巴西橡膠樹次生乳管分化能力的早期評(píng)價(jià)方法研究

張世鑫 劉寧濤 楊署光 陳月異 晁金泉 田維敏

摘 要 天然橡膠產(chǎn)量是通過(guò)測(cè)量割膠收集從次生乳管中流出的膠乳而得到，具有連續(xù)收獲和累進(jìn)計(jì)產(chǎn)的特點(diǎn)，這也是目前橡膠樹的產(chǎn)量構(gòu)成性狀難于剖析和橡膠樹產(chǎn)量育種周期長(zhǎng)且效率低的主要原因。橡膠樹次生乳管分化能力是決定橡膠產(chǎn)量的關(guān)鍵因子之一，通過(guò)對(duì)幼樹的次生乳管分化能力進(jìn)行早期預(yù)測(cè)對(duì)于縮短橡膠樹產(chǎn)量育種周期具有重要意義。本研究采用實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)技術(shù)，以不同樹齡和不同次生乳管分化能力的橡膠樹種質(zhì)為材料，系統(tǒng)地分析機(jī)械傷害、割膠和茉莉酸類物質(zhì)處理對(duì)其次生乳管分化能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，割膠處理相同種質(zhì)的二年生幼樹與八年生成齡未開割樹，得到次生乳管分化能力的效應(yīng)是一致的，所以使用二年生幼樹就可以較好地區(qū)分出橡膠樹種質(zhì)間的次生乳管分化能力差異。因此，割膠處理二年生幼樹的方法可以作為橡膠樹次生乳管分化能力的早期評(píng)價(jià)的有效方法。這些研究結(jié)果不僅豐富了橡膠樹產(chǎn)膠潛力的早期預(yù)測(cè)技術(shù)，而且為產(chǎn)膠潛力相關(guān)分子標(biāo)記研發(fā)打下良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；產(chǎn)量育種；早期預(yù)測(cè)；乳管分化能力；茉莉酸信號(hào)

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In natural rubber production， latex flows out of the severed secondary laticifer caused by tapping （cutting the laticifer in trunk bark） and is collected as the raw material for refining natural rubber. The secondary differentiation ability is one of the key factors to determine the latex yield in rubber tree. Therefore， the early prediction of secondary laticifer differentiation for young tree has a significant meaning to shorten the yield breeding cycle in Hevea. To achieve this goal， this study analyzed the difference in laticifer differentiation ability among Hevea germplasm with different ages， treated by mechanical wounding， tapping and jasmonates using experimental morphological techniques. It was found that a significant similarity existed in the laticifer differentiation ability of either the two-year-old germplasm or the eight-year-old germplasm. And moreover， the laticifer differentiation ability of 84% two-year-old germplasm was in accordance with the corresponding 8-year-old virgin trees under test-tapping condition. Therefore， the method of test-tapping treatment for two-year-old germplasm could be used as an effective method to the early evaluation of secondary laticifer differentiation ability. The results not only enrich the early selection technology of latex yield potential breeding， but also lay a good foundation for the research on molecular markers associated with latex yield potential breeding.

Keywords Hevea brasiliensis Muell. Arg.； yield breeding； early selection； laticifer differentiation； jasmonate signal

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.002

產(chǎn)量構(gòu)成（yield components， YC）理論最早是由Engledow等[1]提出的，并首次將作物產(chǎn)量這一綜合性狀分解成不同的構(gòu)成性狀。通過(guò)品種的自交或者雜交，將單一的構(gòu)成性狀進(jìn)行定向聚合，更容易實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)品種的培育。

巴西橡膠樹收獲的目標(biāo)是割膠后次生乳管排出的膠乳，產(chǎn)量的測(cè)定方法是單株或單位面積膠園在單位時(shí)間（年）內(nèi)生產(chǎn)的膠乳鮮重的總和，分別以g/（株·年）或t/（hm2·年）來(lái)計(jì)[2]，因此，橡膠產(chǎn)量的測(cè)定方法具有連續(xù)收獲、累進(jìn)計(jì)產(chǎn)的特點(diǎn)[3]。所以，與普通作物相比，橡膠樹產(chǎn)量是一個(gè)典型的綜合性狀。由于橡膠樹產(chǎn)量育種的構(gòu)成性狀難于剖析，導(dǎo)致了橡膠樹育種周期長(zhǎng)、效率低這一現(xiàn)狀。隨著對(duì)橡膠樹樹皮結(jié)構(gòu)[4-9]以及產(chǎn)排膠生理研究的深入[10-14]，人們發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生和貯存膠乳的次生乳管數(shù)量的多少、排膠時(shí)間的長(zhǎng)短、橡膠合成效率的高低等因子對(duì)膠乳產(chǎn)量起著決定作用，可以作為構(gòu)成性狀來(lái)剖析橡膠產(chǎn)量的形成。其中，次生乳管數(shù)量是決定橡膠產(chǎn)量的最重要因素，橡膠樹分化乳管的能力則是評(píng)估其產(chǎn)膠潛力的關(guān)鍵因子之一。

關(guān)于乳管分化的研究一直受到廣泛的關(guān)注。Wu等[4]、Hao等[5]、Ichihara等[6]、張世鑫等[7]、Tian等[8]、Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，割膠、機(jī)械傷害和茉莉酸類物質(zhì)都可以誘導(dǎo)橡膠樹的乳管分化，并建立了利用機(jī)械傷害誘導(dǎo)橡膠樹萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，發(fā)明了一種早期預(yù)測(cè)橡膠樹種質(zhì)乳管分化能力的方法[15]。為建立系統(tǒng)化的理論體系、進(jìn)一步完善利用乳管分化能力進(jìn)行早期評(píng)價(jià)產(chǎn)量的技術(shù)，本研究以不同樹齡和不同次生乳管分化能力的橡膠樹種質(zhì)為材料，采用實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)技術(shù)分析了機(jī)械傷害、割膠和茉莉酸類物質(zhì)處理對(duì)樹皮中次生乳管分化的影響，旨在進(jìn)一步優(yōu)化橡膠樹產(chǎn)膠潛力的早期選擇技術(shù)，并為產(chǎn)膠潛力相關(guān)分子標(biāo)記研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）的野生種質(zhì)和不同乳管分化能力種質(zhì)的雜交后代，其中，①一年生萌條種植于國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)-國(guó)家橡膠樹種質(zhì)資源子平臺(tái)的九隊(duì)基地的野生種質(zhì)，這些種質(zhì)引種于巴西的阿克里州（簡(jiǎn)稱AC州）、朗多尼亞州（簡(jiǎn)稱RO州）和馬托格羅索州（簡(jiǎn)稱MT州）3個(gè)州，每州各選10份種質(zhì)，分別進(jìn)行機(jī)械傷害和冠菌素（coronatine， COR）單次處理，每種處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；②二年生幼樹和與其對(duì)應(yīng)的八年生未開割樹種植于國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)-國(guó)家橡膠樹種質(zhì)資源子平臺(tái)的九隊(duì)和三隊(duì)基地，隨機(jī)挑選57份野生種質(zhì)和46份魏克漢種質(zhì)，每份種質(zhì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；③八年生不同乳管分化能力種質(zhì)的雜交組合后代種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所遺傳育種研究室九隊(duì)基地的七號(hào)地塊，隨機(jī)選取20份乳管分化能力強(qiáng)且產(chǎn)量高的種質(zhì)材料和50份乳管分化能力弱且產(chǎn)量低的種質(zhì)材料。

1.2 處理方法

1.2.1 機(jī)械傷害處理一年生橡膠樹野生種質(zhì)萌條 一年生野生種質(zhì)萌條的第一伸長(zhǎng)單位（EU1）[5]葉片處于穩(wěn)定期時(shí)，使用單面刀片在其第一伸長(zhǎng)單位最下面一片葉下方2 cm的綠色莖皮處（圖1-A），刮去1 cm×1 cm 面積的表皮和部分皮層，使傷口直接暴露在空氣中，另取其下方10 cm處未處理的莖皮作為空白對(duì)照（圖1-A）。處理10 d后，使用單面刀片削取莖皮，制備石蠟切片。

1.2.2 冠菌素（COR）刺激處理一年生橡膠樹野生種質(zhì)萌條 由于冠菌素的結(jié)構(gòu)與活性形式的茉莉酸非常相似，且比茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate， MeJA）更能有效地誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化[6]，因此，本研究使用COR代替MeJA進(jìn)行一年生野生種質(zhì)萌條誘導(dǎo)乳管分化實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)材料同第1.2.1節(jié)。當(dāng)萌條的第一伸長(zhǎng)單位（EU1）葉片處于穩(wěn)定期時(shí)，分別在其最下面一片葉下方2 cm處和10 cm處（圖1-B），使用刀片刮去1 cm×1 cm面積樹皮的表皮和部分皮層，使用滅菌脫脂棉貼附于刮傷部位，施加適量的10 μmol/L COR溶液，再用封口膜包裹處理部位，另外取遠(yuǎn)離處理位置未處理的樹皮作為空白對(duì)照（圖1-B）。分別處理5 d和10 d后，使用單面刀片削取處理部位的樹皮，制備石蠟切片。

1.2.3 割膠處理二年生及其對(duì)應(yīng)八年生橡膠樹野生種質(zhì)和魏克漢種質(zhì)橡膠樹 野生種質(zhì)和魏克漢種質(zhì)材料的二年生幼樹，在距離地面0.5 m處的樹干樹皮上使用芽接刀模擬正常割膠的方法進(jìn)行開割線和割去樹皮，每10 d割1刀，共割3刀；與其對(duì)應(yīng)的八年生成齡未開割樹在距離地面0.5 m處的樹干樹皮上正常割膠，每3 d割1刀，共割10刀。割膠處理完后30 d，在割線處用打孔器采集樹皮，制備石蠟切片。以相同種質(zhì)材料未割膠處理的樹皮為對(duì)照。

1.2.4 COR單次刺激處理八年生橡膠樹種質(zhì)的雜交后代 不同乳管分化能力種質(zhì)的雜交組合后代的八年生未開割樹，在橡膠樹樹干的1.5 m和2 m處，使用刀片刮去面積為3 cm×3 cm的樹皮周皮和部分皮層，使用滅菌脫脂棉貼附于表面，分別施加10 μmol/L和30 μmol/L COR溶液，使用方形塑料封口膜覆蓋，再使用黑色薄膜覆蓋并用凡士林封固四周（防水）。分別處理10 d和15 d后，使用打孔器取處理部位的樹皮，制備石蠟切片。以同一地塊內(nèi)未割膠處理的同雜交后代種質(zhì)材料的樹皮為對(duì)照。

1.2.5 茉莉酸類物質(zhì)多次刺激處理八年生橡膠樹種質(zhì)的雜交后代 實(shí)驗(yàn)材料同第1.2.4節(jié)，在橡膠樹樹干的1 m處圍繞樹干選取2處，使用刀片刮去面積為3 cm×3 cm的樹皮周皮和部分皮層，使用滅菌脫脂棉貼附于表面，分別施加0.14% MeJA和30 μmol/L COR的混合羊毛脂，并用塑料封口膜包裹，再使用黑色薄膜覆蓋并用凡士林封固四周（防水），處理10 d后；除去舊的羊毛脂，涂抹純羊毛脂處理2 d后，再次刮除純羊毛脂。再次涂抹含有MeJA和COR的混合羊毛脂，并重復(fù)上述步驟4次，共處理46 d。用打孔器采集處理部位樹皮，并在樹干同一高度的背面，取一塊不做任何處理的樹皮作為空白對(duì)照，制備石蠟切片。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石蠟切片的制備方法 石蠟切片制備方法參照Hao等[5]、史自強(qiáng)等[16]的方法并優(yōu)化。樹皮材料分割后，于80%乙醇中固定24 h以上，乙醇系列脫水，冰醋酸過(guò)渡，I-Br染液著色橡膠（60 ℃烘箱中36～48 h），冰醋酸洗滌，乙醇過(guò)渡，正丁醇透明，石蠟包埋。使用Leica切片機(jī)切片（厚度14 μm），二甲苯脫蠟，固綠染色，松節(jié)油透明，中性樹膠封片。

1.3.2 次生乳管數(shù)量和橡膠樹乳管分化等級(jí)的統(tǒng)計(jì)方法 次生乳管數(shù)量的統(tǒng)計(jì)參考文獻(xiàn)[5-9]的方法，并加以改進(jìn)。統(tǒng)計(jì)形成層附近的次生乳管列數(shù)，“0”代表沒有誘導(dǎo)出的次生乳管，“1”代表誘導(dǎo)出的次生乳管是完整的1列；出現(xiàn)不完整的1列時(shí)，用標(biāo)尺量取乳管列長(zhǎng)度，與視野總長(zhǎng)度的比值即為該視野下誘導(dǎo)出次生乳管的列數(shù)。

橡膠樹次生乳管分化等級(jí)的統(tǒng)計(jì)參考Chen等[17]的方法。形成層附近誘導(dǎo)產(chǎn)生0～1列次生乳管，基本沒有密集乳管出現(xiàn)評(píng)價(jià)為1級(jí)；形成層附近誘導(dǎo)出2～3列次生乳管，且在局部有密集乳管出現(xiàn)，評(píng)價(jià)為2級(jí)；形成層附近誘導(dǎo)出4～5列次生乳管，且乳管密集程度較高，評(píng)價(jià)為3級(jí)；形成層附近誘導(dǎo)出5列以上次生乳管，且乳管密集程度高，評(píng)價(jià)為4級(jí)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS 20.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，通過(guò)OriginLab 8.5軟件進(jìn)行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械傷害對(duì)一年生橡膠樹萌條次生乳管分化的影響

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察機(jī)械傷害處理的野生種

質(zhì)樹皮。結(jié)果顯示，在總共30份野生種質(zhì)萌條中，有28份種質(zhì)成功誘導(dǎo)出1列次生乳管（如圖2-A紅色箭頭所示），誘導(dǎo)成功率為93.3%。來(lái)自于巴西州3個(gè)州各10份種質(zhì)的30株野生種質(zhì)材料中，AC州的種質(zhì)中共有25株萌條誘導(dǎo)出次生乳管，誘導(dǎo)出次生乳管種質(zhì)數(shù)量的比例為83.33%，且誘

導(dǎo)出連續(xù)1列次生乳管的有15株，占50%（圖

2-B）；RO州共有16株萌條誘導(dǎo)出次生乳管，誘導(dǎo)出次生乳管種質(zhì)數(shù)量的比例為53.33%，且出現(xiàn)連續(xù)1列次生乳管的植株有10株，占33.33%（圖2-B）；MT州共有25株萌條誘導(dǎo)出次生乳管，誘導(dǎo)出次生乳管種質(zhì)數(shù)量的比例為83.33%，且出現(xiàn)連續(xù)1列次生乳管的植株15株，占50%（圖2-B）。由此可見，通過(guò)機(jī)械傷害誘導(dǎo)，AC州和MT州的野生種質(zhì)萌條次生乳管分化的誘導(dǎo)效率要明顯高于RO州，但AC州和MT州的數(shù)據(jù)間卻沒有差異。

2.2 COR單次刺激對(duì)一年生橡膠樹萌條次生乳管分化的影響

對(duì)同樣來(lái)自于巴西3個(gè)州的30份野生種質(zhì)進(jìn)行COR處理。結(jié)果表明，COR處理5 d能夠誘導(dǎo)出次生乳管的種質(zhì)數(shù)量少，只有5份，誘導(dǎo)成功率僅16.7%；10 d能夠誘導(dǎo)出次生乳管的種質(zhì)有25份，誘導(dǎo)成功率達(dá)到83.3%（圖3-A）。AC州和MT州在機(jī)械傷害處理和COR處理后誘導(dǎo)乳管分化效果較好，也略強(qiáng)于RO州（圖3-B）。COR處理5 d和10 d的誘導(dǎo)率呈極顯著差異（p<0.01），且COR處理5 d能夠誘導(dǎo)出次生乳管的5份種質(zhì)，在COR處理10 d的條件下也有分化出次生乳管。這可能是COR處理確實(shí)有誘導(dǎo)乳管分化的作用，只是處理5 d的時(shí)間較短，次生乳管中的橡膠成分積累量不夠，在石蠟切片中難以觀察到，而COR處理10 d的時(shí)間就能夠較容易檢測(cè)到。

2.3 割膠對(duì)二年生、八年生橡膠樹種質(zhì)次生乳管分化的影響

光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，二年生幼樹割膠處理后乳管分化能力差異顯著，能夠誘導(dǎo)出從0～1列到4～5列不等的次生乳管（如圖4所示）。二年生野生種質(zhì)材料在割膠后乳管分化能力強(qiáng)的種質(zhì)有6份，分別為XJ007163、XJ000954、XJ000881、XJ001678、XJ002960和XJ000198，能夠分化出3～4列次生乳管，它們對(duì)應(yīng)的乳管分化能力等級(jí)分別為4級(jí)、3級(jí)、3級(jí)、3級(jí)、3級(jí)和3級(jí)；乳管分化能力較差的種質(zhì)有XJ000138、XJ000126、XJ000454、XJ000125、XJ000405等27份，能夠分化出斷斷續(xù)續(xù)的1列次生乳管或者少數(shù)幾個(gè)次生乳管細(xì)胞，它們的乳管分化能力等級(jí)大多為1級(jí)。同樣，二年生魏克漢種質(zhì)材料在割膠后乳管分化能力強(qiáng)的種質(zhì)分別為熱研8-333、熱研7-33-97、RRIC100、保亭155、KRS21、海墾6和徐育3共7份種質(zhì)，能夠分化出4～5列次生乳管，它們的乳管分化能力等級(jí)分別為4級(jí)、4級(jí)、4級(jí)、3級(jí)、3級(jí)、3級(jí)和3級(jí)；乳管分化能力較差的種質(zhì)有云研277-5、色寶2、熱墾523、馬矮、熱研7-18-55、RRIC121、KRS156等19份種質(zhì)，能夠分化出斷斷續(xù)續(xù)的1列次生乳管或者少數(shù)幾個(gè)次生乳管細(xì)胞，它們的乳管分化能力等級(jí)均為1級(jí)。

對(duì)于與二年生種質(zhì)相對(duì)應(yīng)的八年生成齡未開割樹也進(jìn)行割膠處理。光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，八年生幼樹割膠處理后乳管分化能力差異顯著，能夠誘導(dǎo)出從0～1列到4～5列不等的次生乳管。八年生野生種質(zhì)材料在割膠后乳管分化能力強(qiáng)的種質(zhì)也為6份，與二年生的種質(zhì)是完全相同的，分別為XJ007163、XJ000954、XJ000881、XJ001678、XJ002960和XJ000198，能夠分化出多數(shù)達(dá)5～6列的次生乳管；乳管分化能力較差的有 XJ000131、XJ000375、XJ000138、XJ000126、XJ000454、XJ000125、XJ000405等26份，與二年生的種質(zhì)一致程度為81.48%，能夠分化出斷斷續(xù)續(xù)的1列次生乳管或者少數(shù)幾個(gè)次生乳管細(xì)胞，乳管分化能力等級(jí)大多為1級(jí)。同樣，八年生魏克漢種質(zhì)材料在割膠后乳管分化能力強(qiáng)的種質(zhì)也是7份，與二年生的種質(zhì)完全相同，為熱研8-333、熱研7-33-97、RRIC100、保亭155、KRS21、海墾6和徐育3，能夠分化出5～6列次生乳管，它們的乳管分化能力等級(jí)分別為4級(jí)、4級(jí)、4級(jí)、4級(jí)、4級(jí)、3級(jí)和3級(jí)；乳管分化能力較差的有RRIC130、南俸76-1、云研277-5、色寶2、熱墾523、馬矮、熱研7-18-55和RRIC121等21份種質(zhì)，與二年生的種質(zhì)一致程度為80%，能夠分化出斷斷續(xù)續(xù)的1列次生乳管或者少數(shù)幾個(gè)次生乳管細(xì)胞，乳管分化能力等級(jí)同樣均為1級(jí)。

通過(guò)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二年生幼樹與其對(duì)應(yīng)的八年生成齡未開割樹割膠后的乳管分化能力，在絕大多數(shù)的種質(zhì)中是一致的，總的種質(zhì)一致程度高達(dá)84%?？梢姼钅z處理二年生材料用于篩選乳管分化能力差異的種質(zhì)的結(jié)果準(zhǔn)確度很好。

2.4 COR單次刺激對(duì)八年生橡膠樹種質(zhì)雜交后代次生乳管分化的影響

以不同次生乳管分化能力的橡膠樹種質(zhì)雜交組合的后代，研究茉莉酸單次刺激對(duì)種質(zhì)的次生乳管分化是否會(huì)出現(xiàn)差異。光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在總共70株雜交后代種質(zhì)中，使用10 μmol/L COR處理10 d后，有11株雜交組合后代種質(zhì)能夠誘導(dǎo)出次生乳管，占總種質(zhì)數(shù)的15.7%；使用30 μmol/L COR處理10 d后，有33株雜交組合后代種質(zhì)能夠誘導(dǎo)出次生乳管，占總種質(zhì)數(shù)的47.1%；使用10 μmol/L COR處理15 d后，有25株雜交組合后代種質(zhì)能夠誘導(dǎo)出次生乳管，占總種質(zhì)數(shù)的35.7%；使用30 μmol/L COR處理15 d后，有46株雜交組合后代種質(zhì)能夠誘導(dǎo)出次生乳管（圖5-A），占總種質(zhì)數(shù)的65.7%。其中，乳管分化能力低（1～2級(jí)）的50株雜交組合后代種質(zhì)能夠中有32株材料誘導(dǎo)出1列次生乳管，占總種質(zhì)數(shù)的64%；乳管分化能力高（3～4級(jí)）的20株雜交組合后代種質(zhì)能夠中有15株材料誘導(dǎo)出1列次生乳管，占總種質(zhì)數(shù)的75%。

由于上述的COR單次刺激不同乳管分化能力的橡膠樹雜交組合后代種質(zhì)后，誘導(dǎo)次生乳管分化的數(shù)據(jù)差異不顯著，本研究分析了外施COR劑量和處理時(shí)間等因素對(duì)其可能造成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①外施茉莉酸類物質(zhì)的效果可能與劑量有一定關(guān)系，從圖5-B可以看出，30 μmol/L COR誘導(dǎo)乳管分化的種質(zhì)數(shù)量要遠(yuǎn)高于10 μmol/L COR。②外施COR的效果可能與處理時(shí)間有一定關(guān)系，從圖5-B可以看出，無(wú)論10 μmol/L還是30 μmol/L，COR處理15 d誘導(dǎo)乳管分化的種質(zhì)數(shù)量都要遠(yuǎn)高于處理10 d，且呈極顯著差異（p<0.01）。

2.5 茉莉酸類物質(zhì)多次刺激對(duì)八年生橡膠樹種質(zhì)雜交后代次生乳管分化的影響

MeJA和COR多次連續(xù)性刺激誘導(dǎo)橡膠樹八年生不同次生乳管分化能力的橡膠樹種質(zhì)雜交組合后代的樹皮切片結(jié)果表明，MeJA處理后，50株乳管分化能力低（1～2級(jí)）的雜交組合后代種質(zhì)誘導(dǎo)次生乳管在1列以下的（<1列）共36株，占比72%；1列及以上的（≥1列）共14株，占28%。而在20株乳管分化能力高（3～4級(jí)）種質(zhì)中，誘導(dǎo)出1列以下的（<1列）只有6株，占30%；1列及以上的（≥1列）共14株，占比70%，如圖6B-a所示。

同樣，使用COR處理后，50株乳管分化能力低（1～2級(jí)）的雜交組合后代種質(zhì)誘導(dǎo)次生乳管1列以下的（<1列）共44株，占比88%；1列及以上的（≥1列）共6株，占12%。而在20株乳管分化能力高（3～4級(jí)）種質(zhì)中，誘導(dǎo)1列以下的（<1列）有8株，占40%；1列次生乳管的共3株，占15%；1列以上的（≥1列）共12株，占比60%，如圖6B-b所示。由此可見，MeJA和COR的多次刺激比單次刺激效果更好，且更容易區(qū)分不同次生乳管分化能力的橡膠樹種質(zhì)雜交組合后代的次生乳管分化能力。

3 討論

3.1 橡膠樹種質(zhì)的次生乳管分化能力早期預(yù)測(cè)有望縮短橡膠樹產(chǎn)量育種周期

與普通作物一次性收獲計(jì)產(chǎn)不同，巴西橡膠樹產(chǎn)量測(cè)定具有連續(xù)收獲和累進(jìn)計(jì)產(chǎn)的特點(diǎn)，這也是其產(chǎn)量構(gòu)成性狀難于剖析的原因。目前主要依賴割膠測(cè)產(chǎn)的方法進(jìn)行隨機(jī)的表型選擇[17]，育種周期長(zhǎng)達(dá)30～40年，且效率低下[18-20]。根據(jù)橡膠樹產(chǎn)量形成的特點(diǎn)，目前，將決定橡膠樹天然橡膠產(chǎn)量的關(guān)鍵因素分解為3個(gè)，即樹干樹皮中的次生乳管數(shù)量、兩次割膠間的膠乳再生（主要是橡膠生物合成）和排膠持續(xù)時(shí)間[21]。其中，樹干樹皮中的乳管數(shù)量是決定天然橡膠產(chǎn)量的最重要的結(jié)構(gòu)因子[22]，且樹干樹皮中的次生乳管數(shù)量與天然橡膠產(chǎn)量高度正相關(guān)[23]。樹皮功能韌皮部的次生乳管是由維管形成層細(xì)胞分化而來(lái)，因此，維管形成層分化次生乳管的能力強(qiáng)弱決定次生乳管數(shù)量的多少。前期研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械傷害、割膠和茉莉酸能誘導(dǎo)橡膠樹分化出次生乳管[4-9， 17]，并且這些因素誘導(dǎo)的橡膠樹種質(zhì)間乳管分化差異，主要是由種質(zhì)的遺傳因素決定的，所以，乳管分化能力強(qiáng)的種質(zhì)其后代也能夠保留較強(qiáng)的乳管分化能力[23-26]。因此，通過(guò)對(duì)橡膠樹幼樹次生乳管分化能力的進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，對(duì)于縮短橡膠樹產(chǎn)量育種周期具有重要意義。

3.2 橡膠樹種質(zhì)對(duì)間斷性刺激所表現(xiàn)出的次生乳管分化能力存在明顯差異

不同的橡膠樹種質(zhì)在機(jī)械傷害、割膠和茉莉酸刺激后，所表現(xiàn)出次生乳管分化的能力存在一定的差異[15， 22]，為了更準(zhǔn)確地反應(yīng)出不同橡膠樹種質(zhì)受外界刺激處理后所表現(xiàn)出的次生乳管分化能力，本文系統(tǒng)分析了不同的刺激方式處理不同橡膠樹種質(zhì)，誘導(dǎo)次生乳管的效果。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械傷害和一次性COR刺激后10 d，不同的橡膠樹種質(zhì)間的次生乳管分化差異并不顯著，大多數(shù)種質(zhì)均能分化出1列次生乳管，而COR多次刺激和割膠處理后，不同種質(zhì)間的次生乳管分化差異明顯——割膠條件下乳管分化能力強(qiáng)的種質(zhì)誘導(dǎo)效果明顯強(qiáng)于乳管分化能力弱的種質(zhì)，究其原因，是橡膠樹種質(zhì)對(duì)于多次間斷性刺激后，形成層細(xì)胞分化次生乳管的能力存在明顯的差異。因此，通過(guò)間斷性多次刺激的方法來(lái)對(duì)不同橡膠樹種質(zhì)乳管分化能力進(jìn)行等級(jí)鑒定與評(píng)價(jià)，是可以輔助橡膠樹產(chǎn)量育種和縮短育種周期的。另外，根據(jù)橡膠樹對(duì)一次性刺激和多次間斷性刺激后，形成層細(xì)胞分化次生乳管情況不同，可以利用一次性和多次間斷性刺激這兩種實(shí)驗(yàn)方法處理橡膠樹，從而篩選出乳管分化相關(guān)的差異基因，為開發(fā)橡膠樹產(chǎn)膠潛力相關(guān)的分子標(biāo)記打下理論基礎(chǔ)。

3.3 二年生橡膠樹幼樹進(jìn)行割膠的方法可以鑒定不同橡膠樹種質(zhì)的次生乳管分化能力

為了盡可能“早”地評(píng)價(jià)橡膠樹的次生乳管分化能力，本研究從一年生橡膠樹萌條開始，發(fā)現(xiàn)機(jī)械傷害處理和茉莉酸類物質(zhì)刺激后，不同橡膠樹種質(zhì)一年生萌條的次生乳管分化能力差異不明顯，主要原因是一年生萌條的樹皮較薄，機(jī)械傷害處理后造成的植物組織失水響應(yīng)差別不大，引起的內(nèi)源過(guò)氧化氫爆發(fā)及內(nèi)源茉莉酸增加的效應(yīng)均很明顯，所以不同的橡膠樹種質(zhì)都很容易誘導(dǎo)次生乳管分化[6]。因此，本研究選擇對(duì)樹皮較厚的二年生橡膠樹幼樹進(jìn)行割膠處理，發(fā)現(xiàn)在割膠處理的二年生的魏克漢種質(zhì)或野生種質(zhì)，不同種質(zhì)間的次生乳管分化能力均有較大差異。為了驗(yàn)證二年生橡膠樹種質(zhì)對(duì)割膠處理鑒定評(píng)價(jià)乳管分化能力的準(zhǔn)確性，本研究又對(duì)二年生橡膠樹對(duì)應(yīng)的八年生種質(zhì)也進(jìn)行了割膠處理，發(fā)現(xiàn)這些二年生和八年生種質(zhì)在割膠后的次生乳管分化能力一致性很高。因此，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)二年生橡膠樹進(jìn)行割膠處理的方法，是可以實(shí)現(xiàn)“早”預(yù)測(cè)和“準(zhǔn)確”預(yù)測(cè)橡膠樹種質(zhì)乳管分化能力的。

總而言之，對(duì)二年生的橡膠樹幼樹進(jìn)行割膠來(lái)鑒定不同種質(zhì)的乳管分化能力的方法，可以開發(fā)成一種有效的次生乳管分化能力早期評(píng)價(jià)方法。

致謝 本研究中的橡膠樹各種質(zhì)材料的選取和鑒別得到了中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所胡彥師副研究員和黃肖農(nóng)藝師的大力幫助，在此表示誠(chéng)摯謝意。

參考文獻(xiàn)

[1] Engledow F L， Wadham S M. Investigation on yield in the cereals. I [J]. The Journal of Agricultural Science， 1923， 13（4）： 390-439.

[2] 林位夫.橡膠樹農(nóng)學(xué)辭典[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2014.

[3] 羅明武，鄧柳紅.巴西橡膠樹產(chǎn)膠與排膠機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科學(xué)，2006，42（9）：127-129.

[4] Wu J L， Hao B Z， Tan H Y. Wound-induced differentiation in Hevea brasiliensis shoots mediated by jasmonic acid[J]. Journal of Rubber Research， 2002， 5： 53-63.

[5] Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenicacid[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 37-43.

[6] Ichihara A， Shiraishi K， Sato H， et al. The structure of coronatine[J]. Journal of the American Chemical Society， 1977， 99 （2）： 636-637.

[7] 張世鑫， 劉世彪， 田維敏. 形成層活動(dòng)對(duì)機(jī)械傷害誘導(dǎo)巴西橡膠樹次生乳管分化的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2011， 32（6）： 1037-1041.

[8] Tian W M， Yang S G， Shi M J， et al. Mechanical wounding-induced laticifer differentiation in rubber tree： An indicative role of dehydration， hydrogen peroxide， and jasmonates[J]. Journal of Plant Physiology， 2015， 182： 95-103.

[9] Zhang S X， Wu S H， Tian W M. The secondary laticifer differentiation in rubber tree is induced by trichostatin A， an inhibitor of histone acetylation[J]. Frontiers Agricultural Science and Engineering， 2016， 3（4）： 357-362.

[10] Zhang S X， Tian W M. Cross talk between cytokinin and jasmonates in regulating the secondary laticifer differentiation in rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Journal of Rubber Research， 2015， 18（1）： 38-48.

[11] Chao J Q， Yang S G， Chen Y Y， et al. Transcript profiling of Hevea brasiliensis during latex flow[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 1 904.

[12] 王立豐，安 鋒，王紀(jì)坤，等.不同旱害級(jí)別對(duì)開割和未開割橡膠樹形態(tài)和生理特性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2017，38（10）：1 777-1 783.

[13] 仇 鍵，楊文鳳，吳 明，等.橡膠樹PR107不同乙烯濃度氣刺微割的產(chǎn)量和生理效應(yīng)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 41（8）： 74-77.

[14] Wu S H， Zhang S X， Chao J Q， et al. Transcriptome analysis of the signalling networks in coronatine-induced secondary laticifer differentiation from vascular cambia in rubber trees[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 36384.

[15] 田維敏，黃華孫，史敏晶，等.一種苗期預(yù)測(cè)橡膠樹次生乳管分化能力的方法： CN200810003352.7[P]. 2008-07-23.

[16] 史自強(qiáng)，胡正海.植物含膠組織的制片方法[J]. 植物學(xué)報(bào)，1965，13（2）：179-185.

[17] Chen Y Y， Gao X S， Zhang X F， et al. Relationship between the number of tapping-induced secondary laticifer lines and rubber yield among Hevea germplasm[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering， 2016， 3（4）： 363-367.

[18] 何 康，黃宗道.熱帶北緣橡膠樹栽培[M]. 廣州：廣東科技出版社，1987： 341-369.

[19] Gnagne M， 周建南.橡膠苗圃實(shí)生苗篩選效率的臨界范圍[J]. 熱帶作物譯叢，1991，4：3-9.

[20] 周鐘毓.國(guó)外巴西橡膠樹產(chǎn)量早期選擇預(yù)測(cè)方法研究概況[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993（2）：77-83.

[21] Mantello C C， Suzuki F I， Souza L M， et al. Microsatellite marker development for the rubber tree （Hevea brasiliensis）： characterization and cross-amplification in wild Hevea species[J]. BMC Research Notes， 2012， 5： 329.

[22] Silva C C， Mantello C C， Campos T. Leaf-， panel- and latex-expressed sequenced tags from the rubber tree （Hevea brasiliensis） under cold-stressed and suboptimal growing conditions： the development of gene-targeted functional markers for stress response.[J]. Molecular Breeding， 2014， 34（3）： 1035-1053.

[23] 田維敏，史敏晶，譚海燕，等.橡膠樹樹皮結(jié)構(gòu)與發(fā)育[M]. 北京：科學(xué)出版社，2015.

[24] 郝秉中，吳繼林.巴西橡膠樹乳管生物學(xué)與膠乳生產(chǎn)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2004，25（4）：1-7.

[25] 周鐘毓，郭祁源，詹賽榮.不同預(yù)測(cè)產(chǎn)量類型的巴西橡膠樹無(wú)性系乳管狀況的比較（1981-1992）[J]. 熱帶作物研究，1994（4）：1-6.

[26] 趙中奇.橡膠樹乳管發(fā)育與產(chǎn)膠量關(guān)系研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，13（4）：397-401.