(jié)果表明，PAR、Ti-PAR-H₂O₂的吸收光譜與Matsubara等^[5]報道的一致，但Ti-PAR的吸收光譜（A_max481 nm）與Matsubara等^[5]報道的（A_max523 nm）有一定差異;Ti-PAR-H₂O₂顏色形成最適pH為7.4～11.0，與Matsubara等^[5]報道的7.6～ 12.0有些微差異;安鈺^[9]要求在蔽光條件下保存反應(yīng)產(chǎn)物Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物，本研究表明Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物在正常條件下很穩(wěn)定，不需要刻意蔽光保存;Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，與Matsubara等^[5]報道的一致;Ti（Ⅳ）- PAR-H₂O₂復(fù)合物具有很好的光穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。

3.2? 植物樣本中H₂O₂的提?。ㄖ苽洌┓椒?/b>

活體植物材料中含有高水平的過氧化氫酶、過氧化物酶活性，抑制這些酶活性是H₂O₂提取的重要環(huán)節(jié)，有機溶劑丙酮作為提取劑能抑制酶活性，但后續(xù)反應(yīng)中不能應(yīng)用CAT。TCA作為水相提取劑能變性酶類，能應(yīng)用CAT，對比色反應(yīng)影響小，H₂O₂的回收率高^[6]。去除干擾物質(zhì)是精確測定H₂O₂的又一個前提，色素和還原性物質(zhì)是H₂O₂測定的主要干擾因素，丙酮洗滌脫色^{[6-7， 14-16]}、活性炭脫色^{[6， 13]}和萃取脫色^[7-8]是目前去除色素的主要手段。丙酮洗滌脫色主要與丙酮提取、Ti（Ⅳ）-H₂O₂沉淀法配合使用。當(dāng)用酸性Ti（Ⅳ）試劑處理時，深綠色的植物提取物變成茶褐色，用丙酮或其他溶劑洗滌脫色失敗，此法獲得的A₄₁₀大部分來自色素和背景干擾物^{[5， 7]};活性炭既能去除色素、還原性物質(zhì)如抗壞血酸等干擾物，提高H₂O₂的穩(wěn)定性^[13]，又能強烈吸附H₂O₂，降低H₂O₂的回收率^{[7-8， 13]}。在丙酮提取法中，呂波等^[7]、劉俊等^[8]報道了一種以CCl₄/CHCl₃（3∶1，V/V）為萃取劑的萃取脫色法，能有效去除樣品中的色素，H₂O₂的回收率在95%～99%，在后續(xù)比色反應(yīng)中還可應(yīng)用CAT制備對照。

本研究結(jié)果表明，丙酮不能有效抑制橡膠樹樹皮中的CAT活性，不適合用作橡膠樹樹皮H₂O₂的提取劑，蔡甫格^[18]的研究也表明，直接用丙酮提取橡膠樹膠乳中的H₂O₂，測定結(jié)果重復(fù)性不好、準(zhǔn)確性不高。用于植物葉片H₂O₂提取的TCA法，常用活性炭來吸附色素^{[6， 13]}，但活性炭也能大量吸附H₂O₂^{[7-8， 13]}，降低H₂O₂回收率，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果還表明，直接用TCA提取橡膠樹樹皮中的H₂O₂，幾乎提取不到色素，也避免了使用活性炭對H₂O₂的吸附，結(jié)果穩(wěn)定性好;用方法Ⅱ成功檢測到不同處理條件下橡膠樹萌條韌皮部H₂O₂水平的差異^[4]。在橡膠樹樹皮中，方法Ⅱ優(yōu)于方法Ⅰ，與小麥葉片^[7-8]中的表現(xiàn)相反;用5% TCA提取、0.15 g活性炭脫色、醌亞胺比色法成功檢測到柱花草葉片中的H₂O₂，而用5% TCA提取、0.1 g活性炭和0.1% PVPP脫色、Ti（Ⅳ）-PAR-H₂O₂比色法失敗^[13]。以上結(jié)果表明，不同類型的植物材料所適合的H₂O₂提取、純化和測定方法可能不同。

3.3? H₂O₂和CAT在酸性條件下的穩(wěn)定性

研究表明，雙氧水（H₂O₂）在pH<3.5的強酸性條件才穩(wěn)定^[19]，酸性環(huán)境（pH<5.0）對雙氧水的催化分解有明顯的抑制作用^[20-22];生物體中的CAT不耐酸，在酸性環(huán)境穩(wěn)定性差、活性低^[23-27];因此在CAT活性測定中常采用強酸終止反應(yīng)^{[24，26， 28-29]}。這是本研究用5% TCA（pH<1.0）提取H₂O₂的優(yōu)點之一，既保證了H₂O₂的穩(wěn)定性又抑制了CAT活性。

4? 結(jié)論

本文建立了一種簡單、快速、有效的適合橡膠樹穩(wěn)定期萌條樹皮中H₂O₂的測定方法：5% TCA提取，Ti-PAR-H₂O₂（pH=7.8，室溫反應(yīng)10 min，45 ℃溫育20 min）比色法。用酸性的5% TCA作為提取液，既保證了H₂O₂的穩(wěn)定性又抑制了樣本中的CAT活性，5% TCA對樣品中的色素幾乎無提取能力，因此不需要活性炭脫色，從而避免了活性炭對H₂O₂的吸附。Ti-PAR-H₂O₂復(fù)合物顏色形成的最適pH為7.4～11.0，考慮到測定植物樣品H₂O₂時對照需要CAT消化H₂O₂，為了保證加入的CAT活性，建議反應(yīng)體系的pH為7.4～8.0;Ti- PAR-H₂O₂復(fù)合物形成快速、特異且穩(wěn)定，保證了測定結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。橡膠樹萌條樹皮（綠色）中含有大量的色素，因此本研究建立的方法適用于橡膠樹樹皮和葉片H₂O₂含量測定，但是否適用于橡膠樹膠乳中H₂O₂含量測定尚不清楚。

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