一株氨氮降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究

張超等

摘要 ?{目的]篩選出能高效降解氨氮或總氮的菌株。{方法]以北京市南宮堆肥廠的垃圾滲濾液為材料，并從中篩選出一株具有高效降解氨氮能力的菌株，通過形態(tài)觀察、革蘭氏染色和16SrDNA分子鑒定等方法對(duì)其進(jìn)行種屬的鑒定，且對(duì)該菌株降解氨氮最適條件進(jìn)行研究。{結(jié)果]通過鑒定發(fā)現(xiàn)該菌株屬于弗式檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii），命名為弗式檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）H-1，簡(jiǎn)稱H-1。該菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)氨氮的去除最適的pH為7，最適的氨氮濃度為500mg/L，最適的C/N為8∶1，最適的接種量為1%，最適的C源為紅糖∶檸檬酸鈉（4∶1）組合的復(fù)合C源，在最適的條件下，其對(duì)氨氮的降解率為82.5%。{結(jié)論]該菌株對(duì)處理含有高濃度氨氮的污水具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為環(huán)保工作者開發(fā)污水中氨氮的高效處理提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 ??氨氮降解菌;滲濾液;篩選鑒定;降解特性

中圖分類號(hào)X??172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）36-0053-04

伴隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，垃圾的產(chǎn)量也逐年增高，2015年垃圾產(chǎn)生量已經(jīng)達(dá)790.33萬t{1]。在多數(shù)發(fā)展和發(fā)展中國(guó)家，處理垃圾的主要手段是垃圾填埋{2]，垃圾在填埋的過程中，由于自身發(fā)酵產(chǎn)水、雨水沖淋、地表和地下水浸泡等會(huì)產(chǎn)生大量的垃圾滲濾液。垃圾滲濾液是一種高濃度的有機(jī)廢水，具有水質(zhì)復(fù)雜，有機(jī)物、氨氮、TN和COD含量高等特點(diǎn)。這些垃圾滲濾液如果不加以處理，不僅會(huì)污染地下水源{3]，還會(huì)污染周邊的環(huán)境，進(jìn)而對(duì)人畜造成威脅。

垃圾滲濾液的主要污染物之一氨氮，因?yàn)槠湫再|(zhì)穩(wěn)定，不易被物理化學(xué)的方法徹底去除，因此多采用生化工藝，通過微生物的硝化和反硝化作用，將其去除。近年來，人們陸續(xù)篩選出能降解氨氮的微生物，細(xì)菌有假單胞菌屬（Pseudomonassp.）{4-5]、糞產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenesfaecalis）{6]、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）{7-8]、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）{9-10]、紅球菌屬（Rhodococcussp.）{11]、副球菌屬（Paracoccus）{12]、蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）{13]、普羅維登斯菌（Providencia）{14]等，真菌有酵母菌屬{15-17]、鐮刀菌屬{18-19]、青霉菌屬{19]等。筆者從垃圾滲濾液中分離篩選出了一株具有降解高氨氮能力的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了種屬的初步鑒定，且對(duì)該菌株降解氨氮最適條件進(jìn)行了研究，旨在為處理高濃度氨氮廢水奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源。該試驗(yàn)篩選出的氨氮降解菌株所用的滲濾液來源于北京市南宮堆肥廠。

1.1.2培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1菌株的分離純化和篩選。

取滲濾液5mL，加入到滅菌后的100mL富集培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)（30℃，180r/min），連續(xù)富集5d，5d后以1%的比例轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)富集5d。富集之后，用稀釋涂布平板法以10-3、10-4、10-53個(gè)梯度分別涂布于分離培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)。用接種針挑出所有單菌落，以三線法在分離培養(yǎng)基上純化4～5次，直至純化出單一菌落，對(duì)所純化出的所有單菌落進(jìn)行編號(hào)，并進(jìn)行氨氮降解的初步篩選，把氨氮去除效率高的單菌落保存于-80℃超低溫冰箱中，備用。

1.2.2菌株的形態(tài)特征及分子鑒定。

把超低溫冰箱保存的編號(hào)為H-1的菌株接種到篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，以其菌液為模版用細(xì)菌擴(kuò)增的通用引物27f和1492r擴(kuò)增其16srDNA序列，擴(kuò)增之后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶大小約1500bp，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送到北京博邁德基因技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果出來之后在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，并用MEGA5.0做相似性分析，構(gòu)建菌株H-1的分子發(fā)育樹。引物由北京博邁德基因技術(shù)公司合成，序列如下：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系為模板（菌液）0.5μL，PCRmix10.0μL，引物各0.5μL，水13.5μL;PCR反應(yīng)條件為94℃、5min，94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，72℃、10min，4℃冷卻，35個(gè)循環(huán)。

1.2.3H-1菌株降解氨氮最適條件研究。

研究氨氮初始濃度、可利用C源、C/N比、pH、接種量等條件下H-1菌株對(duì)氨氮轉(zhuǎn)化的影響。具體操作如下：用接種環(huán)挑取H-1單菌落接種到裝有100mL篩選培養(yǎng)基中，置于28℃、180r/min搖床中培養(yǎng)，每24h取菌液檢測(cè)其氨氮濃度，連續(xù)檢測(cè)5d，計(jì)算氨氮降解率。每一條件均設(shè)2個(gè)對(duì)照，3個(gè)平行樣，自然pH為6.8。除最適氨氮濃度試驗(yàn)外，其他條件下氨氮初始濃度均為500mg/L;除pH試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)pH均為6.8;除C/N試驗(yàn)外，其他條件下C/N均為8∶1;除可利用C源試驗(yàn)和接種量試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)C源均為檸檬酸三鈉。氨氮初始濃度分別設(shè)500、750、1000、1250、1500mg/L;pH分別設(shè)5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;C/N分別設(shè)8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1;可利用C源試驗(yàn)分別設(shè)紅糖、檸檬酸三鈉、葡萄糖、蔗糖、紅糖/檸檬酸三鈉（4∶1）;接種量（菌液）分別設(shè)1%、3%、5%、7%、9%，C源為紅糖/檸檬酸三鈉（4∶1）。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的形態(tài)特征及分子鑒定

2.1.1菌株的形態(tài)特征。H-1菌株在分離平板上培養(yǎng)24h可觀察到其凸起生長(zhǎng)，菌體白色，濕潤(rùn)，邊緣平滑無刺，突起生長(zhǎng)，正反面顏色相同，繼續(xù)培養(yǎng)24h，可觀察到菌落表面微泛黃。在顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞短桿狀，革蘭氏染色陰性（圖1）。

2.2H-1菌株降解氨氮最適條件研究

2.2.1最適氨氮初始濃度試驗(yàn)。

不同的氨氧化菌對(duì)氨氮濃度的耐受程度不同，2006年Kim等{20]和Joo等{21]的研究均表明，高濃度氨氮會(huì)抑制氨氮降解菌及其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，影響氨氧化菌的活性，進(jìn)而影響微生物對(duì)氨氮的去除，因此篩選出具有高效氨氮耐受性的菌株對(duì)實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。

由圖3可知，硫酸銨作為培養(yǎng)基中唯一的氮源，紅糖作為唯一的C源，在氨氮初始濃度分別為500、750、1000、1250、1500mg/L時(shí)，氨氮在第5天時(shí)的降解率分別是73.23%、57.17%、51.61%、45.47%和39.51%。表明氨氮初始濃度在500～1500mg/L時(shí)，隨著初始氨氮濃度的升高，氨氮降解率雖然不斷下降，但其降解速率逐漸增高，說明高濃度的氨氮并未抑制該菌株對(duì)氨氮的降解，菌株的這種氨氮去除特性在實(shí)際工程應(yīng)用中具有較強(qiáng)的潛力。

2.2.2最適C/N試驗(yàn)。

C/N是直接影響微生物的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物積累的重要因子之一，Taylor等{14]研究不同C/N對(duì)ProvidenciarettgariYL生長(zhǎng)代謝和氨氮去除的影響發(fā)現(xiàn)，C/N為10時(shí)，氨氮的去除與C源的消耗達(dá)到最佳的平衡狀態(tài)。因此合適的C/N對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝及氨氮的去除效率都具有重要意義，該試驗(yàn)在富集和初篩時(shí)選用的C/N均為8∶1，以此為基礎(chǔ)逐漸增加C/N至12∶1，以期選出最適的C/N，以優(yōu)化該菌株對(duì)氨氮的降解能力。

從圖4可以看出，當(dāng)碳源為檸檬酸鈉，硫酸銨為唯一N源時(shí)，氨氮初始濃度為500mg/L時(shí)，C/N在8∶1～12∶1時(shí)H-1菌株對(duì)氨氮的降解效率幾乎沒有影響。推測(cè)可能該菌株對(duì)C源濃度需求不敏感，或者是C/N梯度設(shè)計(jì)距離較小，沒有把C/N的差距拉開的原因。

2.2.3最適pH試驗(yàn)。每種微生物都有其自身最適生長(zhǎng)的pH，pH過高過低都會(huì)影響其生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響微生物對(duì)氨氮的去除能力。由圖5可知，當(dāng)pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時(shí)，其對(duì)氨氮的去除率分別為60.51%、66.6%、74.02%、66.84%、62.28%，該菌在pH為7.0的條件下，其降解率最高，但是當(dāng)pH僅僅下降至6.5或升高至7.5時(shí)，其降解率明顯下降，表明該菌株對(duì)pH的要求相對(duì)比較嚴(yán)格。

2.2.4可利用C源試驗(yàn)。

微生物生命活動(dòng)所需的能量及其細(xì)胞的碳架都需要碳源。合適的碳源能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而提高微生物對(duì)氨氮降解的能力。從圖6可以看出，該菌對(duì)檸檬酸鈉、紅糖、蔗糖、葡萄糖作為C源均能利用。當(dāng)C源為檸檬酸鈉時(shí)，其氨氮降解率最高，為72.94%;其次是紅糖，為65.87%;葡萄糖的利用稍差，其降解率僅55.95%;但當(dāng)C源為紅糖/檸檬酸鈉（4∶1）組合的復(fù)合C源時(shí)，在其他條件不變的情況下，其氨氮降解率提高至80.02%。因此，菌株H-1對(duì)降解氨氮最適的C源是紅糖/檸檬酸鈉（4∶1）復(fù)合C源。

2.2.5最適接種量試驗(yàn)。

接種量決定了菌株的繁殖速度，從圖7可以看出，硫酸銨作為培養(yǎng)基中唯一的氮源，檸檬酸鈉作為唯一的C源時(shí)，當(dāng)初始氨氮濃度不變時(shí)，在接種48h內(nèi)，接種量在5%～9%時(shí)對(duì)氨氮的去除率要稍高于接種量為1%～3%，但是當(dāng)64h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，接種量在1%～3%其對(duì)氨氮的去除率反而要高于接種量為5%～9%。因此菌株H-1降解氨氮最適的接種量為1%～3%。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)從北京市南宮垃圾堆肥廠垃圾滲濾液中篩選出了一株降解氨氮的菌株，分子鑒定結(jié)果表明其屬于弗式檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）屬。

菌株H-1降解氨氮最適條件的研究表明，雖然當(dāng)氨氮初始濃度為500mg/L時(shí)，其降解率最高，達(dá)73.23%，但是當(dāng)氨氮初始濃度在500～1500mg/L時(shí)，隨著初始氨氮濃度的升高，氨氮降解率不斷下降，其降解速率逐漸增高，說明高濃度的氨氮并未抑制該菌株對(duì)氨氮的降解，這與劉志云等{15-16]的研究結(jié)果類似。劉志云等在研究粉狀畢赤酵母NGH在不同初始氨氮濃度耐受性試驗(yàn)時(shí)表明，當(dāng)初始濃度分別為111.19、356.02、645.49、1233.47mg/L時(shí)，菌株NGH在24h內(nèi)的氨氮降解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，氨氮降解速率卻呈現(xiàn)上升趨勢(shì);研究克柔假絲酵母LSA時(shí)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨氮初始濃度為100、300、600、1200mg/L時(shí)，菌株LSA在接種后24h內(nèi)的氨氮降解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，氨氮降解速率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。劉志云等認(rèn)為菌株的這種氨氮去除特性在實(shí)際工程應(yīng)用中具有很大的潛力。當(dāng)C/N在8∶1～12∶1時(shí)，菌株H-1對(duì)氨氮的降解效率幾乎沒有影響。李明堂等{9]在研究耐冷約氏不動(dòng)桿菌DBP-3時(shí)發(fā)現(xiàn)，C/N從8增加至10時(shí)，氨氮的去除率并沒有明顯增加，但是當(dāng)C/N從4增加至8時(shí)，菌株DBP-3對(duì)氨氮的去除率隨著C/N的增加而明顯增加。Kim等{20]將多株芽孢桿菌屬的細(xì)菌在不同條件下進(jìn)行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其氨氮去除率在C/N為8時(shí)明顯高于C/N為4時(shí)。因此菌株H-1在C/N為8∶1～12∶1時(shí)對(duì)氨氮的降解效率沒有影響，可能是C/N為8∶1～12∶1時(shí)都達(dá)到了氨氮的去除與C源的消耗互相平衡的狀態(tài)，而考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的成本問題，菌株H-1降解氨氮最適的C/N選為8∶1。菌株對(duì)pH要求相對(duì)嚴(yán)格，其最適的pH為7.0。在已有的報(bào)道中，王濤等{8]從土壤中分離出的一株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）N9，其最適pH也為7.0，而朱偉等{4]從生活污水處理污泥中篩選出的一株假單胞菌（Pseudomonas）DX3最適的pH為7.5，喻其林等{22]從雞糞好氧堆肥分離出的一株氨氧化青霉（Penicilliumsp.）M25-22，其最適pH為8.0，這與微生物生存的環(huán)境有關(guān)，在不同環(huán)境中篩選的菌種是有一定差異的。菌株H-1降解氨氮最適的C源是紅糖/檸檬酸鈉（4∶1）復(fù)合C源。菌株H-1降解氨氮最適的接種量為1%～3%。在最適的條件下，當(dāng)初始氨氮濃度為500mg/L，其對(duì)氨氮的最高降解率為82.5%。

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