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    超高效液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)優(yōu)化方法檢測(cè)小麥脫氧麥根酸

    2018-05-14 08:59:49樊慶琦崔德周郭鋼
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年20期

    樊慶琦 崔德周 郭鋼

    摘要 [目的]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)優(yōu)化方法檢測(cè)小麥脫氧麥根酸(DMA)。[方法]以山東省5個(gè)小麥品種為研究對(duì)象,利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/ESI-MS)檢測(cè)小麥苗期根系洗脫液的DMA。[結(jié)果]一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰m/z 305.2,二級(jí)質(zhì)譜以正離子m/z 286.8和m/z 133.9進(jìn)行定量,DMA標(biāo)準(zhǔn)品與小麥根系洗脫液的質(zhì)譜圖完全一致,因此,該方法可適用于大批量檢測(cè)普通小麥根系洗脫液DMA。5個(gè)小麥品種在正常培養(yǎng)下,DMA分泌速率較低,但在缺鐵脅迫下,DMA分泌速率呈極顯著升高,增加6 242.86~62 833.42倍。[結(jié)論]小麥脫氧麥根酸UPLC/ESI-MS檢測(cè)方法的建立,為深入研究其遺傳機(jī)理提供了方法基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞 小麥;脫氧麥根酸;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

    中圖分類(lèi)號(hào) S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2018)20-0155-04

    Abstract [Objective] The research aimed to detect wheat deoxyger minic acid(DMA) by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLCMS/MS) serial optimization method.[Method]Five wheat varieties from Shandong Province were selected to study the DMA of root eluent in wheat seedling stage by UPLC/ESIMS.[Result] The first class mass spectrometry ion peak was m/z 305.2 and the second class mass spectrometry was quantified by positive ions m/z 286.8 and m/z 133.9. The standard product was identical with mass spectrum of wheat root eluent. Therefore, this method could be applied to mass detection of DMA in root eluent of common wheat. The DMA secretion rate of the five varieties was low under control treatment, but increased significantly under iron deficiency, which increased by 6 242.86-62 833.42 times. [Conclusion]The establishment of UPLC/ESIMS method for DMA detection in wheat provides a basis for the further study of its genetic mechanism.

    Key words Wheat;Deoxygerminic acid(DMA);UPLC/ESIMS

    包括小麥在內(nèi)的禾本科單子葉植物,根系能夠合成麥根酸類(lèi)物質(zhì)(即植物鐵載體,簡(jiǎn)稱(chēng)PS)并分泌至根系周?chē)嫌坞x態(tài)的Fe3+,并經(jīng)根系轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)滿(mǎn)足生長(zhǎng)發(fā)育必需的鐵營(yíng)養(yǎng)[1-2]。目前已明確,麥根酸類(lèi)物質(zhì)具有多種形式,L-甲硫氨酸作為合成前體,與ATP一起形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),3個(gè)分子的S-腺苷甲硫氨酸在尼克煙酰胺合成酶(NAs)催化下合成1個(gè)分子的尼克煙酰胺(NA),尼克煙酰胺在煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)等酶的催化作用下,形成脫氧麥根酸(DMA),進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為麥根酸(MA)、阿凡酸(AVA)、羥基麥根酸(HMA)、3-表羥基麥根酸(epi-HMA)、3-表羥基脫氧麥根酸(epi-HDMA)等麥根酸類(lèi)植物鐵載體[3]。普通小麥主要以DMA為主[4-6]。

    對(duì)于麥根酸類(lèi)物質(zhì)的定量檢測(cè),眾多學(xué)者開(kāi)展了大量的研究,提出了不同的檢測(cè)方法。一類(lèi)是根據(jù)麥根酸類(lèi)物質(zhì)與鐵螯合的特性,通過(guò)比色法間接測(cè)量鐵的活化量,經(jīng)換算后得出PS的分泌率[7];另一類(lèi)是通過(guò)紙層析法[1,8-9]和高效液相色譜熒光方法等[10-13]。根據(jù)離子交換的原理,高效液相色譜檢測(cè)又可分為陽(yáng)離子交換[10-11]、離子對(duì)[12]和陰離子交換[13]等不同方法。高效液相色譜檢測(cè)作為廣泛采用的方法,需要對(duì)樣品進(jìn)行純化濃縮等前處理,有時(shí)還需要柱后衍生等步驟,而且流動(dòng)相較為復(fù)雜,單個(gè)樣品的分析時(shí)間也較長(zhǎng),因此,并不適合進(jìn)行大批量麥根酸類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)。

    近年來(lái),有學(xué)者以水稻為研究對(duì)象,發(fā)展了利用超高效液相色譜-質(zhì)譜對(duì)麥根酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)[14-15],該方法具有靈敏度高、無(wú)需濃縮純化等前處理步驟,具有高效、精確、快速的特點(diǎn),可進(jìn)行樣品的高通量檢測(cè)。筆者以普通小麥為研究對(duì)象,探索利用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)方法批量檢測(cè)小麥苗期DMA分泌率,旨在為小麥麥根酸分泌的遺傳規(guī)律和生理機(jī)制奠定方法基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    小麥材料為山東省審定小麥品種濟(jì)麥22、煙農(nóng)19、良星99、泰農(nóng)18和山農(nóng)22。脫氧麥根酸(DMA)標(biāo)準(zhǔn)品由加拿大TRC公司生產(chǎn)。

    1.2 小麥苗期缺鐵脅迫的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)

    挑選每份材料籽粒飽滿(mǎn)的種子30粒,3次重復(fù)。種子經(jīng)1.5%次氯酸鈉消毒5 min 后,腹股溝朝下,均勻擺放至珍珠棉和紗網(wǎng)縫制的發(fā)芽盤(pán),然后將其放入盛有1 L超純水的培養(yǎng)盒(15 mm×15 mm×20 mm)中,在人工智能溫室中發(fā)芽,光照16 h/8 h,光強(qiáng)12 000 lx,溫度25 ℃,3 d換水1次。

    種子發(fā)芽7 d后,仔細(xì)將種子從幼苗根部去除,加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。其中,對(duì)照處理營(yíng)養(yǎng)液配方為0.7 mmol/L K2SO4、0.1 mmol/L KCl、2 mmol/L Ca(NO3)2、0.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、1 μmol/L H3BO4、0.5 μmol/L MnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、0.5 μmol/L ZnSO4、0.01 μmol/L(NH4)6Mo7O24、100 μmol/L FeEDTA。缺鐵脅迫營(yíng)養(yǎng)液配方除無(wú)FeEDTA外,其余如對(duì)照處理。營(yíng)養(yǎng)液3 d換1次,幼苗培養(yǎng)15 d后,進(jìn)行麥根酸分泌的搜集。

    幼苗在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d后,挑選長(zhǎng)相均勻粗壯的幼苗20株,超純水沖洗3次,08:00將其放入盛有500 mL超純水的燒杯中,進(jìn)行麥根酸的搜集,搜集光強(qiáng)12 000 lx。搜集3 h后,將搜集液加入滅菌片處理5 min后,抽取50 mL存放至-40 ℃冰箱中作為待測(cè)液。根系則完整取下,烘干稱(chēng)重。

    1.3 分泌的麥根酸質(zhì)譜檢測(cè)

    1.3.1 藥品和試劑。氨水(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲酸[色譜純,阿沙埃莎(天津)化學(xué)有限公司];甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)飛世爾科技公司)。

    1.3.2 儀器設(shè)備。

    超高效液相色譜系統(tǒng)(LC-30A,日本島津公司);三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(TripleQuad 4500),配帶電噴霧離子源(ESI)及Analyst工作站,美國(guó)AB SCIEX公司;氮吹儀(JNC N-EVAPTM112型,美國(guó)Organomation 公司);漩渦混合器(MS 3 型,德國(guó)IKA公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(Advantage A10型,美國(guó)Millipore 公司);電子天平(BSA224S-CW,賽多利斯公司);固相萃取裝置(24位,美國(guó)Supelco公司);Cleanert PCX 60 mg/3 mL Cartridge固相萃取小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司);Thermo Scientific Hypersil GOLD柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm,美國(guó)飛世爾科技公司)。

    1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件。

    色譜柱:Hypersil Gold 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫40 ℃,樣品室溫度4 ℃;進(jìn)樣體積5.0 μL;流動(dòng)相A為0.2 % 甲酸-水,流動(dòng)相B為乙腈;流速為0.4 mL/min,梯度洗脫。

    離子源:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM);霧化氣(TEM)溫度:600 ℃;霧化氣壓力(GS1):60 psi;輔助加熱氣壓力(GS2):55 psi;氣簾氣壓力(CUR):25 psi;噴霧電壓(IS):5 500 V;碰撞氣體(CAD):7 psi;駐留時(shí)間100 ms。

    式中,X為樣品中待測(cè)物殘留量(μg/kg);m為樣品質(zhì)量(g);V為試樣最終定容體積(mL);C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)算出進(jìn)樣液的濃度(μg/L)。

    1.3.5 樣品處理。取5.0 mL缺鐵營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)根系洗脫待測(cè)液稀釋1倍,用甲酸調(diào)pH為2.5~3.0,以備UPLC/ESI-MS測(cè)定。

    取20.0 mL正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)根系洗脫液,用甲酸調(diào) pH為2.5~3.0,待提純濃縮。步驟如下:PCX固相萃取柱依次使用3 mL 甲醇預(yù)洗活化,3 mL水平衡,加入酸化后的樣品溶液,然后用3 mL水、3 mL甲醇依次淋洗固相萃取柱,棄去淋洗液,用6 mL 2%氨化甲醇洗脫,收集洗脫液,40 ℃水浴下,氮?dú)獯抵两?,超純水定容? mL,渦旋振蕩,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,以備UPLC/ESI-MS測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DMA分析方法的優(yōu)化

    2.1.1 固相萃取柱的選擇。試驗(yàn)對(duì)C18固相萃取柱和PCX固相萃取柱的回收率進(jìn)行了比較,前者的回收率低于10%,而后者的回收率在70%以上,這是因?yàn)辂湼岷兄侔坊?,帶正電荷,易與陽(yáng)離子交換柱的磺酸基產(chǎn)生靜電吸引作用而被吸附,最后通過(guò)堿性洗脫液中和叔胺基,降低離子交換作用而被洗脫出來(lái)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),提取液的酸化對(duì)回收率影響較大,固相萃取柱上樣前,應(yīng)調(diào)節(jié)樣品溶液pH為2.5~3.0。

    2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

    麥根酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示,它含有3個(gè)羧基,在水溶液中表現(xiàn)出弱酸性,易電離成負(fù)離子化合物,同時(shí),它也含有叔胺基團(tuán)。因此,麥根酸在酸性條件下呈現(xiàn)正電荷,在堿性條件下呈現(xiàn)負(fù)電荷。研究發(fā)現(xiàn),在ESI-和ESI+模式下,后者的響應(yīng)值明顯高于前者。在ESI+模式下,樣品具有離子化效率高、信號(hào)強(qiáng)的特點(diǎn)。因此,該試驗(yàn)采用正離子模式。

    麥根酸的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜如圖2~3所示。一級(jí)質(zhì)譜圖中,分子離子峰為m/z 305.2。二級(jí)質(zhì)譜麥根酸片段離子主要是兩正離子m/z 133.9和m/z 286.8,因此,以這2個(gè)正離子作為定量分析的離子。標(biāo)準(zhǔn)品與小麥根系洗脫液的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜完全相同,表明小麥根系洗脫液中的分泌物確為DMA。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    配制5~200 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以進(jìn)樣濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)、定量離子對(duì)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),獲得的相關(guān)線(xiàn)性方程Y=2 001.3X-18.4,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖4。

    2.3 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

    對(duì)空白水樣品在10、50、200 μg/kg 3個(gè)濃度水平上進(jìn)行添加,每個(gè)平行重復(fù)5次,進(jìn)行提取凈化,校正曲線(xiàn)定量。添加量、平均回收率和精密度見(jiàn)表1。結(jié)果表明,在添加量為10~200 μg/kg,平均回收率為77.2%~83.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.9%~15.0%。

    2.4 麥根酸化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定性

    常溫下,麥根酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,容易分解。因此,以標(biāo)準(zhǔn)品50、125和250 μg/L這3個(gè)濃度水平,在樣品室4 ℃條件下,考察在0、3、6和10 h的濃度變化。結(jié)果表明(表2),在不同濃度梯度條件下,試驗(yàn)10 h后,每個(gè)濃度梯度均表現(xiàn)較好的化學(xué)穩(wěn)定性,其變異系數(shù)在0.89%~1.87%。因此,麥根酸在4 ℃條件下,可保持較好的化學(xué)穩(wěn)定性。

    2.5 普通小麥DMA分泌速率

    5個(gè)小麥品種在正常營(yíng)養(yǎng)液和缺鐵營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng),根據(jù)定量離子,經(jīng)公式計(jì)算根系洗脫液DMA的含量,結(jié)果見(jiàn)表3。在正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,DMA分泌速率較低,為0.008 11~0.081 50 μg/(g·株·h);但在缺鐵脅迫條件下,DMA分泌速率為50.80~5 121.14 μg/(g·株·h),增加倍數(shù)在6 242.86~62 833.42。就增加倍數(shù)而言,5個(gè)小麥品種從大到小依次為山農(nóng)22、良星99、泰農(nóng)18、煙農(nóng)19、濟(jì)麥22,表明在缺鐵脅迫下,山東省當(dāng)前大面積推廣品種均可以顯著誘導(dǎo)DMA的大量分泌,以應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫逆境。

    3 討論與結(jié)論

    隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行單子葉禾本科作物的DMA測(cè)定,具有靈敏度高、簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好等特點(diǎn)[14-15],特別適用于進(jìn)行高通量DMA檢測(cè)。所不同的是,Kakei等[14]首先利用衍生劑芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)與DMA螯合進(jìn)行柱前衍生,pH調(diào)至8.0時(shí)信號(hào)最強(qiáng),m/z為752。李金輝等[15]利用HPLC-MS/MS進(jìn)行尼克酰胺(NA)的分析,NA與DMA化學(xué)式相比,前者比后者多1個(gè)氨基,而少2個(gè)羥基。一級(jí)質(zhì)譜顯示分子離子峰為m/z 304.43,而該研究的分子離子峰為m/z 305.2,結(jié)果基本一致,推測(cè)可能是由于不同儀器的誤差所導(dǎo)致;二級(jí)質(zhì)譜正離子峰m/z 286.52和m/z 185.17,該研究結(jié)果則為m/z 286.8和m/z 133.9,推測(cè)作為定量的2個(gè)正離子,1個(gè)可能完全相同,另1個(gè)離子則不相同,可能的原因是NA和DMA化學(xué)結(jié)構(gòu)并不完全相同??偟膩?lái)說(shuō),該研究的測(cè)定結(jié)果與李金輝等[15]的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致。因此,可用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行大批量小麥麥根酸類(lèi)物質(zhì)的分析測(cè)定。

    在對(duì)根系洗脫液DMA進(jìn)行濃縮純化時(shí),試驗(yàn)表明,隨著添加量的增加,回收率呈增加趨勢(shì),說(shuō)明在正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的條件下,小麥品種普通存在DMA分泌量較低的現(xiàn)象,進(jìn)行濃縮純化可以提高試驗(yàn)精度。在缺鐵脅迫的條件下,由于小麥植株感知缺鐵信號(hào),在體內(nèi)大量合成分泌DMA,利用該方法,應(yīng)稀釋1~5倍后再進(jìn)行試驗(yàn),可取得良好的效果。

    普通小麥根系DMA的合成與分泌,對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育所需的鐵營(yíng)養(yǎng)具有重要意義。目前,已在普通小麥中分離了編碼314個(gè)氨基酸的DMA合成基因(TaDMAS1)[5],該基因不但在根系中表達(dá),還在芽細(xì)胞中表達(dá)。Bonneau等[16]還鑒定了21個(gè)小麥NA合成基因,明確了這些基因在種子萌芽期、苗期和生殖生長(zhǎng)期進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)小麥DMA分泌方法的建立,有助于開(kāi)展小麥DMA合成、分泌和信號(hào)傳導(dǎo)等方面的研究。

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