紅花刺槐花粉生活力測(cè)定及保存方法

李 娟，姚硯武

(1.河北省滄州市鹽山縣農(nóng)林局，河北滄州 061300；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京 100093)

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紅花刺槐花粉生活力測(cè)定及保存方法

李 娟1，姚硯武2*

(1.河北省滄州市鹽山縣農(nóng)林局，河北滄州 061300；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京 100093)

[目的]研究紅花刺槐花粉活力的測(cè)定及保存方法，為紅花刺槐的人工雜交授粉提供參考依據(jù)。[方法]利用離體培養(yǎng)法、TTC法、I2-KI法測(cè)定花粉生活力，同時(shí)研究不同保存方法對(duì)紅花刺槐花粉萌發(fā)的影響。[結(jié)果]紅花刺槐花粉在蔗糖20.0 mg/L+硼酸2.0 mg/L的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高(29.56%)；I2-KI法不適用于紅花刺槐花粉活力的測(cè)定，TTC法的測(cè)定效果仍有待進(jìn)一步檢驗(yàn)；低溫比常溫更適于紅花刺槐花粉的保存，花粉在0 ℃保存15 d后，萌發(fā)率仍達(dá)17.67%。[結(jié)論]蔗糖20.0 mg/L+硼酸2.0 mg/L為紅花刺槐最適培養(yǎng)基組合，低溫更適合紅花刺槐花粉的保存。

紅花刺槐；花粉活力；保存條件

紅花刺槐(Robiniahisqida)為種間雜種(R.viscose×R.pseudoacacia)，商業(yè)上常被稱為無(wú)刺槐，刺比普通刺槐稍小，屬蝶形花科刺槐屬落葉喬木[1]。紅花刺槐因其花色鮮艷常作為一般觀賞型植物引種[2]，同時(shí)紅花刺槐還是優(yōu)良的蜜源樹種[3]，穗狀花序，花有香味，可食用。劉德光等[2]人對(duì)刺槐進(jìn)行研究認(rèn)為其結(jié)實(shí)率低，授粉受精是雜交工作的基礎(chǔ)，花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)是授粉受精的關(guān)鍵問(wèn)題。不同單株、無(wú)性系，不同種的紅花刺槐，常?；ㄆ诓挥?，有的還表現(xiàn)花粉活力低、不萌發(fā)、生長(zhǎng)差、難以實(shí)現(xiàn)授粉受精，從而導(dǎo)致雜交失敗[4]。研究紅花刺槐花粉的貯藏方法與生活力對(duì)其雜交育種和品種改良都具有重要意義，該研究旨在找出快速準(zhǔn)確測(cè)定刺槐花粉活力的方法，為紅花刺槐的后續(xù)雜交育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料材料為北京市延慶縣石佛寺野生紅花刺槐，生長(zhǎng)地地理坐標(biāo)為115°50′E、40°23′N，海拔約為500 m；年平均氣溫8 ℃，1月最冷，平均氣溫-8.8 ℃，7月最熱，平均氣溫為23.2 ℃；日照充足，年平均日照時(shí)數(shù)2 826.3 h，年平均降雨量493 mm。紅花刺槐始花期一般為5月中旬，持續(xù)到6月初，約15 d。試驗(yàn)所需蔗糖、硼酸、瓊脂、亞甲基藍(lán)等藥品均由北京化工廠提供；光學(xué)顯微鏡為德國(guó)麥克奧迪的Motic B series；培養(yǎng)箱為PYX-250G-A光照培養(yǎng)箱。

1.2方法2016年6月于北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所進(jìn)行試驗(yàn)。采集即將開放的紅花刺槐花蕾，預(yù)處理后帶回實(shí)驗(yàn)室剝?nèi)』ㄋ帲庞诎准埳献匀魂幐?4 h，碾壓花藥使其破裂散粉，過(guò)篩后將花粉放入密封小玻璃瓶中，保存待用。1.2.1培養(yǎng)基法測(cè)定萌發(fā)率。利用蔗糖硼酸培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉[5]，設(shè)置蔗糖濃度為0(清水對(duì)照)、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/L共6個(gè)處理，硼酸濃度為0(清水對(duì)照)、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/L共5個(gè)處理，共設(shè)置30組試驗(yàn)。待培養(yǎng)基冷卻后用毛筆將花粉點(diǎn)涂在培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)24 h，在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)萌發(fā)情況，以花粉管萌發(fā)的長(zhǎng)度超過(guò)2倍的花粉直徑為萌發(fā)花粉。每載玻片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)100 粒，然后計(jì)算花粉萌發(fā)率，重復(fù)3 次[6]。

1.2.2染色法測(cè)定生活力。

1.2.2.1TTC法。取少量花粉置于凹載玻片上，滴2滴0.4 g/L TTC 溶液，置于35 ℃恒溫箱中15 min，于顯微鏡下觀察，有活力的花粉被染成紅色[5]。每載玻片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)100粒，然后統(tǒng)計(jì)花粉生活力，重復(fù)3次。

1.2.2.2 I2-KI染色法。取少量花粉置于凹載玻片上，滴2滴I2-KI溶液，置于30 ℃恒溫箱中20～30 min，在顯微鏡下觀察，有生活力的花粉被染成藍(lán)色，生活力衰弱或內(nèi)含物少的花粉被染成黃褐色[7]。每載玻片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)100粒，然后統(tǒng)計(jì)花粉生活力，重復(fù)3 次。

1.2.3不同貯藏時(shí)間對(duì)花粉生活力的影響。試驗(yàn)分為常溫保存(25 ℃)和低溫保存(0 ℃)，利用優(yōu)選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別設(shè)置4個(gè)保存天數(shù)，從花粉采收后第1天算起，每5 d觀察1次，每次觀察2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)觀察5個(gè)視野。根據(jù)所拍照片，以花粉粒直徑為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算花粉管長(zhǎng)度為花粉粒直徑的倍數(shù)(a)，當(dāng)a>1時(shí)，即可進(jìn)行花粉萌發(fā)計(jì)算，花粉萌發(fā)率=觀察視野內(nèi)萌發(fā)總數(shù)/觀察視野內(nèi)花粉?？倲?shù)×100%。根據(jù)花粉管的伸長(zhǎng)情況可判斷花粉的萌發(fā)活力，花粉管伸長(zhǎng)越快、越長(zhǎng)，證明花粉活力越大?；ǚ郾４娣椒ǖ谋容^：根據(jù)2組不同貯藏條件與保存時(shí)間對(duì)照，分析花粉管的萌發(fā)長(zhǎng)度、時(shí)間以及花粉活力，以確定花粉的最佳保存方法與時(shí)間。

2　結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基濃度對(duì)紅花刺槐花粉萌發(fā)率的影響由表1可知，蔗糖和硼酸濃度為0時(shí)，抑制紅花刺槐花粉的萌發(fā)，在恒溫箱中培養(yǎng)24 h的花粉萌發(fā)率僅有0.32%。當(dāng)培養(yǎng)基中加入蔗糖和硼酸后，花粉的萌發(fā)率明顯增高，隨著蔗糖和硼酸濃度的增高，花粉的萌發(fā)率呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)。蔗糖濃度達(dá)25.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基中的平均花粉萌發(fā)率最高，約為21.15%，而蔗糖濃度為30.0 mg/L時(shí)，花粉萌發(fā)率明顯下降。硼酸濃度為1.5 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基中的平均萌發(fā)率為16.51%，硼酸濃度為2.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基中的平均萌發(fā)率為22.98%。所有培養(yǎng)基中，當(dāng)蔗糖濃度為20.0 mg/L、硼酸濃度為2.0 mg/L時(shí)，紅花刺槐花粉的萌發(fā)率最高，達(dá)29.56%，說(shuō)明只有在適量的蔗糖與硼酸組合中，才能達(dá)到相對(duì)較高的花粉萌發(fā)率。

表1　不同培養(yǎng)基濃度對(duì)紅花刺槐花粉萌發(fā)率的影響

2.2不同染色法對(duì)紅花刺槐花粉生活力測(cè)定的效果由表2及圖1可知，紅花刺槐的花粉經(jīng)I2-KI染色后，呈現(xiàn)紅褐色和黃褐色，與花粉遇I2-KI變藍(lán)色的理論不符，且所有的花粉均有染色，并不能以此說(shuō)明所有花粉都具有生活力，可見(jiàn)I2-KI染色法不適合紅花刺槐花粉生活力的測(cè)定。

經(jīng)0.4 g/L的TTC溶液染色后，84.54%的紅花刺槐花粉被染成深紅色，10.00%左右的花粉被染成淺紅色，未被染色的僅有5.48%，而TTC染色效果與培養(yǎng)基的萌發(fā)效果差別較大，TTC染色法是否可以檢驗(yàn)花粉生活力有待討論。

表2　不同染色法對(duì)紅花刺槐花粉生活力測(cè)定的結(jié)果

圖1　I2-KI及TTC染色結(jié)果Fig.1　I2-KI and TTC staining results

2.3不同貯藏時(shí)間對(duì)花粉生活力的影響利用培養(yǎng)基試驗(yàn)中最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行不同保存時(shí)間紅花刺槐的花粉萌發(fā)率測(cè)試，發(fā)現(xiàn)常溫保存的花粉萌發(fā)更早，花粉管先開始伸長(zhǎng)，而低溫保存的花粉總體萌發(fā)率要高于常溫保存的，但花粉管的伸長(zhǎng)差距并不明顯，花粉管長(zhǎng)度基本為花粉粒直徑的8～10倍。在常溫和低溫下保存5 d時(shí)，具有最佳萌發(fā)率，常溫保存萌發(fā)率為24.91%，低溫保存萌發(fā)率為31.82%。由圖2和表3可知，低溫保存的紅花刺槐花粉的萌發(fā)率要高于常溫保存的花粉，最大差距是在保存10 d時(shí)，低溫保存的花粉萌發(fā)率(20.23%)要明顯高于常溫保存的萌發(fā)率(10.58%)。在保存過(guò)程中，由于重疊等原因，一直存在不能吸收培養(yǎng)液的干燥花粉粒，或者吸收了培養(yǎng)液而最終并沒(méi)有萌發(fā)。

圖2　紅花刺槐在常溫與低溫條件下保存5 d時(shí)的萌發(fā)效果Fig.2　The germination effect of Robinia pseudoacacia stored in normal temperature and low temperature for 5 days

處理Treatment保存時(shí)間Storagetime∥d萌發(fā)粒數(shù)Germinationgrainnumber∥粒花粉總數(shù)Totalnumberofpollen∥?；ǚ勖劝l(fā)率Pollengerminationrate∥%平均花粉萌發(fā)長(zhǎng)度Averagepollengerminationlength常溫保存1113102511.029Storedinnormal5278111624.9110temperature(25℃)10137129510.5810158713396.656低溫保存1125113611.009Storedinlow5392123231.8211temperature(0℃)10224110720.231015258146017.678

注：花粉萌發(fā)長(zhǎng)度為花粉粒直徑的倍數(shù)。

Note：The length of pollen germination is multiple of the diameter of pollen grain.

3　結(jié)論與討論

目前，檢驗(yàn)花粉生活力的主要方法有染色法、離體萌發(fā)法及授粉法等[8-9]，人工授粉法是鑒定花粉保存效果比較可靠和精確的方法?；ǚ刍盍Σ粌H受遺傳因素決定，也受環(huán)境因素的影響。賈文慶[10]研究認(rèn)為，蔗糖不僅可調(diào)節(jié)花粉的滲透勢(shì)，還可以作為合成淀粉的原料，促進(jìn)花粉管的伸長(zhǎng)。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著蔗糖濃度的增加，紅花刺槐花粉萌發(fā)率也逐步增大，蔗糖濃度超過(guò)25.0 mg/L時(shí)，紅花刺槐花粉的萌發(fā)率降低，與金愛(ài)紅等[11]發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度過(guò)高會(huì)造成花粉的質(zhì)壁分離，從而抑制花粉萌發(fā)的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)表明花粉萌發(fā)同時(shí)受硼酸濃度的調(diào)控，只有在適量的蔗糖與硼酸組合中，才能得到相對(duì)較高的花粉萌發(fā)率，適合刺槐花粉萌發(fā)的蔗糖與硼酸組合為蔗糖20.0 mg/L+硼酸2.0 mg/L。

I2-KI染色法是檢測(cè)花粉生活力的常用方法，花粉粒中含有淀粉，遇I2變藍(lán)，而該試驗(yàn)中花粉染色后呈現(xiàn)紅褐色和黃褐色，與所查資料不符，因此判定I2-KI染色法不適用于紅花刺槐花粉活力的測(cè)定。TTC染色法適用于大多數(shù)植物花粉生活力測(cè)定，在芍藥、油茶等花粉生活力測(cè)定中效果明顯[12-13]。花粉的著色情況可能受其自身特性影響[14]，一般花粉活性越高，其著色程度越深，該試驗(yàn)用0.4 g/L TTC溶液對(duì)紅花刺槐花粉進(jìn)行染色后，呈現(xiàn)深紅色、淺紅色、無(wú)色3種情況，染成深紅色的花粉粒達(dá)總數(shù)的85%左右，而培養(yǎng)基的最高萌發(fā)率僅有29.56%，可能是由于培養(yǎng)基中存在不能吸收培養(yǎng)液的干燥花粉粒，或者吸收了培養(yǎng)液而最終并沒(méi)有萌發(fā)，染色法測(cè)定的是花粉仍具有活力，而活性稍弱的花粉在培養(yǎng)基中可能不能萌發(fā)。檢測(cè)花粉生活力的染色方法還有CAB法、Kew法[15]等，何種染色法適合紅花刺槐花粉生活力測(cè)定有待進(jìn)一步研究。

在花粉的超低溫保存中，超低溫對(duì)花粉細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)是否造成影響也是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。研究表明，在牡丹花粉超低溫保存前后，可溶性蛋白、脯氨酸、MDA、SOD、CAT、POD及可溶性糖含量均有一定程度的變化[16]。該試驗(yàn)選擇常溫保存和低溫保存2種方法進(jìn)行比較，紅花刺槐花粉開放當(dāng)天采收，在常溫和低溫下保存5 d時(shí)，具有最佳萌發(fā)率，常溫保存萌發(fā)率為24.91%，低溫保存萌發(fā)率為31.82%，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉的萌發(fā)率逐步降低，常溫保存的萌發(fā)率較低溫保存下降更快，常溫條件下花粉會(huì)更快地失去活

力，不能萌發(fā)或不能充分伸長(zhǎng)，因此低溫更適合紅花刺槐花粉的保存。有研究表明國(guó)槐花粉在低溫下保存的最長(zhǎng)時(shí)間為39 d[17]，而紅花刺槐花粉在低溫條件下保存的最長(zhǎng)時(shí)間仍有待研究。

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Viability Determination and Storage Property ofRobiniahisqidaPollen

LI Juan1, YAO Yan-wu2*

(1. Yanshan Bureau of Agriculture and Forestry of Cangzhou in Hebei Province, Cangzhou, Hebei 061300; 2. Forestry and Pomology Institute, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100093)

[Objective] The assay method of pollen viability and its storage characteristics were explored to provide

for the production and breeding ofRobiniahisqida. [Method] The pollen viability ofRobiniahisqidawas detected by medium germination, I2-KI staining and TTC staining test. Meanwhile the effects of different storage conditions and time on theRobiniahisqidapollen germination were studied. [Result] The germination rate ofRobiniahisqidapollen was 29.56% under 20.0 mg/L sucrose + 2.0 mg/L boric acid. The temperature of 0 ℃ was more suitable and storable than normal temperature, the method of I2-KI did not apply to the determination ofRobiniahisqidapollen vitality test, determination of the TTC method effect remained to be further tested. At 0 ℃, the germination rate of pollen was 17.67% when it was preserved for 15 days. [Conclusion] The most suitable medium of theRobiniahisqidapollen germination was 20.0 mg/L sucrose +2.0 mg/L boric acid. AndRobiniahisqidapollen stored in the low temperature conditions remained longer vigor.

Robiniahisqida; Pollen viability; Storage conditions

北京市農(nóng)林科學(xué)院基金項(xiàng)目(KJCX20150205)。

李娟(1985-)，女，河北滄州人，助理工程師，從事林果技術(shù)工作。*通訊作者，副研究員，從事林木育種研究。

2016-07-13

S 792.27

A

0517-6611(2016)23-141-03