• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    超高效液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)優(yōu)化方法檢測小麥脫氧麥根酸

    2018-05-14 08:59:49樊慶琦崔德周郭鋼
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年20期

    樊慶琦 崔德周 郭鋼

    摘要 [目的]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)優(yōu)化方法檢測小麥脫氧麥根酸(DMA)。[方法]以山東省5個小麥品種為研究對象,利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/ESI-MS)檢測小麥苗期根系洗脫液的DMA。[結(jié)果]一級質(zhì)譜分子離子峰m/z 305.2,二級質(zhì)譜以正離子m/z 286.8和m/z 133.9進行定量,DMA標(biāo)準(zhǔn)品與小麥根系洗脫液的質(zhì)譜圖完全一致,因此,該方法可適用于大批量檢測普通小麥根系洗脫液DMA。5個小麥品種在正常培養(yǎng)下,DMA分泌速率較低,但在缺鐵脅迫下,DMA分泌速率呈極顯著升高,增加6 242.86~62 833.42倍。[結(jié)論]小麥脫氧麥根酸UPLC/ESI-MS檢測方法的建立,為深入研究其遺傳機理提供了方法基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞 小麥;脫氧麥根酸;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

    中圖分類號 S512.1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2018)20-0155-04

    Abstract [Objective] The research aimed to detect wheat deoxyger minic acid(DMA) by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLCMS/MS) serial optimization method.[Method]Five wheat varieties from Shandong Province were selected to study the DMA of root eluent in wheat seedling stage by UPLC/ESIMS.[Result] The first class mass spectrometry ion peak was m/z 305.2 and the second class mass spectrometry was quantified by positive ions m/z 286.8 and m/z 133.9. The standard product was identical with mass spectrum of wheat root eluent. Therefore, this method could be applied to mass detection of DMA in root eluent of common wheat. The DMA secretion rate of the five varieties was low under control treatment, but increased significantly under iron deficiency, which increased by 6 242.86-62 833.42 times. [Conclusion]The establishment of UPLC/ESIMS method for DMA detection in wheat provides a basis for the further study of its genetic mechanism.

    Key words Wheat;Deoxygerminic acid(DMA);UPLC/ESIMS

    包括小麥在內(nèi)的禾本科單子葉植物,根系能夠合成麥根酸類物質(zhì)(即植物鐵載體,簡稱PS)并分泌至根系周圍,螯合游離態(tài)的Fe3+,并經(jīng)根系轉(zhuǎn)運至體內(nèi)滿足生長發(fā)育必需的鐵營養(yǎng)[1-2]。目前已明確,麥根酸類物質(zhì)具有多種形式,L-甲硫氨酸作為合成前體,與ATP一起形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),3個分子的S-腺苷甲硫氨酸在尼克煙酰胺合成酶(NAs)催化下合成1個分子的尼克煙酰胺(NA),尼克煙酰胺在煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)等酶的催化作用下,形成脫氧麥根酸(DMA),進一步轉(zhuǎn)化為麥根酸(MA)、阿凡酸(AVA)、羥基麥根酸(HMA)、3-表羥基麥根酸(epi-HMA)、3-表羥基脫氧麥根酸(epi-HDMA)等麥根酸類植物鐵載體[3]。普通小麥主要以DMA為主[4-6]。

    對于麥根酸類物質(zhì)的定量檢測,眾多學(xué)者開展了大量的研究,提出了不同的檢測方法。一類是根據(jù)麥根酸類物質(zhì)與鐵螯合的特性,通過比色法間接測量鐵的活化量,經(jīng)換算后得出PS的分泌率[7];另一類是通過紙層析法[1,8-9]和高效液相色譜熒光方法等[10-13]。根據(jù)離子交換的原理,高效液相色譜檢測又可分為陽離子交換[10-11]、離子對[12]和陰離子交換[13]等不同方法。高效液相色譜檢測作為廣泛采用的方法,需要對樣品進行純化濃縮等前處理,有時還需要柱后衍生等步驟,而且流動相較為復(fù)雜,單個樣品的分析時間也較長,因此,并不適合進行大批量麥根酸類物質(zhì)的檢測。

    近年來,有學(xué)者以水稻為研究對象,發(fā)展了利用超高效液相色譜-質(zhì)譜對麥根酸類物質(zhì)進行定量檢測[14-15],該方法具有靈敏度高、無需濃縮純化等前處理步驟,具有高效、精確、快速的特點,可進行樣品的高通量檢測。筆者以普通小麥為研究對象,探索利用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)方法批量檢測小麥苗期DMA分泌率,旨在為小麥麥根酸分泌的遺傳規(guī)律和生理機制奠定方法基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    小麥材料為山東省審定小麥品種濟麥22、煙農(nóng)19、良星99、泰農(nóng)18和山農(nóng)22。脫氧麥根酸(DMA)標(biāo)準(zhǔn)品由加拿大TRC公司生產(chǎn)。

    1.2 小麥苗期缺鐵脅迫的營養(yǎng)液培養(yǎng)

    挑選每份材料籽粒飽滿的種子30粒,3次重復(fù)。種子經(jīng)1.5%次氯酸鈉消毒5 min 后,腹股溝朝下,均勻擺放至珍珠棉和紗網(wǎng)縫制的發(fā)芽盤,然后將其放入盛有1 L超純水的培養(yǎng)盒(15 mm×15 mm×20 mm)中,在人工智能溫室中發(fā)芽,光照16 h/8 h,光強12 000 lx,溫度25 ℃,3 d換水1次。

    種子發(fā)芽7 d后,仔細(xì)將種子從幼苗根部去除,加入培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。其中,對照處理營養(yǎng)液配方為0.7 mmol/L K2SO4、0.1 mmol/L KCl、2 mmol/L Ca(NO3)2、0.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、1 μmol/L H3BO4、0.5 μmol/L MnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、0.5 μmol/L ZnSO4、0.01 μmol/L(NH4)6Mo7O24、100 μmol/L FeEDTA。缺鐵脅迫營養(yǎng)液配方除無FeEDTA外,其余如對照處理。營養(yǎng)液3 d換1次,幼苗培養(yǎng)15 d后,進行麥根酸分泌的搜集。

    幼苗在營養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d后,挑選長相均勻粗壯的幼苗20株,超純水沖洗3次,08:00將其放入盛有500 mL超純水的燒杯中,進行麥根酸的搜集,搜集光強12 000 lx。搜集3 h后,將搜集液加入滅菌片處理5 min后,抽取50 mL存放至-40 ℃冰箱中作為待測液。根系則完整取下,烘干稱重。

    1.3 分泌的麥根酸質(zhì)譜檢測

    1.3.1 藥品和試劑。氨水(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);甲酸[色譜純,阿沙埃莎(天津)化學(xué)有限公司];甲醇、乙腈(色譜純,美國飛世爾科技公司)。

    1.3.2 儀器設(shè)備。

    超高效液相色譜系統(tǒng)(LC-30A,日本島津公司);三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(TripleQuad 4500),配帶電噴霧離子源(ESI)及Analyst工作站,美國AB SCIEX公司;氮吹儀(JNC N-EVAPTM112型,美國Organomation 公司);漩渦混合器(MS 3 型,德國IKA公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(Advantage A10型,美國Millipore 公司);電子天平(BSA224S-CW,賽多利斯公司);固相萃取裝置(24位,美國Supelco公司);Cleanert PCX 60 mg/3 mL Cartridge固相萃取小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司);Thermo Scientific Hypersil GOLD柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm,美國飛世爾科技公司)。

    1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件。

    色譜柱:Hypersil Gold 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫40 ℃,樣品室溫度4 ℃;進樣體積5.0 μL;流動相A為0.2 % 甲酸-水,流動相B為乙腈;流速為0.4 mL/min,梯度洗脫。

    離子源:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM);霧化氣(TEM)溫度:600 ℃;霧化氣壓力(GS1):60 psi;輔助加熱氣壓力(GS2):55 psi;氣簾氣壓力(CUR):25 psi;噴霧電壓(IS):5 500 V;碰撞氣體(CAD):7 psi;駐留時間100 ms。

    式中,X為樣品中待測物殘留量(μg/kg);m為樣品質(zhì)量(g);V為試樣最終定容體積(mL);C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線算出進樣液的濃度(μg/L)。

    1.3.5 樣品處理。取5.0 mL缺鐵營養(yǎng)液培養(yǎng)根系洗脫待測液稀釋1倍,用甲酸調(diào)pH為2.5~3.0,以備UPLC/ESI-MS測定。

    取20.0 mL正常營養(yǎng)液培養(yǎng)根系洗脫液,用甲酸調(diào) pH為2.5~3.0,待提純濃縮。步驟如下:PCX固相萃取柱依次使用3 mL 甲醇預(yù)洗活化,3 mL水平衡,加入酸化后的樣品溶液,然后用3 mL水、3 mL甲醇依次淋洗固相萃取柱,棄去淋洗液,用6 mL 2%氨化甲醇洗脫,收集洗脫液,40 ℃水浴下,氮氣吹至近干,超純水定容至1 mL,渦旋振蕩,過0.22 μm微孔濾膜,以備UPLC/ESI-MS測定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DMA分析方法的優(yōu)化

    2.1.1 固相萃取柱的選擇。試驗對C18固相萃取柱和PCX固相萃取柱的回收率進行了比較,前者的回收率低于10%,而后者的回收率在70%以上,這是因為麥根酸含有仲胺基,帶正電荷,易與陽離子交換柱的磺酸基產(chǎn)生靜電吸引作用而被吸附,最后通過堿性洗脫液中和叔胺基,降低離子交換作用而被洗脫出來。同時還發(fā)現(xiàn),提取液的酸化對回收率影響較大,固相萃取柱上樣前,應(yīng)調(diào)節(jié)樣品溶液pH為2.5~3.0。

    2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

    麥根酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示,它含有3個羧基,在水溶液中表現(xiàn)出弱酸性,易電離成負(fù)離子化合物,同時,它也含有叔胺基團。因此,麥根酸在酸性條件下呈現(xiàn)正電荷,在堿性條件下呈現(xiàn)負(fù)電荷。研究發(fā)現(xiàn),在ESI-和ESI+模式下,后者的響應(yīng)值明顯高于前者。在ESI+模式下,樣品具有離子化效率高、信號強的特點。因此,該試驗采用正離子模式。

    麥根酸的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜如圖2~3所示。一級質(zhì)譜圖中,分子離子峰為m/z 305.2。二級質(zhì)譜麥根酸片段離子主要是兩正離子m/z 133.9和m/z 286.8,因此,以這2個正離子作為定量分析的離子。標(biāo)準(zhǔn)品與小麥根系洗脫液的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜完全相同,表明小麥根系洗脫液中的分泌物確為DMA。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    配制5~200 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以進樣濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)、定量離子對的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得的相關(guān)線性方程Y=2 001.3X-18.4,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖4。

    2.3 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

    對空白水樣品在10、50、200 μg/kg 3個濃度水平上進行添加,每個平行重復(fù)5次,進行提取凈化,校正曲線定量。添加量、平均回收率和精密度見表1。結(jié)果表明,在添加量為10~200 μg/kg,平均回收率為77.2%~83.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.9%~15.0%。

    2.4 麥根酸化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定性

    常溫下,麥根酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,容易分解。因此,以標(biāo)準(zhǔn)品50、125和250 μg/L這3個濃度水平,在樣品室4 ℃條件下,考察在0、3、6和10 h的濃度變化。結(jié)果表明(表2),在不同濃度梯度條件下,試驗10 h后,每個濃度梯度均表現(xiàn)較好的化學(xué)穩(wěn)定性,其變異系數(shù)在0.89%~1.87%。因此,麥根酸在4 ℃條件下,可保持較好的化學(xué)穩(wěn)定性。

    2.5 普通小麥DMA分泌速率

    5個小麥品種在正常營養(yǎng)液和缺鐵營養(yǎng)液培養(yǎng),根據(jù)定量離子,經(jīng)公式計算根系洗脫液DMA的含量,結(jié)果見表3。在正常營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,DMA分泌速率較低,為0.008 11~0.081 50 μg/(g·株·h);但在缺鐵脅迫條件下,DMA分泌速率為50.80~5 121.14 μg/(g·株·h),增加倍數(shù)在6 242.86~62 833.42。就增加倍數(shù)而言,5個小麥品種從大到小依次為山農(nóng)22、良星99、泰農(nóng)18、煙農(nóng)19、濟麥22,表明在缺鐵脅迫下,山東省當(dāng)前大面積推廣品種均可以顯著誘導(dǎo)DMA的大量分泌,以應(yīng)對缺鐵脅迫逆境。

    3 討論與結(jié)論

    隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行單子葉禾本科作物的DMA測定,具有靈敏度高、簡單快速、重復(fù)性好等特點[14-15],特別適用于進行高通量DMA檢測。所不同的是,Kakei等[14]首先利用衍生劑芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)與DMA螯合進行柱前衍生,pH調(diào)至8.0時信號最強,m/z為752。李金輝等[15]利用HPLC-MS/MS進行尼克酰胺(NA)的分析,NA與DMA化學(xué)式相比,前者比后者多1個氨基,而少2個羥基。一級質(zhì)譜顯示分子離子峰為m/z 304.43,而該研究的分子離子峰為m/z 305.2,結(jié)果基本一致,推測可能是由于不同儀器的誤差所導(dǎo)致;二級質(zhì)譜正離子峰m/z 286.52和m/z 185.17,該研究結(jié)果則為m/z 286.8和m/z 133.9,推測作為定量的2個正離子,1個可能完全相同,另1個離子則不相同,可能的原因是NA和DMA化學(xué)結(jié)構(gòu)并不完全相同。總的來說,該研究的測定結(jié)果與李金輝等[15]的測定結(jié)果趨勢一致。因此,可用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進行大批量小麥麥根酸類物質(zhì)的分析測定。

    在對根系洗脫液DMA進行濃縮純化時,試驗表明,隨著添加量的增加,回收率呈增加趨勢,說明在正常營養(yǎng)液培養(yǎng)的條件下,小麥品種普通存在DMA分泌量較低的現(xiàn)象,進行濃縮純化可以提高試驗精度。在缺鐵脅迫的條件下,由于小麥植株感知缺鐵信號,在體內(nèi)大量合成分泌DMA,利用該方法,應(yīng)稀釋1~5倍后再進行試驗,可取得良好的效果。

    普通小麥根系DMA的合成與分泌,對植株生長發(fā)育所需的鐵營養(yǎng)具有重要意義。目前,已在普通小麥中分離了編碼314個氨基酸的DMA合成基因(TaDMAS1)[5],該基因不但在根系中表達,還在芽細(xì)胞中表達。Bonneau等[16]還鑒定了21個小麥NA合成基因,明確了這些基因在種子萌芽期、苗期和生殖生長期進行表達。通過小麥DMA分泌方法的建立,有助于開展小麥DMA合成、分泌和信號傳導(dǎo)等方面的研究。

    參考文獻

    [1] TAKAGI S I.Naturally occurring ironchelating compounds in oatand riceroot washings[J].Soil science & plant nutrition,1976,22(4):423-433.

    [2] RMHELD V,MLLER C,MARSCHNER H.Localization and capacity of proton pumps in roots of intact sunflower plants[J].Plant physiology,1984,76(3): 603-606.

    [3] KOBAYASHI T,NAKANISHI H,NISHIZAWA N K.Recent insights into iron homeostasis and their application in gra minaceous crops[J].Proceedings of the Japan academy,2010,86(9):900-913.

    [4] MORI S.Iron acquisition by plants[J].Current opinion plant biology,1999,2(3): 250-253.

    [5] KOBAYASHI T,NISHIZAWA N K,MORI S.Molecular analysis of irondeficient Gra minaceous plants[M]// BARTON L L,ABADIA J.Iron nutrition in plants and rhizospheric microorganisms.Netherlands:Springer Verlag,2006: 395-435.

    [6] UENO D,ROMBOL A D,IWASHITA T,et al.Identification of two novel phytosiderophores secreted by perennial grasses[J].New phytologist,2007,174(2): 304-310.

    [7] 于福同,張愛民,張福鎖.小麥植物鐵載體分泌基因的染色體定位[J].遺傳學(xué)報:英文版, 1999(5):552-557.

    [8] KAWAI S,TAKAGI S,SATO Y. Mugineic acidfamily phytosiderophores in rootsecretions of barley, corn, and sorghum varieties[J].Plant nutrition,1988,11:633-642.

    [9] TAKAGI S.Production of phytosiderophores[M]//BARTON L L,HEM MIN B C.Iron chelation in plants and soil microorganisms.New York:Academic Press,1993:111-131.

    [10] KAWAI S,SATO Y,TAKAGI S,et al.Separation and deter mination of mugineic acid and its analogues by highperformance liquid chromatography[J].Journal of chromatography,1987, 391(1):325-327.

    [11] MORI S,NISHIZAWA N,KAWAI S,et al.Dynamic state of mugineic acid and analogous phytosiderophores in Fedeficient barley[J].J Plant Nutrition,1987,10:1003-1011.

    [12] HIRADATE S,INOUE K.Deter mination of mugineic acid, 2deoxymugineic acid, 3hydroxymugineic acid, and their iron complexes by ionpair HPLC and colorimetric procedures[J]. Soil Sci Plant Nutrition,1996,42(3):659-665.

    [13] NEUMANN G,HAAKE C,RMHELD V.Improved HPLC method for deter mination of phytosiderophores in root washings and tissue extracts[J].Journal of plant nutrition,1999,22(9):1389-1402.

    [14] KAKEI Y,YAMAGUCHI I,KOBAYASHI T,et al.A highly sensitive, quick and simple quantification method for nicotiana mine and 2′deoxymugineic acid from minimum samples using LC/ESITOFMS achieves functional analysis of these components in plants[J].Plant & cell physiology, 2009,50(11):1988-1993.

    [15] 李金輝,蔣欣杭,吳世華.水稻尼克酰胺鐵載體的高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,25(1):8-13.

    [16] BONNEAU J,BAUMANN U,BEASLEY J,et al.Identification and molecular characterization of the nicotiana mine synthase gene family in bread wheat[J].Plant biotechnology journal,2016,14(12):2228-2239.

    亚洲人成77777在线视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 99热网站在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 一本大道久久a久久精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线观看免费视频网站a站| 午夜福利在线免费观看网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 少妇的丰满在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| av不卡在线播放| av线在线观看网站| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av男天堂| 久久青草综合色| 97精品久久久久久久久久精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 五月开心婷婷网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 9色porny在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 色播在线永久视频| 又大又黄又爽视频免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 曰老女人黄片| 午夜免费观看性视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| kizo精华| 国产高清国产精品国产三级| 日韩中文字幕视频在线看片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品人妻在线不人妻| 国产午夜精品一二区理论片| 高清不卡的av网站| 成人国语在线视频| av线在线观看网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99九九在线精品视频| 丁香六月欧美| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品一区二区精品视频观看| 在线观看国产h片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品国产色婷婷电影| av天堂久久9| 久久热在线av| 成人漫画全彩无遮挡| 我的亚洲天堂| 好男人视频免费观看在线| 九色亚洲精品在线播放| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品国产av蜜桃| 少妇精品久久久久久久| 满18在线观看网站| 欧美另类一区| 一区二区三区激情视频| 欧美人与善性xxx| 国产黄色免费在线视频| 91老司机精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 搡老岳熟女国产| 天天添夜夜摸| 大片电影免费在线观看免费| 国产亚洲av高清不卡| 精品人妻在线不人妻| 伊人亚洲综合成人网| √禁漫天堂资源中文www| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产男人的电影天堂91| 欧美国产精品va在线观看不卡| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲第一区二区三区不卡| 中国三级夫妇交换| a 毛片基地| 日韩一区二区视频免费看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产欧美网| www.自偷自拍.com| 久久国产精品大桥未久av| 国产麻豆69| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲成人av在线免费| 日本色播在线视频| 欧美中文综合在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲人成77777在线视频| 国产97色在线日韩免费| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美97在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 亚洲三区欧美一区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本av手机在线免费观看| 老司机靠b影院| 大香蕉久久网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美人与善性xxx| 在线观看免费午夜福利视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 91国产中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕制服av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 极品人妻少妇av视频| 国产精品久久久久成人av| 国产色婷婷99| 伊人亚洲综合成人网| 久久影院123| 国产成人欧美| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品人妻久久久影院| 日本欧美国产在线视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av福利一区| 日韩 亚洲 欧美在线| 大片电影免费在线观看免费| 美国免费a级毛片| 一级毛片 在线播放| 一区二区av电影网| 国产国语露脸激情在线看| xxx大片免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产99久久九九免费精品| 人妻一区二区av| 18禁国产床啪视频网站| 午夜福利一区二区在线看| 伦理电影免费视频| 国产精品一国产av| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 不卡av一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| 少妇 在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品酒店卫生间| 18在线观看网站| 七月丁香在线播放| 黄色怎么调成土黄色| 老司机在亚洲福利影院| 日本91视频免费播放| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品免费大片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品欧美亚洲77777| 热re99久久精品国产66热6| 看十八女毛片水多多多| 激情五月婷婷亚洲| 自线自在国产av| 永久免费av网站大全| 在线观看国产h片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲av国产av综合av卡| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一区二区三区精品91| 在线观看免费高清a一片| 青春草视频在线免费观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲欧美成人精品一区二区| 大码成人一级视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 18在线观看网站| 热re99久久国产66热| 精品一区二区三卡| 亚洲国产av新网站| 国产乱来视频区| 午夜福利在线免费观看网站| 青青草视频在线视频观看| 激情视频va一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品乱久久久久久| 99热网站在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 无限看片的www在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品国产露脸久久av麻豆| 一级毛片 在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 我的亚洲天堂| 丝瓜视频免费看黄片| 黄色视频不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 飞空精品影院首页| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品人妻久久久影院| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产免费又黄又爽又色| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 激情视频va一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 精品国产一区二区久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品久久久久久电影网| 一区二区三区精品91| av卡一久久| 男人添女人高潮全过程视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 精品亚洲成国产av| 日韩视频在线欧美| 精品久久久精品久久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品一区二区三区av网在线观看 | 一级a爱视频在线免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 一级a爱视频在线免费观看| 国产色婷婷99| 久久99一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 色视频在线一区二区三区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| videosex国产| 成人国产av品久久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费少妇av软件| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产免费视频播放在线视频| 欧美日韩精品网址| 日韩一区二区三区影片| 黄色 视频免费看| 99久久综合免费| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久狼人影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美中文综合在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 精品酒店卫生间| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲免费av在线视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久婷婷青草| 国产黄色免费在线视频| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品酒店卫生间| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲国产精品国产精品| 波野结衣二区三区在线| 少妇的丰满在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 在线观看一区二区三区激情| 国产av精品麻豆| 黄片无遮挡物在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 看免费av毛片| 最近手机中文字幕大全| 乱人伦中国视频| 免费高清在线观看日韩| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线观看一区二区三区激情| 男女边摸边吃奶| 高清不卡的av网站| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美人与善性xxx| 在线观看www视频免费| 美女午夜性视频免费| 女性生殖器流出的白浆| 制服诱惑二区| 久久青草综合色| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中国国产av一级| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产男女内射视频| 久久久精品区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 在线精品无人区一区二区三| 国产麻豆69| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品亚洲av一区麻豆 | 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲av在线观看美女高潮| 一区二区三区精品91| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品福利永久在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美精品一区二区大全| 欧美日韩精品网址| 久久久亚洲精品成人影院| 老司机深夜福利视频在线观看 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人漫画全彩无遮挡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一级毛片电影观看| 热99久久久久精品小说推荐| 丰满乱子伦码专区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 伦理电影免费视频| 18禁国产床啪视频网站| 久久热在线av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 搡老乐熟女国产| 国产av一区二区精品久久| 日韩av免费高清视频| av在线app专区| 成人国产麻豆网| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久人人97超碰香蕉20202| 中文欧美无线码| 欧美日韩精品网址| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲成色77777| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久亚洲国产成人精品v| 国产人伦9x9x在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 多毛熟女@视频| 国产淫语在线视频| 精品久久蜜臀av无| 欧美97在线视频| 操美女的视频在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲国产av影院在线观看| 999久久久国产精品视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久精品久久久久真实原创| 日日啪夜夜爽| 中国三级夫妇交换| 精品国产一区二区三区四区第35| 午夜激情久久久久久久| h视频一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 蜜桃在线观看..| 免费av中文字幕在线| 国产av一区二区精品久久| 久久久精品94久久精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 我的亚洲天堂| 亚洲中文av在线| 久久韩国三级中文字幕| 精品国产露脸久久av麻豆| 婷婷色综合www| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 最近手机中文字幕大全| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 不卡av一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品一二三区在线看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人影院久久| a级片在线免费高清观看视频| 国产片内射在线| 久久天堂一区二区三区四区| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品人人爽人人爽视色| 一本大道久久a久久精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 老司机在亚洲福利影院| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 天天影视国产精品| 在线 av 中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| av卡一久久| 一个人免费看片子| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av女优亚洲男人天堂| 国产高清不卡午夜福利| 综合色丁香网| 青春草视频在线免费观看| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品在线美女| 母亲3免费完整高清在线观看| 色播在线永久视频| 久久av网站| www.精华液| 久久久国产欧美日韩av| 最黄视频免费看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 精品免费久久久久久久清纯 | 色吧在线观看| 一级爰片在线观看| 高清av免费在线| 国产精品国产av在线观看| svipshipincom国产片| kizo精华| 久久99热这里只频精品6学生| 国产在线视频一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久精品性色| 日韩一本色道免费dvd| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩制服骚丝袜av| 国产淫语在线视频| 综合色丁香网| 国产精品av久久久久免费| 五月天丁香电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲,欧美精品.| 看免费av毛片| 香蕉丝袜av| a级毛片黄视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲欧美激情在线| 麻豆av在线久日| 亚洲熟女毛片儿| 99精品久久久久人妻精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久国产一区二区| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 尾随美女入室| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文天堂在线官网| 丝袜在线中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 青青草视频在线视频观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美人与性动交α欧美软件| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜精品国产一区二区电影| 中文字幕色久视频| kizo精华| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美精品av麻豆av| 亚洲中文av在线| 在现免费观看毛片| 香蕉国产在线看| 亚洲伊人色综图| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美激情 高清一区二区三区| 热99久久久久精品小说推荐| 人人妻人人澡人人看| 丝瓜视频免费看黄片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲,欧美,日韩| 国产1区2区3区精品| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品在线美女| 日韩大片免费观看网站| 熟女av电影| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久免费观看电影| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本wwww免费看| 精品视频人人做人人爽| 啦啦啦在线免费观看视频4| 最近中文字幕2019免费版| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美黑人精品巨大| 一区二区三区四区激情视频| 国产成人精品无人区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人免费观看mmmm| a级片在线免费高清观看视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日本黄色日本黄色录像| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人手机av| 丝袜喷水一区| 综合色丁香网| 大话2 男鬼变身卡| 如何舔出高潮| 国产精品免费大片| 久久久久久久久久久免费av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 少妇人妻 视频| av视频免费观看在线观看| 久久97久久精品| 男女下面插进去视频免费观看| 丝袜在线中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 国产一区二区三区综合在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜av观看不卡| 午夜影院在线不卡| 亚洲国产精品一区三区| 99国产综合亚洲精品| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲av男天堂| 亚洲男人天堂网一区| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产福利在线免费观看视频| 婷婷成人精品国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| svipshipincom国产片| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品国产av在线观看| 久久青草综合色| 欧美精品一区二区大全| 丝瓜视频免费看黄片| 高清av免费在线| 国产欧美亚洲国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久这里只有精品19| 国产精品久久久人人做人人爽| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 波野结衣二区三区在线| 国产亚洲一区二区精品| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av日韩在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 大陆偷拍与自拍| 亚洲成人一二三区av| 高清av免费在线| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 99re6热这里在线精品视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人午夜精彩视频在线观看| av电影中文网址| 69精品国产乱码久久久| 久久婷婷青草| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲精品,欧美精品| 欧美在线黄色| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 中文字幕最新亚洲高清| 国产免费福利视频在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 丰满迷人的少妇在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 成人亚洲精品一区在线观看| 秋霞在线观看毛片| 国产麻豆69| 国产精品二区激情视频| 国产 精品1| 色吧在线观看| www.av在线官网国产| 丝袜脚勾引网站| 亚洲免费av在线视频| 岛国毛片在线播放| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 操美女的视频在线观看|