水稻OsVDAC4誘餌蛋白載體的構建及鑒定

白雪琪等

摘要 ?{目的]獲得可用于篩選膜蛋白酵母雙雜交文庫的誘餌蛋白載體。{方法]在對OsVDAC4進行生物信息學分析的基礎上，將OsVDAC4全長ORF分別與pBT3-N和pBT3-SUC連接，構建2個誘餌蛋白載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub，利用膜蛋白酵母雙雜交技術鑒定出可用于篩庫的誘餌蛋白載體。{結果]pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以與目標蛋白互作，但由于OsVDAC4的N端有約50個可自由伸展的氨基酸殘基導致pBT3-OsVDAC4-N-Cub本底反應非常強，OsVDAC4的C端存在于膜中而沒有可自由伸展的氨基酸殘基，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的本底反應很弱。{結論]pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可用于文庫篩選，這為獲取OsVDAC4的互作蛋白提供了基礎。

關鍵詞 ??OsVDAC4;誘餌蛋白載體;膜蛋白酵母雙雜交

中圖分類號S??188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）36-0090-05

電壓依賴性陰離子通道（voltagedepeendentanionchannels，VDACs）最早是從草履蟲線粒體外膜上分離得到的{1]，它廣泛存在于線粒體外膜上，是線粒體外膜上最豐富的蛋白之一{2]。VDACs通過與胞質、線粒體和細胞骨架蛋白以及其他膜通道相互作用，通過線粒體外膜的代謝物或離子轉運以及線粒體介導的細胞凋亡和能量代謝等參與許多細胞進程{3-4]。VDACs可以折疊成19-β-鏈的桶狀結構，且它的N末端在桶外部并且包含α-螺旋結構{5]。幾乎所有細胞功能都依賴復雜的蛋白間相互作用來完成{6]。為了探究水稻中VDAC的結構、功能及作用機理，生物技術國家民委重點實驗室植物遺傳與發(fā)育課題組之前在日本晴中鑒定出8種VDAC蛋白，并對其結構及表達模式等進行了預測，OsVDAC4編碼317個氨基酸{7]，OsVDAC4蛋白定位于線粒體{8]。為了研究OsVDAC4的作用機理，必須獲取與其相互作用的蛋白質因子。用于膜系統(tǒng)相互作用蛋白篩選的膜酵母雙雜交系統(tǒng)要求相互作用的蛋白均位于細胞質中，所以該研究針對預測得到的OsVDAC4跨膜方式，構建2種不同的OsVDAC4全長的誘餌蛋白載體（pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub），鑒定出適合篩選OsVDAC4互作蛋白的誘餌載體，為篩選OsVDAC4的互作蛋白奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

酵母菌株NMY51、載體pBT3-N、pBT3-SUC、pPR3-N均購自DualsystemsBiotech公司;限制性內切酶SfiI、T4DNA連接酶購自BioLabs公司;各種氨基酸、YNB、X-Gal、Zbuffer均購自Coolaber公司;3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）、RNaseA、鮭魚精購自SIGMA公司;瓊脂、DMSO購自賽國生物科技有限責任公司;酵母提取物、PEG4000購自OXOID公司;氯化鈉、醋酸鋰、葡萄糖、魚粉蛋白胨購自國藥集團化學試劑有限公司;片段回收試劑盒購自Axygen公司;酵母質粒提取試劑盒購自康為公司;ExTaq酶、反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司;水稻粵泰B幼穗cDNA文庫、日本晴種子由中南民族大學生物技術國家民委重點實驗室提供。

1.2儀器

C1000touchthermalcyclerPCR儀（美國Bio-Rad）;UniversalHoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)（美國）;HeraeusMultifugeX1R高性能通用臺式冷凍離心機（德國）;HeraeusPico21Centrifuge微量臺式冷凍離心機（德國）;SBD50-1水浴鍋（丹麥Heto-Holten）;NanodropND-2000超微量核酸蛋白測定儀（美國）;DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國）;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（中國）;72N紫外可見分光光度計（中國）;ZQZY-70BS兩層小容量振蕩培養(yǎng)箱。

1.3方法

1.3.1

RNA的提取與反轉。取日本晴1～2cm的幼穗放入預處理后預冷的研缽中，加入液氮快速研磨，將100mg粉末轉移到RNasefree的1.5mLEP管中，加入1mLTRIzol，迅速混勻。室溫靜置5min后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5min。4℃12000r/min離心15min，吸取400μL上清。加入500μL異丙醇，混勻，室溫靜置10min。4℃12000r/min離心15min，得到白色沉淀。沉淀用1mL75%乙醇（DEPC水配制）洗滌2次，晾干后加20μLDEPC水溶解。65℃水浴5min，測定RNA濃度，取2μLRNA樣品進行電泳檢測，剩下樣品用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser試劑盒進行反轉錄，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3.2

OsVDAC4的擴增。從日本晴幼穗cDNA中分別擴增出用于連接pBT3-N和pBT3-SUC的目的片段OsVDAC4-N和OsVDAC4-SUC。20μLPCR反應體系組成為10×Buffer2μL、2.5mmol/LdNTPsmixture1μL、10μmol/LOsVDAC4ORF擴增引物（表1）各0.3μL、5U/μLExTaq0.1μL、cDNA模板1μL，無菌水15.3μL。PCR反應程序為95℃預變性5min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán);72℃延伸10min。反應結束后，取2μL產物進行電泳檢測，剩下產物用于切膠回收。用Axygen公司的切膠回收試劑盒回收目的片段，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.3.3誘餌蛋白載體構建。用限制性內切酶SfiI分別酶切PCR擴增后回收的OsVDAC4-N、OsVDAC4-SUC以及載體pBT3-N和pBT3-SUC質粒。50μL酶切反應體系組成為DNA15μL、10×NEBbuffer5μL、20U/μLSfiI1μL、無菌水29μL，50℃酶切6h。用Axygen公司的清潔回收試劑盒回收酶切后的DNA，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3.3.1

目的片段與載體的連接。將回收的目的片段OsVDAC4-N連接載體pBT3-N，OsVDAC4-SUC連接載體pBT3-SUC。20μL連接體系組成為質粒1μL、目的片段5μL、10×T4-Ligasebuffer2μL、2.5U/μLT4-Ligase1μL、無菌水11μL，16℃過夜。

1.3.3.2連接產物轉化大腸桿菌。從-80℃冰箱中取出制備好的感受態(tài)細胞，置于冰浴上解凍，加入連接產物，混勻，在冰浴上靜置30min，42℃熱激90s，冰上放置5min，再加入800μLLB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃180r/min1h。取100μL菌液涂抗性平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.3.3.3

重組質粒的陽性鑒定。從平板上挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜（180r/min），取菌液1.4mL收集菌體，加100μLSolutionⅠ使沉淀重懸，加200μLSolutionⅡ，混勻后放置冰浴3min，加150μLSolutionⅢ，混勻后冰浴放置5min。4℃14000r/min離心5min，取上清至另一離心管中，加入2/3體積的異丙醇，搖勻，4℃14000r/min離心10min，沉淀用500μL75%乙醇洗滌2次。晾干后加入30μL1×TE（1∶1000加入RNaseA），溶解后4℃保存。

分別用pBT3-NF/pBT3-NR，pBT3-SUCF/pBT3-SUCR引物（表1）進行重組質粒的陽性鑒定，PCR體系和程序同“1.3.2”。

1.3.4誘餌蛋白載體的篩選。

1.3.4.1

酵母菌株NMY51的活化與收集。取保存的酵母菌株NMY51在1×YPAD平板上劃線后30℃培養(yǎng)3d。挑取單菌落于50mL1×YPAD液體培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)（200r/min）。當酵母OD546達0.6～0.8時，將菌液置于冰上至完全冷卻。將菌液轉移至50mL離心管中，2500r/min離心5min收集菌體，再用2.5mL無菌水重懸菌體，置于冰上，備用。

1.3.4.2

PEG/LiOAcMasterMix的制備。將鮭魚精DNA（10mg/mL）稀釋至2mg/mL，沸水煮10min，立即置于冰上備用。配制PEG/LiOAcMasterMix5份，每份組成為50%PEG4000240μL、1mol/LLiOAc36μL、2mg/mL鮭魚精DNA25μL，總體積301μL。

1.3.5抑制假陽性3-AT濃度的篩選。將質粒pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub和pBT3-OsVDAC4-N-Cub分別轉化入酵母菌NMY51，獲得含誘餌蛋白載體的酵母菌株。再將文庫空載質粒pPR3-N分別轉化入含不同誘餌蛋白載體的酵母菌株，用2×YPAD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)90min（150r/min）。收集菌體并用0.9%NaCl溶液重懸菌體，取300μL菌液涂布含有不同濃度3-AT的SD-Trp-Leu-His-Ade平板，30℃倒置培養(yǎng)3～4d。

1.3.6酵母陽性克隆LacZ活性檢測。參考諶鑫{9]的方法，按20μLX-gal（20mg/mL）∶12μLβ-巰基乙醇∶2mLZbuffer配制染色液，加到放置有2張濾紙的9cm培養(yǎng)皿中，使濾紙浸濕。取一張浸濕的濾紙，覆蓋在已30℃培養(yǎng)3～4d的菌體表面，輕按濾紙后用鑷子小心揭下，并置于液氮中迅速冷凍10～30s，然后在室溫中解凍。將解凍的濾紙置于另一張浸濕的濾紙上，注意讓粘有菌體的一面朝上，趕走濾紙間的氣泡。30℃孵育5min，觀察菌斑是否顯出藍色。

2結果與分析

2.1OsVDAC4的跨膜結構及空間結構預測

用PRED-TMBB{10]和BOCTOPUS{11]在線軟件對OsVDAC4的跨膜結構進行預測，結果發(fā)現OsVDAC4有14次跨膜，其C端跨膜結構較為集中，且C端可能位于膜內靠內側、N端位于膜內側（圖1）。進一步用I-TASSER預測OsVDAC4的空間結構{12]，根據https：∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/預測（圖2），OsVDAC4的C端可能位于膜內靠內側，與PRED-TMBB和BOCTOPUS的預測一致;而N端預測結果稍有差異，有可能位于膜內側，也有可能位于膜外側，還有可

2.2誘餌蛋白載體構建

試驗表明，OVDAC4在花藥中有高表達，而在其他部位幾乎都不表達{7]，所以用日本晴幼穗提取RNA，反轉成cDNA，用于擴增OsVDAC4。OsVDAC4全長954bp，從圖3可以看出PCR擴增出來的條帶大小正確，可以用于下一步試驗。

將片段用試劑盒回收后，連接載體pBT3-N和pBT3-SUC。將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α，涂帶有Kan的抗性平板，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，提取質粒。圖4是對質粒進行PCR后的結果，條帶大小正確，測序結果表明序列正確，可用于誘餌蛋白載體的篩選。

2.3OsVDAC4誘餌蛋白載體的篩選

泛素蛋白可以分為Cub（包含泛素蛋白的第34～76氨基酸）和NubI（包含泛素蛋白的第1～38氨基酸），Cub與NubI在自然條件下可以形成完整的泛素蛋白，而將NubI突變成NubG之后，Cub與NubG在自然條件下不能形成完整的泛素蛋白。AIg5蛋白是一種廣泛存在于酵母中的跨膜蛋白，其N端和C端均位于細胞質中。該試驗采用3種不同載體的AIg5蛋白（pAI-AIg5-N-NubI、pDL2-AIg5-N-NubG和pCCW-AIg5-C-Cub），pAI-AIg5-N-NubI與pCCW-AIg5-C-Cub作為陽性對照{9]。為了確定誘餌蛋白OsVDAC4的哪一端存在于細胞質中可以與互作蛋白作用，分別將其N端與帶有Cub的載體pBT3-N相連（pBT3-OsVDAC4-N-Cub），C端與帶有Cub的pBT3-SUC

相連（pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub），當誘餌蛋白載體連有泛素Cub的N端或C端也位于細胞質時，便能同AIg5的N

端或C端連接上的NubI相互結合，形成完整泛素分子，最終導致報告基因的表達，酵母可以在四缺培養(yǎng)基SD-Trp-Leu-His-Ade（SD-4）上生長，GUS染色為藍色。該試驗將5組質粒DNA分別共轉入酵母細胞，陽性對照組（pAI-AIg5-N-NubI+pCCW-AIg5-C-Cub）在SD-Trp-Leu（SD-2）平板上長出白色菌落，在四缺培養(yǎng)基SD-Trp-Leu-His-Ade平板上稀釋了10-4后也長出菌落（圖5A），說明陽性對照組間的互作明顯高于試驗組和陰性對照組。試驗組pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-OsVDAC4-N-Cub（第2組）和pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub（第3組）在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上都有生長，在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上也有生長，但第3組在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上的長勢優(yōu)于第2組。在SD-Trp-Leu平板上第2組長出的菌落是白色的，而第3組長出的菌落是粉紅色的，根據DUALmembranestarterkitsUserManual上的說明，當2個蛋白之間相互作用弱時，

酵母體內的腺嘌呤合成途徑受阻，會有紅色代謝物積累，因

此酵母會呈現出粉紅色，而第3組在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上呈現出白色菌落，且生長狀態(tài)良好，SD-Trp-Leu培養(yǎng)

基中要比SD-Trp-Leu-His-Ade培養(yǎng)基中多加了Ade和His這2種氨基酸，由此推測在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上酵母呈現出粉紅色可能是由于培養(yǎng)基中的Ade足夠酵母生長所需，不需要自身合成，于是酵母呈現粉紅色。但陰性對照組pBT3-OsVDAC4-N-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第4組）和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第5組）在SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade平板上均有生長，第5組的長勢較弱（圖5A）。進一步檢測LacZ的活性，發(fā)現陰性對照組也能染為藍色（圖5B）。這些結果說明pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以用于篩選膜酵母雙雜交文庫，但可能具有較高的本底反應。

為了降低本底反應，進行3-AT的嚴謹性優(yōu)化。將文庫空載pPR3-N分別轉化至含有誘餌蛋白載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的酵母菌株中。pPR3-N上帶有突變的NubG，誘餌蛋白載體pBT3-SUC-OsVDAC4上帶有Cub，為了減少假陽性，消除本底反應，在用3-AT來減少假陽性的同時也使蛋白互作相對較弱的菌能夠生長，設置了4個濃度梯度，分別是0、1.0、2.5、5.0mmol/L，重復3次試驗，結果表明在不加3-AT的條件下文庫空載pPR3-N與誘餌蛋白載體pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub沒有發(fā)生本底反應（圖6），而文庫空載pPR3-N與誘餌蛋白載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub在試驗所用的3-AT濃度范圍內本底反應很強，隨后加大3-AT濃度，到80mmol/L還是有很強的本底反應。這些結果說明誘餌蛋白載體pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可以用于膜酵母雙雜交文庫的篩選。

3討論

生物技術國家民委重點實驗室植物遺傳與發(fā)育課題組之前在日本晴中鑒定出了8個VDAC基因，即OsVDAC1～8。利用生物信息學方法對OsVDAC1～8進行了結構分析，并通過RT-PCR技術分析了OsVDAC1～8的表達模式，嘗試構建部分OsVDACs的RNAi植株，并取得初步成功。然后對OsVDACs的原核、真核表達進行研究，并對OsVDACs進行亞細胞定位。通過膜蛋白酵母雙雜交技術從YTB幼穗cDNA文庫中篩選到了OsVDAC3的3個互作蛋白，成功得到了OsVDAC3超表達植株，并進一步驗證了OsVDAC3與其互作蛋白間的互作。成功得到了OsVDAC5的RNAi轉基因植株，并篩選得到了7個與OsVDAC5（1～75aa）互作的蛋白{9]，將其命名為OsV5IP1～7，為了探索OsVDAC5（1～75aa）與OsV5IP1～7是否真正互作，還進行了酵母雙雜、pulldown、BiFC、亞細胞定位，試驗結果顯示它們之間發(fā)生了互作。

該試驗從日本晴幼穗cDNA中擴增出OsVDAC4全長片段，連接載體pBT3-N和pBT3-SUC，得到重組載體pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub。在正式篩選文庫之前對2個誘餌蛋白載體進行篩選，結果表明pBT3-OsVDAC4-N-Cub的試驗組和陰性對照都長勢良好，相比較而言，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的試驗組長勢良好的同時，陰性對照長勢較弱。并且在之后的3-AT濃度篩選試驗中發(fā)現，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub與文庫空載幾乎沒有發(fā)生本底反應，而pBT3-OsVDAC4-N-Cub與文庫空載發(fā)生的本底反應難以抑制，所以pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub載體更合適篩庫。根據生物信息學分析，上述試驗結果產生的原因可能是由于OsVDAC4的C端位于膜結構中，與之相連的Cub自由度較小，難以與沒有互作的空間上較遠的NubG反應，因此本底反應弱。OsVDAC4的N端Cub與沒有互作的空載上的NubG具有很強的互作，說明其N端沒有在膜內側或膜中間的桶狀結構中，而是位于膜外側的細胞質中;由于其N端有約50個氨基酸殘基在膜結構外面處于伸展狀態(tài)，因此與它相連的Cub可以與在空間上相距很遠的NubG互作，表現為很強的本底反應。綜上所述，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub更適合于下一步進行互作蛋白的篩選。

參考文獻

{1]SCHEINSJ，COLOMBINIM，FINKELSTEINA.Reconstitutioninplanarlipidbilayersofavoltagedependentanionselectivechannelobtainedfromparameciummitochondria{J].Journalofmembranebiology，1976，30（2）：99-120.

{2]MESSINAA.VDACasapharmaceuticaltarget{J].Currentmedicinalchemistry，2017，24（40）：4417-4418.

{3]MAURYASR，MAHALAKSHMIR.MitochondrialVDAC2andcellhomeostasis：Highlightinghiddenstructuralfeaturesanduniquefunctionalities{J].BiologicalreviewsoftheCambridgePhilosophicalSociety，2017，92（4）：1843-1858.

{4]DELISLEL，FUHRMANNM，QURC，etal.TheVoltageDependentAnionChannel（VDAC）ofPacificOystersCrassostreagigasisupaccumulatedduringinfectionbytheOstreidHerpesvirus1（OsHV1）：AnindicatoroftheWarburgeffect{J].Marinebiotechnology，2018，20（1）：87-97.

{5]SHUVOSR，KOVALTCHOUKU，ZUBAERA，etal.FunctionalcharacterizationofanNterminallytruncatedmitochondrialporinexpressedinNeurosporacrassa{J].Canadianjournalofmicrobiology，2017，63（8）：730-738.

{6]XINGSP，WALLMEROTHN，BERENDZENKW，etal.Techniquesfortheanalysisofproteinproteininteractionsinvivo{J].Plantphysiology，2016，171（2）：727-758.

{7]XUX，TANYP，CHENGG，etal.GenomicsurveyandgeneexpressionanalysisoftheVDACgenefamilyinrice{J].Geneticsandmolecularresearch，2015，14（4）：15683-15696.

{8]李林鵬.水稻4個OsVDAC蛋白的亞細胞定位和超表達osvdac3對水稻生長的影響{D].武漢：中南民族大學，2013.

{9]諶鑫.水稻OsVDAC5互作蛋白篩選及其基因RNA干涉{D].武漢：中南民族大學，2015.

{10]TSIRIGOSKD，ELOFSSONA，BAGOSPG.PREDTMBB2：Improvedtopologypredictionanddetectionofbetabarreloutermembraneproteins{J].Bioinformatics，2016，32（17）：665-671.

{11]HAYATS，ELOFSSONA.BOCTOPUS：Improvedtopologypredictionoftransmembraneβbarrelproteins{J].Bioinformatics，2012，28（4）：516-522.

{12]ZHANGY.ITASSERFullyautomatedproteinstructurepredictioninCASP8{J].Proteins，2009，77（S9）：100-113.