以PMI為選擇標(biāo)記基因的雪柑遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

王會(huì)全 吳少華 余志雄

摘要 ?{目的]以PMI為選擇標(biāo)記基因?qū)ρ└痰倪z傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。{方法]對(duì)農(nóng)桿菌的菌液濃度、實(shí)生苗培養(yǎng)條件、甘露糖篩選壓、2，4-D濃度、2，4-D預(yù)處理時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行梯度試驗(yàn)來(lái)研究轉(zhuǎn)化后的再生率，并對(duì)篩選培養(yǎng)基中6-BA和NAA不同濃度組合進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)研究抗性大苗的篩選。{結(jié)果]經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)20d光培養(yǎng)10d條件的實(shí)生苗外植體在農(nóng)桿菌菌液OD600為0.6，1.0mg/L2，4-D預(yù)處理3h，農(nóng)桿菌侵染30min，共培養(yǎng)時(shí)間4d，篩選壓為甘露糖20g/L的情況下轉(zhuǎn)化后的再生率大大提高，而在篩選培養(yǎng)基中加入2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA有助于抗性大苗的篩選。{結(jié)論]通過(guò)對(duì)影響轉(zhuǎn)化的各種因素的優(yōu)化試驗(yàn)建立了雪柑以PMI基因/甘露糖選擇標(biāo)記系統(tǒng)的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。

關(guān)鍵詞 ??柑橘;6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)S??188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）36-0083-07

柑橘（CitrusL.）是當(dāng)今世界種植面積最大的果樹(shù)，也是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)。但柑橘作為多年生木本果樹(shù)，由于童期長(zhǎng)、遺傳高度雜合性和多胚現(xiàn)象，柑橘育種工作困難重重。不同品種間會(huì)有6～20年的漫長(zhǎng)童期{1]，這使得常規(guī)育種周期變得很長(zhǎng)。柑橘轉(zhuǎn)基因技術(shù)在過(guò)去的十多年中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，為柑橘育種開(kāi)辟了一條新途徑。在柑橘基因轉(zhuǎn)化研究中，大多采用上胚軸、子葉、試管苗葉片、莖段等未度過(guò)童期的組織作為基因轉(zhuǎn)化受體，由此得到的轉(zhuǎn)基因植株同樣具有童期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，且轉(zhuǎn)基因植株的園藝與商品性狀評(píng)價(jià)往往需要很長(zhǎng)時(shí)間。因此，縮短童期是育種工作者的重要目標(biāo)之一。

目前，轉(zhuǎn)基因作物的安全性問(wèn)題受到極大關(guān)注。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良柑橘品種首先要考慮生物安全性問(wèn)題，其中主要是選擇標(biāo)記基因的使用。使用安全的選擇標(biāo)記基因也是最有效的方法，這些標(biāo)記基因與常規(guī)標(biāo)記基因不同，沒(méi)有抗生素或除草劑抗性，相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)生物和環(huán)境是安全的。因此，安全的選擇標(biāo)記基因在今后的轉(zhuǎn)基因研究中將具有重要的戰(zhàn)略意義。筆者以福建傳統(tǒng)優(yōu)良甜橙品種雪柑（C.sinensisL.Osb.）為材料，在初步建立以PMI（Phosphomannoseisomerase，磷酸甘露糖異構(gòu)酶）基因?yàn)檫x擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因體系的基礎(chǔ)上{2]，進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，建立雪柑轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)，為雪柑的遺傳改良、基因功能研究等奠定基礎(chǔ)，并為其他柑橘種類轉(zhuǎn)基因研究中利用這一安全的選擇標(biāo)記系統(tǒng)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。從新鮮成熟雪柑果實(shí)中取出種子，選取粒大飽滿的完好種子，在無(wú)菌條件下于70%乙醇中浸泡30s，再用0.1%升汞消毒8min，用無(wú)菌水清洗5～6次，剝?nèi)ネ夥N皮，劃破內(nèi)種皮，接種于實(shí)生苗培養(yǎng)基上，在16h/d（光/暗）周期下，光照度為1500lx，（25±2）℃培養(yǎng)。取暗培養(yǎng)10d、光照20d左右的上胚軸為材料，縱切法切取1cm左右上胚軸為轉(zhuǎn)化材料，每次轉(zhuǎn)化所用的雪柑上胚軸約90個(gè)。

1.1.2菌株及質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌EHA105、雙元載體質(zhì)粒pC1301-PMI-LFY均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供，載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件?；九囵B(yǎng)基：MS;實(shí)生苗培養(yǎng)基：1/2MS+蔗糖15g/L;共培養(yǎng)培養(yǎng)基CM：MS+蔗糖30g/L;篩選培養(yǎng)基SMS：MS+BA2mg/L+20g/L甘露糖+Carb250mg/L。

所用培養(yǎng)基均添加7g/L瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂粉。用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃滅菌20min。光照培養(yǎng)的光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為1500lx，溫度（25±2）℃。

1.2方法

1.2.1E/pC1301-PMI-LFY農(nóng)桿菌侵染液的準(zhǔn)備。將超低溫保存的工程菌液接種在加有100mg/LKan和100mg/LStr的YEB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28℃活化36h左右，挑單菌落于YEB液體培養(yǎng)基（Kan、Str100mg/L）中220r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，OD600為0.6左右。取菌液分裝于已滅菌的50mLEppendorf管中，5000r/min離心20min，去上清液，用等體積MS液體培養(yǎng)基重懸，220r/min搖床適應(yīng)性培養(yǎng)2h后，再離心、等體積MS重懸，稀釋測(cè)其OD600。

1.2.2轉(zhuǎn)化的基本程序。

①取暗培養(yǎng)10d光照培養(yǎng)20d左右無(wú)菌雪柑實(shí)生苗的上胚軸為外植體。

②將上胚軸橫切成1cm左右小段，再用手術(shù)刀縱切一分為二，置于盛有2，4-D0.5mg/L的無(wú)菌三角瓶中，浸泡2h。

③預(yù)處理后，將制備好的農(nóng)桿菌侵染液（OD600為0.4左右）倒入無(wú)菌三角瓶中，搖動(dòng)三角瓶使菌液與外植體充分接觸，侵染20min，期間輕微振蕩。

④用濾紙吸干上胚軸上的菌液，縱切切口水平朝上放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基CM：MS+蔗糖30g/L+2，4-D0.5mg/L中，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)3d。

⑤將共培養(yǎng)后的上胚軸用含250mg/L羧芐青霉素的無(wú)菌水洗5～6次，放置在無(wú)菌濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)入附加250mg/L羧芐青霉素的誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基SMS：MS+BA2mg/L+20g/L甘露糖+Carb250mg/L中，光下培養(yǎng)。

1.3遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

對(duì)影響轉(zhuǎn)化率的各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，在單個(gè)參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)中，如無(wú)特殊說(shuō)明，按照以上轉(zhuǎn)化基本程序進(jìn)行，光下培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)分化率和大苗分化率，篩選單因素的最優(yōu)梯度。

1.3.1農(nóng)桿菌菌液不同OD600值對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。農(nóng)桿菌侵染液OD600梯度值分別為0.1、0.4、0.6，農(nóng)桿菌侵染后接種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，光下培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3.2不同甘露糖篩選壓對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。在篩選培養(yǎng)基SMS中，甘露糖（M）/蔗糖（S）濃度梯度設(shè)置為30/0、20/0、20/10、25/5、15/5（g/L），每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，觀察甘露糖篩選壓對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

1.3.3雪柑無(wú)菌實(shí)生苗不同培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。分別取完全暗培養(yǎng)30d、暗培養(yǎng)10d光照20d、暗培養(yǎng)20d光照10d、完全光照30d的雪柑上胚軸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，觀察實(shí)生苗不同培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

1.3.4不同侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。農(nóng)桿菌侵染外植體時(shí)間梯度設(shè)置為20、30、40min，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，觀察侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

1.3.5不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。外植體經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基CM中，共培養(yǎng)時(shí)間梯度為2、3、4、5d，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，觀察共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

1.3.6預(yù)處理時(shí)2，4-D濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。在農(nóng)桿菌侵染前將外植體放入附加不同濃度2，4-D的MS液體培養(yǎng)基中浸泡3h，濃度梯度為0.5、1.0mg/L，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，比較不同濃度2，4-D預(yù)處理對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。同時(shí)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基添加相應(yīng)濃度2，4-D。

1.3.72，4-D預(yù)處理時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。2，4-D預(yù)處理時(shí)間梯度設(shè)置為0、2、3、12、24h。前3個(gè)處理用加入2，4-D的MS液體培養(yǎng)基浸泡，后2個(gè)處理用加入2，4-D的MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。同時(shí)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)濃度的2，4-D。

1.3.8篩選培養(yǎng)基SMS中不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。共培養(yǎng)后，在SMS培養(yǎng)基中分別加入BA2mg/L、BA3mg/L、BA2mg/L+NAA0.5mg/L、BA1mg/L+NAA0.5mg/L、ZT2mg/L+NAA0.5mg/L、ZT1mg/L+NAA0.5mg/L，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，30d后觀察生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

2結(jié)果與分析

2.1不同OD600值對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

植物外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染時(shí)，菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化頻率影響較大。菌液濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，造成外植體褐化死亡;菌液濃度過(guò)低，則不能使足夠的農(nóng)桿菌附著在外植體的傷口處，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率嚴(yán)重下降{3]。

從表1可以看出，OD600為0.6時(shí)，抗性外植體和大苗分化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他2個(gè)梯度，在共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)。在OD600為0.1和0.4的情況下，分化率差異不顯著（P>0.01）。因此，在進(jìn)行雪柑外植體轉(zhuǎn)化時(shí)較適合菌液濃度的OD600為0.6（圖2）。

2.2不同甘露糖篩選壓對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

在以PMI基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，必須以甘露糖作為篩選劑。而雪柑上胚軸不定芽的誘導(dǎo)不能以甘露糖作為碳源{2]，所以在SMS中設(shè)置了甘露糖和蔗糖的不同濃度梯度。從表2可以看出，在SMS培養(yǎng)基中加入不同濃度的蔗糖后，抗性外植體的分化率會(huì)比單純加入甘露糖的培養(yǎng)基分化率要高，但這樣也同時(shí)增加了假陽(yáng)性芽苗的比例。在20g/L甘露糖+10g/L蔗糖和25g/L甘露糖+5g/L蔗糖2個(gè)濃度梯度時(shí)，外植體縱切面上出現(xiàn)大量的愈傷組織，隨后在愈傷組織的表面形成芽，不過(guò)這些芽大多都有玻璃化現(xiàn)象;這些玻璃化的芽在以后的壯苗篩選中會(huì)黃化死亡，很難生長(zhǎng)為健壯單株。而在SMS培養(yǎng)基中單純加入30g/L甘露糖，比單純加入20g/L甘露糖時(shí)抗性外植體的分化率有明顯降低，這樣就減少了對(duì)陽(yáng)性芽苗的篩選力度。所以在雪柑上胚軸轉(zhuǎn)化時(shí)，篩選培養(yǎng)基SMS中適合的甘露糖濃度為20g/L（圖3）。

注：鄧肯氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，不同字母表示差異達(dá)極顯著水平（P=0.01）

Note：Differentlettersmeansignificantlydifferentatthe0.01levelbyDuncansmultiplerangetest

2.3雪柑無(wú)菌實(shí)生苗培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

外植體的培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化也有影響。根據(jù)徐海峰{2]得出的結(jié)論：外植體的培養(yǎng)條件對(duì)雪柑不定芽的誘導(dǎo)存在影響，30d的雪柑上胚軸不定芽分化效率最高。由表3可知，暗培養(yǎng)20d后再光培養(yǎng)10d的上胚軸抗性外植體的分化率為86.9%，大苗分化率為14.3%，效果最好;完全光培養(yǎng)30d的上胚軸抗性外植體分化率和大苗分化率分別為17.6%和0，效果最差;暗培養(yǎng)10d光照20d和完全暗培養(yǎng)30d的上胚軸抗性外植體分化率和大苗分化率差異不顯著（P>0.01）。因此，以暗培養(yǎng)20d光照10d的上胚軸作為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果最好（圖4）。

2.4不同侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

用農(nóng)桿菌對(duì)植物外植體進(jìn)行侵染時(shí)，在一定的菌液濃度下，侵染時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵因素，時(shí)間不夠附著在外植體上的農(nóng)桿菌細(xì)胞不夠數(shù)量，難以達(dá)到好的轉(zhuǎn)化效果;而侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)引起植物外植體嚴(yán)重的農(nóng)桿菌污染，即使加入高濃度的抑菌抗生素也是無(wú)法控制的。由表4可知，侵染30min的分化率明顯比20min的高，達(dá)57.2%;當(dāng)侵染時(shí)間達(dá)40min時(shí)，共培養(yǎng)2d時(shí)即出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染，無(wú)法控制，近1/4外植體由于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過(guò)度而軟腐黃化，這種現(xiàn)象在侵染20、30min的處理中沒(méi)有出現(xiàn)。因此，雪柑外植體用農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染的最佳時(shí)間是30min。

2.5不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌對(duì)植物外植體進(jìn)行侵染時(shí)，必須在傷口部位存活16h以上，才能進(jìn)行T-DNA的轉(zhuǎn)移，此期間涉及農(nóng)桿菌向受傷部位的附著、Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)活化及T-DNA的轉(zhuǎn)移整合{3]。在黑暗中共培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間能提高不定芽的再生效率和轉(zhuǎn)化效率，對(duì)共培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果如表5所示：共培養(yǎng)2d的抗性芽分化率只有5.3%，其原因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過(guò)短，阻礙了T-DNA的有效轉(zhuǎn)移;共培養(yǎng)3d的分化率為21.6%;共培養(yǎng)4d的分化率最高達(dá)45.1%;而共培養(yǎng)5d時(shí)外植體出現(xiàn)大量的褐化死亡，其原因是農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)所致。從這個(gè)結(jié)果來(lái)看，共培養(yǎng)時(shí)間4d是最佳的。

2.6不同2，4-D濃度預(yù)培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

研究表明，2，4-D在雪柑遺傳轉(zhuǎn)化中會(huì)不同程度地提高轉(zhuǎn)化效率，而濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)愈傷組織的形成，降低抗性外植體的分化效率{4]。故用添加2個(gè)濃度的2，4-D的MS液體培養(yǎng)基對(duì)外植體進(jìn)行浸泡預(yù)處理3h，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的2，4-D。由表6可知，1.0mg/L2，4-D處理后抗性外植體的分化率高達(dá)58.2%，而0.5mg/L2，4-D處理的分化率只有22.5%。所以選用1.0mg/L的2，4-D對(duì)雪柑上胚軸進(jìn)行預(yù)處理轉(zhuǎn)化效果最好。

2.7不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入2，4-D起到了活化細(xì)胞、促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)移的作用，但是預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)雪柑上胚軸的轉(zhuǎn)化同樣具有重要的影響。該試驗(yàn)在預(yù)處理培養(yǎng)基中加入1.0mg/L2，4-D，同時(shí)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入1.0mg/L2，4-D。從表7可以看出，預(yù)處理3h時(shí)抗性外植體分化率最高達(dá)62.7%;在3h之前隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，抗性外植體分化率逐漸增高;而經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間預(yù)處理時(shí)，抗性外植體分化率緩慢下降。這說(shuō)明，長(zhǎng)時(shí)間在無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，阻礙了細(xì)胞的進(jìn)一步分裂生長(zhǎng)，加快了細(xì)胞的老化，從而使農(nóng)桿菌侵染效率下降;而適度的預(yù)處理則促進(jìn)了細(xì)胞快速分裂，從而有助于轉(zhuǎn)化效率提高。

2.8篩選培養(yǎng)基SMS中添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

從表8可以看出，2mg/LBA+0.5mg/LNAA組合的抗性外植體分化率最高達(dá)46.6%，大苗分化率也是最高達(dá)132%。鄧肯氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，2mg/LBA+0.5mg/LNAA與其他濃度組合對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響差異不顯著。這說(shuō)明在篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同濃度組合不是轉(zhuǎn)化效率的主要影響因素，但是不同組合對(duì)抗性芽的篩選有影響。所以在該試驗(yàn)中，SMS中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為2mg/LBA+0.5mg/LNAA。

3討論

筆者通過(guò)對(duì)影響轉(zhuǎn)化的各種因素的優(yōu)化試驗(yàn)建立了雪柑PMI基因/甘露糖選擇標(biāo)記系統(tǒng)的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，在菌液OD600為0.6，1mg/L2，4-D預(yù)處理3h，農(nóng)桿菌侵染30min，共培養(yǎng)4d，篩選壓為甘露糖20g/L的情況下大大提高了轉(zhuǎn)化后的再生率，而在篩選培養(yǎng)基中加入2mg/LBA+0.5mg/LNAA有助于抗性大苗的篩選，為以后的PMI基因/甘露糖選擇標(biāo)記系統(tǒng)的研究提供了可靠的依據(jù)。

3.1農(nóng)桿菌侵染用工程菌液的制備與OD600的選擇

在柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常用的農(nóng)桿菌菌株主要有LBA4404、A518、EHA105、EHA101和C58，由于它們的染色體背景和所含質(zhì)粒不同，所采用的柑橘材料也不同，各菌株的轉(zhuǎn)化效率差異顯著{5]。該試驗(yàn)中使用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105，農(nóng)桿菌的工程菌液和適當(dāng)?shù)腛D600都在遺傳轉(zhuǎn)化體系中起到至關(guān)重要的作用。農(nóng)桿菌長(zhǎng)期在-80℃中保存容易造成質(zhì)粒丟失，從而影響轉(zhuǎn)化效率，所以在轉(zhuǎn)化前要使用新培養(yǎng)的工程菌液，這樣可以保證質(zhì)粒的完整性，而用MS液體培養(yǎng)基將離心的菌體重懸后適應(yīng)性培養(yǎng)的時(shí)間不能過(guò)短，這個(gè)過(guò)程是一個(gè)讓農(nóng)桿菌適應(yīng)MS培養(yǎng)基和活化細(xì)菌的重要環(huán)節(jié)。而適當(dāng)?shù)腛D600對(duì)轉(zhuǎn)化的影響意義更大。植物外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染時(shí)，菌液濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，造成外植體褐化死亡;菌液濃度過(guò)低則不能使足夠的農(nóng)桿菌附著在外植體的傷口處，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率嚴(yán)重下降。在農(nóng)桿菌侵染外植體時(shí)的試驗(yàn)操作方面，要考慮到農(nóng)桿菌與受體細(xì)胞的互作，二者充分接觸，使農(nóng)桿菌能夠穩(wěn)定附著在受體細(xì)胞上{2]。外植體上胚軸在農(nóng)桿菌菌液中是懸浮的，必須隔幾分鐘輕微搖動(dòng)三角瓶使侵染混合體系中每個(gè)外植體都能浸沒(méi)到菌液中與之充分接觸，力度也不能太大，否則農(nóng)桿菌難以附著在外植體細(xì)胞上。侵染混合體系比例合適，50mL的三角瓶裝工程菌液30mL，外植體數(shù)90個(gè)左右，過(guò)多或過(guò)少都影響轉(zhuǎn)化效率，過(guò)多了農(nóng)桿菌無(wú)法充分接觸外植體細(xì)胞，過(guò)少了外植體往往附著農(nóng)桿菌太多，共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌容易過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致外植體死亡。

3.2甘露糖作為篩選劑在PMI選擇系統(tǒng)中的應(yīng)用甘露糖是一種正篩選底物，本身不會(huì)對(duì)植物組織造成傷害，但是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能利用甘露糖，而在PMI的作用下可以將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，6-磷酸果糖可以進(jìn)入糖酵解途徑為植物所應(yīng)用，這就是甘露糖作為篩選底物的原理{6]。如同抗生素濃度過(guò)高會(huì)造成轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制一樣，只加甘露糖不加蔗糖也會(huì)造成大量轉(zhuǎn)化細(xì)胞極度饑餓，而一定濃度的蔗糖可以緩解這種負(fù)面影響{2]。甜菜轉(zhuǎn)化時(shí)，在MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖，在甘露糖濃度達(dá)2.5～3.0g/L時(shí)，苗再生完全被抑制，但獲得最佳轉(zhuǎn)化率的甘露糖篩選濃度卻在1.25g/L左右，有20%～30%的外植體誘導(dǎo)出再生苗{7];轉(zhuǎn)化玉米時(shí)篩選培養(yǎng)基中碳源最佳組合為5g/L蔗糖+10g/L甘露糖{8];轉(zhuǎn)化水稻時(shí)采用30g/L甘露糖篩選壓不變，而將蔗糖含量由30g/L逐漸遞減至5g/L，可以得到理想的轉(zhuǎn)化效果{9];轉(zhuǎn)化辣椒時(shí)篩選培養(yǎng)基中碳源組合為20g/L蔗糖+15g/L甘露糖{10]。該試驗(yàn)參照徐海峰{2]在建立雪柑轉(zhuǎn)化體系時(shí)的甘露糖濃度，按一定的梯度試驗(yàn)尋找合適的篩選壓，發(fā)現(xiàn)在有蔗糖的篩選培養(yǎng)基SMS中，抗性芽的比例都會(huì)比較高，但外植體上長(zhǎng)出了大量的叢生芽，多為假陽(yáng)性植株，這為以后的篩選增加了難度。在轉(zhuǎn)基因植株的繼代篩選中，可適當(dāng)?shù)丶尤胝崽羌涌炜剐匝康纳L(zhǎng)，加快篩選進(jìn)度。

3.3共培養(yǎng)在轉(zhuǎn)化中的作用

外植體與農(nóng)桿菌接種后的共培養(yǎng)在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。農(nóng)桿菌的附著及T-DNA的切割、轉(zhuǎn)移和整合都是在共培養(yǎng)期間完成。所以，共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響，不同轉(zhuǎn)化材料或不同菌株類型所需的最佳共培養(yǎng)時(shí)間不同。農(nóng)桿菌接種到外植體上后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16h后才能把T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi){3]，因此共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16h。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌尚未附著，T-DNA還沒(méi)有充分切割、轉(zhuǎn)移和整合;時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植物細(xì)胞易受毒害，后續(xù)培養(yǎng)時(shí)難以除菌，農(nóng)桿菌容易過(guò)度生長(zhǎng)。根據(jù)試驗(yàn)確定在該系統(tǒng)中最佳的共培養(yǎng)時(shí)間為4d，超過(guò)時(shí)間，外植體大量的褐化死亡，農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)。在很多研究中，為了防止共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上放置不同層數(shù)的濾紙，而該研究中未使用濾紙，在4d時(shí)農(nóng)桿菌沒(méi)有過(guò)度生長(zhǎng)，這樣就降低了試驗(yàn)操作難度。

有研究表明共培養(yǎng)時(shí)的溫度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率存在影響{11]。而該試驗(yàn)由于條件限制，未能完成對(duì)共培養(yǎng)溫度的試驗(yàn)，有待于進(jìn)一步證明共培養(yǎng)溫度對(duì)雪柑遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

3.4生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在轉(zhuǎn)化中的作用

Cervera等{12]發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)時(shí)使用0.2～1.0mg/L2，4-D可以促進(jìn)愈傷組織形成，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率和再生率。Ghorbel等{13]和Domínguez等{14]也報(bào)導(dǎo)了2，4-D的加入對(duì)不定芽的再生關(guān)系不大，推測(cè)其可導(dǎo)致植物細(xì)胞形成感受態(tài)，促進(jìn)其接收外源DNA，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。Yu等{4]用不同濃度的2，4-D對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理并在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的2，4-D，雪柑轉(zhuǎn)化率由不進(jìn)行2，4-D處理的8%提高到了12%，其GUS陽(yáng)性比例相應(yīng)提高了33.6%;枳的轉(zhuǎn)化率由40%提高到80%，GUS陽(yáng)性比例提高了26.0%，2，4-D濃度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致愈傷組織大量形成，過(guò)夜處理則導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低。這說(shuō)明2，4-D的加入活化了植物組織細(xì)胞，促進(jìn)了T-DNA的轉(zhuǎn)移，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。該研究是在已知2，4-D能夠提高轉(zhuǎn)化率的前提下，用一定濃度的2，4-D對(duì)雪柑外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)時(shí)加入相應(yīng)濃度的2，4-D，來(lái)優(yōu)化雪柑轉(zhuǎn)化中所選2，4-D的濃度。從抗性不定芽的長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，1mg/L2，4-D的處理使抗性不定芽篩選后期長(zhǎng)勢(shì)較好。但預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則抗性芽的比例下降，這與Yu等{4]的結(jié)論一致。

從該試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在篩選培養(yǎng)基中加入BA、NAA、ZT3種不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)抗性芽分化率沒(méi)有太明顯的影響，但是對(duì)抗性大苗分化率影響較大。這也說(shuō)明在篩選培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不能從根本上影響轉(zhuǎn)化率的提高，而只是在芽的生長(zhǎng)分化中起到了作用，加快了其形態(tài)建成，這也與以往外源激素在組織培養(yǎng)中的作用研究得到統(tǒng)一。在篩選培養(yǎng)基中不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合促進(jìn)了抗性大苗分化，這為后面轉(zhuǎn)基因植株的篩選和培養(yǎng)提供了便利。

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