利用SRAP分子標(biāo)記分析杧果種質(zhì)遺傳多樣性

羅世杏 唐玉娟 黃國(guó)弟 宋恩亮

摘? 要? 利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)自12個(gè)國(guó)家或地區(qū)的54份杧果種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并對(duì)SRAP標(biāo)記在杧果研究中的效率做了探討。結(jié)果表明，SRAP標(biāo)記在杧果種質(zhì)中具有豐富的多態(tài)性，引物多態(tài)性條帶百分比在79.31%～100%，平均為93.10%;引物的有效等位基因數(shù)（N_e）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）平均值分別為1.73、0.41、0.60和0.87，表明SRAP標(biāo)記具有較高的多態(tài)性檢測(cè)效率。基于SRAP標(biāo)記計(jì)算獲得的遺傳相似系數(shù)對(duì)杧果種質(zhì)做聚類(lèi)分析，54份杧果種質(zhì)可被劃分為3個(gè)類(lèi)群。主成分分析與聚類(lèi)分析反映的種質(zhì)親緣關(guān)系基本一致。

關(guān)鍵詞? 杧果;序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性;遺傳多樣性;聚類(lèi)分析;主成分分析中圖分類(lèi)號(hào)? S667.7 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.007

杧果為著名熱帶水果之一，因其果肉細(xì)膩，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛(ài)，素有“熱帶果王”之譽(yù)稱(chēng)。我國(guó)杧果栽培已有1 300多年歷史。經(jīng)適栽培地區(qū)有廣西、廣東、海南、四川、云南、臺(tái)灣等省區(qū)。目前廣西壯族自治區(qū)杧果種植面積已居全國(guó)各種植省區(qū)的首位，但杧果種質(zhì)資源研究手段相對(duì)落后，傳統(tǒng)的自然雜交、田間選育等育種手段的廣泛使用導(dǎo)致杧果雜交親本選配上仍存在很大的盲目性，限制現(xiàn)有杧果種質(zhì)資源的有效利用。隨著植物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、指紋圖譜的繪制、種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究、基因定位等分子生物學(xué)方法^[1-3]的廣泛應(yīng)用，從分子水平上為評(píng)估不同種質(zhì)間的遺傳多樣性提供了技術(shù)支持，借助分子生物學(xué)的手段輔助選擇育種，為廣西現(xiàn)有杧果種質(zhì)資源研究創(chuàng)新利用提供新的思路，提高育種效率。近年來(lái)，ISSR標(biāo)記^[4]、AFLP標(biāo)記^[5]、SRAP標(biāo)記^[6]、SSR標(biāo)記^[7]及SCoT標(biāo)記^[8]均已應(yīng)用于杧果遺傳多樣性方面的研究，但前人借助SRAP分子標(biāo)記手段進(jìn)行杧果遺傳多樣性分析的供試材料數(shù)量少，來(lái)源不夠廣泛，系統(tǒng)性和代表性不足，不利于廣西杧果種質(zhì)資源的挖掘和利用。

SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的標(biāo)記技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、可靠、中通量率以及高百分率的片段來(lái)自編碼區(qū)的特點(diǎn)。SRAP標(biāo)記主要用于生物多樣性的分類(lèi)鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記、基因克隆和雜種優(yōu)勢(shì)利用等^[9-11]，SRAP技術(shù)的獨(dú)特引物設(shè)計(jì)，在具備了RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)還彌補(bǔ)了其存在的缺陷^[12]，在育種目標(biāo)性狀的評(píng)價(jià)方面優(yōu)于其他標(biāo)記方法，目前已廣泛應(yīng)用于香蕉、蘋(píng)果、荔枝等園藝作物^[13-18]的遺傳多樣性分析，是一個(gè)評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定的有效工具^[8]。本研究在前期的研究^[19]基礎(chǔ)上采用SRAP標(biāo)記進(jìn)一步對(duì)來(lái)自12個(gè)國(guó)家和地區(qū)的54份杧果種質(zhì)進(jìn)行較為系統(tǒng)的親緣關(guān)系探究和遺傳多樣性分析，為有效整理分類(lèi)廣西杧果種質(zhì)資源、保護(hù)和利用現(xiàn)有種質(zhì)提供理論支持，為今后杧果育種的親本選配提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

54份杧果種質(zhì)資源來(lái)自世界上12個(gè)不同國(guó)家和地區(qū)（表1），由國(guó)家杧果種質(zhì)資源保護(hù)廣西創(chuàng)新基地提供。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取? 每份材料隨機(jī)采集10片杧果嫩葉，采用CATB法提取杧果嫩葉的基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? SRAP標(biāo)記檢測(cè)? 選擇栽培地域遠(yuǎn)、表型差異大的5份杧果DNA作模板，用144對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表2），篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的引物32對(duì)。SRAP-PCR擴(kuò)增參照趙英等^[16]的方法，PCR擴(kuò)增體系為：94 ℃預(yù)變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，5個(gè)循環(huán);94 ℃預(yù)變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用7.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，并拍照記錄。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品的擴(kuò)增電泳帶型按有（1）和無(wú)（0）記錄，建立分子數(shù)據(jù)矩陣，不同膠板以DNA電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)、特征帶和公共帶對(duì)應(yīng)，找到對(duì)應(yīng)條帶。利用NTSYS 2.10軟件通過(guò)非加權(quán)平均法（UPMGA）計(jì)算杧果種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并在此基礎(chǔ)上作聚類(lèi)分析及主成分分析。采用POPGENE 32軟件估算SRAP分子標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)：引物擴(kuò)增總條帶數(shù)（TNB）、多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）、多態(tài)性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數(shù)（N_e）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）。

2? 結(jié)果與分析

2.1 ?SRAP-PCR引物的篩選與擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

SRAP正反向引物各12條，兩兩組合成144個(gè)引物組合，用5個(gè)地域來(lái)源遠(yuǎn)、表型差異大的杧果試材對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，最終選出32個(gè)擴(kuò)增條帶清晰并且重復(fù)性和多態(tài)性良好的引物組合，引物組合me1-em5擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

利用32對(duì)引物組合對(duì)54份杧果試材進(jìn)行擴(kuò)增，具體擴(kuò)增結(jié)果匯總于表3。從表3可以看出，共擴(kuò)增出898條清晰可見(jiàn)的條帶，其中多態(tài)性條帶836條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為28.06條，多態(tài)性比率（PPB）為93.10%;單對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的總條帶數(shù)差異較大，每對(duì)引物組合擴(kuò)增出的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)分別為16～37條和16～36條不等;多態(tài)性條帶百分比在不同引物間也有較大差異，其分布在79.31%～100%。有效等位基因數(shù)N_e的變異范圍為1.52～1.96，平均為1.73;Neis基因多樣性指數(shù)H分布在0.33～0.49，均值為0.41;Shannons信息指數(shù)I介于0.51～0.68，平均值為0.60;多態(tài)性信息含量（PIC）主要變化范圍在0.80～0.92，其均值為0.87。結(jié)合這些引物的綜合表現(xiàn)，SRAP標(biāo)記對(duì)杧果種質(zhì)資源具有較強(qiáng)的鑒別能力，適合于杧果遺傳多樣性關(guān)系研究。

2.2? 不同杧果種質(zhì)聚類(lèi)分析

基于SRAP標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果，用NTSYS 2.10軟件計(jì)算杧果試材資源間的遺傳相似系數(shù)（GS），構(gòu)建了54份杧果種質(zhì)的遺傳聚類(lèi)分析圖（圖2）。從圖2可知，在遺傳相似系數(shù)0.695的位置大致可將54份杧果種質(zhì)資源劃分為3個(gè)大類(lèi)群，其中第I類(lèi)群包括的杧果種質(zhì)數(shù)量最多，主要是國(guó)內(nèi)各省區(qū)的杧果種質(zhì)資源，為29個(gè)，占總數(shù)的53.70%;第II類(lèi)群包括9個(gè)杧果種質(zhì)，來(lái)自于緬甸、泰國(guó)、印度等東南亞國(guó)家，說(shuō)明這些地區(qū)的杧果種質(zhì)可能具有較為相似的遺傳背景;除了南逗邁4號(hào)外，美國(guó)、澳大利亞和越南的杧果種質(zhì)組成了第III類(lèi)群，南逗邁4號(hào)芒分在了第III類(lèi)群可能是因?yàn)槠溥z傳背景較為復(fù)雜。而越南杧果種質(zhì)的遺傳關(guān)系研究報(bào)道較少，現(xiàn)有資料中無(wú)法得知其親本的遺傳背景，還需進(jìn)一步探究其與美國(guó)、澳大利亞聚為一類(lèi)的原因。從圖2還能清楚地看出，在相似系數(shù)以0.72為截值時(shí)，可將第I類(lèi)群分為3個(gè)亞類(lèi)群。第I亞類(lèi)群除了矮芒外，其余種質(zhì)均來(lái)自于廣西各地的杧果種質(zhì)，這一亞類(lèi)群的13份杧果資源相關(guān)系數(shù)在0.725以上;第II亞類(lèi)群絕大多數(shù)來(lái)自于云南，與四川金龍芒聚為一類(lèi)，這與黃麗芳等^[7]的研究分類(lèi)基本一致。這可能是因?yàn)榻瘕埫⑹驱堁巯忝⑴c三年芒雜交獲得的植株。第III亞類(lèi)混合了四川、海南、廣東、臺(tái)灣的杧果種質(zhì)，共有8份資源，這一亞類(lèi)中存在相關(guān)系數(shù)為1的情況，如乳芒和龍眼香芒，這可能是因?yàn)槿槊⑹驱堁巯忝⒌膶?shí)生后代。第II類(lèi)群的杧果種質(zhì)主要由印度、緬甸和泰國(guó)的杧果種質(zhì)組成。

2.3? 杧果種質(zhì)的主成分分析

基于SRAP標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)54份杧果種質(zhì)做了主成分分析形成平面圖（圖3）。前3個(gè)主坐標(biāo)所能解釋的相關(guān)性分別為0.21%、0.18%和0.26%。圖3中不同杧果種質(zhì)位置距離的遠(yuǎn)近反映了其親緣關(guān)系的密切程度，種質(zhì)間距離越近，說(shuō)明遺傳關(guān)系越近，遠(yuǎn)離則說(shuō)明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。利用主成分分析對(duì)54份杧果種質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，共得到5個(gè)主要類(lèi)群（A、B、C、D和E類(lèi)群）。其中A群分布在第1象限，B類(lèi)群主要分布在第1和第3象限，C類(lèi)群主要分布在第2象限，D類(lèi)群分布在第2、第3和第4象限，E類(lèi)群分布在第4象限。這與UPGMA聚類(lèi)結(jié)果相似，A、B和C類(lèi)群相當(dāng)于UPGMA聚類(lèi)中的第I類(lèi)群的三個(gè)亞類(lèi)，D類(lèi)群和E類(lèi)群分別相當(dāng)于第II和第III類(lèi)群。云南矮芒距離廣西杧果群較云南杧果群更近，因此將其與廣西杧果種質(zhì)歸為一類(lèi)，這與UPGMA聚類(lèi)結(jié)果一致。第II類(lèi)群中的貴妃芒在主成分分析中歸入D類(lèi)群，可能是因?yàn)橘F妃是白象牙與凱特的雜交后代。E類(lèi)群中的海豹杧交錯(cuò)在第1象限中，可能是因?yàn)楹１⑹莵?lái)自印度尼西亞的杧果種質(zhì)資源，其遺傳背景較為復(fù)雜。比較圖2和圖3可以看出，系統(tǒng)分類(lèi)法和主成分分類(lèi)法所得的分類(lèi)結(jié)果基本一致，主成分分析結(jié)果能夠?qū)垲?lèi)結(jié)果進(jìn)行直觀解釋和側(cè)證。

3? 討論

3.1? 杧果種質(zhì)SRAP標(biāo)記的多態(tài)性和有效性分析

序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）是一個(gè)基于PCR的標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、較易對(duì)擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行測(cè)序的特點(diǎn)，正向引物和反向引物兩兩結(jié)合的方式可以通過(guò)少量的引物得到多對(duì)引物對(duì)，從而提高引物的使用效率。本研究用32對(duì)引物對(duì)54份供試材料進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，擴(kuò)增出898條DNA條帶，平均多態(tài)性條帶百分比為93.10%，遠(yuǎn)高于趙英等^[6]利用22對(duì)SRAP引物組合對(duì)12份杧果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究的結(jié)果，這可能是因?yàn)楸狙芯渴占墓┰嚥牧蠑?shù)量更為豐富，并且采用的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染等實(shí)驗(yàn)手段，分辨率更高。石勝友等^[20]研究獲得的總擴(kuò)增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)位、多態(tài)性條帶百分比明顯低于本研究的SRAP分子標(biāo)記。黃麗芳等^[7]和Luo等^[8]分別采用SSR和SCoT分子標(biāo)記手段，其所獲得的擴(kuò)增條帶數(shù)及多態(tài)性信息含量均低于本研究。本研究還對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在杧果種質(zhì)多態(tài)性方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)分析，共參考了擴(kuò)增條帶總數(shù)（TNB）、多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）、多態(tài)性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數(shù)（N_e）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）共7個(gè)參數(shù)。在PPB方面，有7對(duì)引物組合基因組擴(kuò)增條帶的多樣性達(dá)到了100%，平均多態(tài)性條帶百分比為93.10%，說(shuō)明SRAP標(biāo)記在杧果基因組中具有豐富的多態(tài)性。N_e、H、I作為SRAP引物多態(tài)性評(píng)價(jià)的重要參數(shù)，在本研究中表現(xiàn)良好，其平均值分別達(dá)到了1.73、0.41和0.60。作為評(píng)價(jià)分子標(biāo)記多態(tài)性的重要指標(biāo)，本研究中的PIC均值為0.87，遠(yuǎn)大于0.5，說(shuō)明本研究篩選所得的引物組合為高度多態(tài)性信息引物。較于前人利用分子標(biāo)記手段所得的數(shù)據(jù)，綜合本研究結(jié)果，評(píng)判后可說(shuō)明SRAP在杧果種質(zhì)中具有更高的鑒別能力，更能提供杧果種質(zhì)差異的遺傳信息。

3.2? 杧果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

杧果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析有助于了解種質(zhì)間的親緣遠(yuǎn)近，便于開(kāi)展種質(zhì)創(chuàng)新及新品種選育工作。本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的杧果種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析，分析結(jié)果顯示，杧果種質(zhì)資源間的遺傳變異系數(shù)均值為0.706 5，說(shuō)明杧果種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平較高，這與前人研究結(jié)果相同^[4]。從本研究SRAP擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，54份杧果種質(zhì)大致可分為3個(gè)群組，而I類(lèi)群中的廣東、海南、四川和臺(tái)灣杧果種質(zhì)與廣西杧果種質(zhì)分屬不同亞類(lèi)，這與黃麗芳等^[7]將廣東、海南和廣西杧果種質(zhì)分屬同一類(lèi)群不同，可能是因?yàn)楸狙芯克捎玫臇x果種質(zhì)試材和種質(zhì)數(shù)量與其不同，而這對(duì)遺傳多樣性水平有較大的影響。

了解杧果種質(zhì)資源的遺傳變異信息及親緣關(guān)系，是有目的地選配親本、培育優(yōu)良品種的基本手段和方法。本研究采用的2種分析方法所得的杧果種質(zhì)遺傳關(guān)系的聚類(lèi)情況與其種質(zhì)來(lái)源和生態(tài)區(qū)有較高的相關(guān)性，說(shuō)明分子標(biāo)記分析基本支持以生態(tài)型和品種來(lái)源劃分杧果品種，這與前人研究^[21]的結(jié)論基本一致。聚類(lèi)分析和主成分分析結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)的杧果種質(zhì)資源可分為3組群，大多數(shù)種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.72～0.83，而且遺傳變異度小，這可能與基礎(chǔ)育種材料的頻繁利用有關(guān)，說(shuō)明國(guó)內(nèi)杧果種質(zhì)的雜交親本遺傳差異不夠豐富，其遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。因此，在進(jìn)行杧果新品種選育時(shí)，應(yīng)加大發(fā)掘和利用國(guó)外優(yōu)良杧果種質(zhì)資源力度，注重選擇遺傳差異大的親本雜交，拓寬國(guó)內(nèi)杧果的遺傳基礎(chǔ)，提高杧果種質(zhì)資源利用率和育種效率。

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