義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)的跨種擴(kuò)增

劉盼 陳雅琴 邵晨

摘要 [目的]篩選具有多態(tài)性的義烏小鯢（Hynobius yiwuensis）微衛(wèi)星位點(diǎn)。[方法]采用跨種擴(kuò)增的方法從安吉小鯢 （H.amjiensis） 和中國小鯢 （H.chinensis） 的113個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選具有多態(tài)性的義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)。[結(jié)果]篩選出11個(gè)具有多態(tài)性的義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)。這些多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～6個(gè) （平均3.55），觀察雜合度為0.200～1.000 （平均0.510），期望雜合度為0.500～0.732 （平均0.662），多態(tài)信息含量為0.375～0.737 （平均0.588）。[結(jié)論]篩選得到的具有多態(tài)性的11個(gè)義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)可應(yīng)用于其種群遺傳學(xué)和保護(hù)遺傳學(xué)的研究。

關(guān)鍵詞 義烏小鯢；微衛(wèi)星；跨種擴(kuò)增；多態(tài)性

中圖分類號(hào) Q959.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）20-0083-03

Abstract [Objective]To screen the polymorphic microsatellite loci of Hynobius yiwuensis.[Method]Polymorphic microsatellite loci of H.yiwuensis were developed from 113 microsatellite loci from H.amjiensis and H.chinensis using crossspecies amplification.[Result]11 polymorphic microsatellite loci of H.yiwuensis were developed.The number of alleles， observed and expected heterozygosities and polymorphic information content of these polymorphic loci were ranged from 2 to 6 with an average of 3.55 alleles per locus， 0.200 to 1.000 （average 0.510）， 0.500 to 0.732 （average 0.662） and 0.375 to 0.737（average 0.588），respectively.[Conclusion]These 11 polymorphic microsatellite loci of H.yiwuensis can be used in population genetic and conservation genetic researches.

Key words Hynobius yiwuensis；Microsatellite；Crossspecies amplification；Polymorphism

微衛(wèi)星 （microsatellite） 又稱簡單重復(fù)序列 （simple sequence repeat，SSR） 或短串聯(lián)重復(fù)序列 （short tandem repeats， STRs），是廣泛存在于真核生物基因組中的一種特殊序列，主要由1～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)單元組成[1]。由于微衛(wèi)星具有高度的多態(tài)性、呈共顯性標(biāo)記、選擇中性及相對(duì)較高的突變速率等特征，而被廣泛應(yīng)用于物種種群遺傳結(jié)構(gòu)[2]、基因流及進(jìn)化史分析，物種分類和親緣關(guān)系鑒定和種群數(shù)量調(diào)查等[3]方面。

義烏小鯢[4]（Hynobius yiwuensis）隸屬于兩棲綱（Amphibia）、有尾目（Caudata）、小鯢科（Hynobiidae）、小鯢屬（Hynobius），是我國特有種。目前該鯢僅分布于浙江地區(qū)（舟山、鎮(zhèn)海、蕭山、義烏、溫嶺、江山）海拔100～200 m植被較繁茂的丘陵山區(qū)[5]。近年來，適宜于義烏小鯢棲息的生境不斷喪失或被破壞，導(dǎo)致義烏小鯢種群數(shù)量急劇下降，其被國際自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名錄（IUCN Red List）[6]和中國脊椎動(dòng)物紅色名錄[7]列為易危等級(jí)。當(dāng)前對(duì)義烏小鯢的研究多集中于對(duì)物種分類地位[4]、組織學(xué)[8]和基本遺傳學(xué)[9-10]的探討，在物種遺傳多樣性、物種種群的遺傳結(jié)構(gòu)以及基因流等種群遺傳學(xué)方面的研究鮮見報(bào)道。為保護(hù)該物種，同時(shí)為發(fā)掘該物種的遺傳資源，并為后續(xù)物種遺傳現(xiàn)狀的評(píng)估提供重要的技術(shù)方法支持，筆者擬通過采用跨種擴(kuò)增的方法，從安吉小鯢 （H.amjiensis） 和中國小鯢 （H.chinensis） 已有微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出具有多態(tài)性的義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)，以期通過這些位點(diǎn)很好地反映義烏小鯢的種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、有效種群大小以及基因流等保護(hù)遺傳學(xué)和種群遺傳學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2015年1月在浙江舟山島不同樣點(diǎn)不同卵帶中分別采集2～3枚義烏小鯢卵粒樣本，共采集到30個(gè)卵帶中的76枚卵粒。將采集到的卵粒保存在盛有無水乙醇的離心管中，并將其余的卵粒原地放回，將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室用于DNA提取。

1.2 基因組DNA的提取

取30個(gè)不同卵帶中的卵粒各1枚，用無菌水清洗3～4次后剪碎，再用經(jīng)典的Sambrook[11]基因組DNA提取方法從卵粒中提取基因組DNA。

1.3 微衛(wèi)星備擇位點(diǎn)的選取

通常，跨種擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)選取自與目標(biāo)研究物種親緣關(guān)系較近的物種。在該研究中，100個(gè)安吉小鯢（H.amjiensis）微衛(wèi)星位點(diǎn)（未發(fā)表）和13個(gè)中國小鯢（H.chinensis）微衛(wèi)星位點(diǎn)（NCBI上已發(fā)表）被用于義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)的開發(fā)中。

1.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)

為避免由于等位基因丟失所造成的無效PCR擴(kuò)增，該研究以義烏小鯢8個(gè)基因組DNA為混合模板，對(duì)上述113個(gè)備擇位點(diǎn)進(jìn)行溫度梯度（48～62 ℃）和Mg2+濃度梯度（1.5、2.0、2.5 mmol/L）的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：10 × PCR buffer 2 μL； Mg2+ （25 mmol/L）3個(gè)梯度分別為1.2、1.6和2.0 μL； dNTP （ 2.5 mmol/L） 1.6 μL； 上游和下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL； 模板DNA 0.8 μL； rTaq （5 U/μL） 0.16 μL； 雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將得到單一條帶的位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢驗(yàn)。以30個(gè)不同卵帶的義烏小鯢卵?；蚪MDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上，僅改變退火溫度為上述位點(diǎn)初篩時(shí)所得到單一條帶時(shí)確定的溫度。PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)銀染[11]等過程進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 等位基因有效性再確認(rèn)

將經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)后含多態(tài)性的位點(diǎn)合成具有熒光標(biāo)記的上游引物（FAM和HEX修飾），PCR擴(kuò)增具有特定等位基因片段的個(gè)體，經(jīng)SSR分型和測(cè)序確認(rèn)微衛(wèi)星等位基因的有效性、片段大小以及各等位基因的序列組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

試驗(yàn)提取的30個(gè)義烏小鯢卵?；蚪MDNA經(jīng)NanoDrop （Thermo Scientific Inc.）檢測(cè)其濃度為122.7～248.5 ng/μL，OD260/280介于1.8～1.9，表明DNA的濃度和純度均較好。

2.2 微衛(wèi)星引物篩選結(jié)果

在備選的113對(duì)近緣物種的引物中，有52對(duì)引物得到了單一、穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶，占據(jù)總數(shù)的46.0%。來自安吉小鯢的100對(duì)引物中共有50對(duì)引物可以進(jìn)行穩(wěn)定的特異性擴(kuò)增，約占總數(shù)的50.0%；來自中國小鯢的13對(duì)引物中，僅有2對(duì)可以進(jìn)行特異性的穩(wěn)定擴(kuò)增，約占總數(shù)的15.4%，較安吉小鯢來說，比例較低。而其余的61個(gè)位點(diǎn)中，有11個(gè)位點(diǎn)（9.7%）出現(xiàn)了非特異性的擴(kuò)增，50個(gè)位點(diǎn)（44.2%）顯示并無具體的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果如下（圖1）。

2.3 具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選結(jié)果

在上述可獲得單一、穩(wěn)定擴(kuò)增條帶的52個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和微衛(wèi)星分型及測(cè)序，共獲得具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)11個(gè)，占總數(shù)的21.2%（表1）。圖2為引物Hyyi70的STR掃描測(cè)序結(jié)果。

3 討論

利用微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端相對(duì)保守的側(cè)翼序列來進(jìn)行跨物種微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選是開發(fā)物種特異微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法之一。該方法由于具有開發(fā)時(shí)間短、花費(fèi)相對(duì)較少、成功率高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于脊椎動(dòng)物各類群和昆蟲的研究中。如董穎等[12]通過跨種擴(kuò)增在赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelussp）中成功篩選到12個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)；黃族豪等[13]利用家雞（Gallus gallus）的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)灰胸竹雞（Bambusicola thoracica）進(jìn)行跨種擴(kuò)增， 最終得到10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)；利用大鼠（Rattus norvegicus）和小鼠（Mus musculus）已知的微衛(wèi)星位點(diǎn)在黃毛鼠（R.lossea Swinhoe）中篩選到8個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)[14]；而已知的21個(gè)中華鱉（Trionyx sinensis）的微衛(wèi)星位點(diǎn)則可用于8個(gè)近緣物種的跨物種擴(kuò)增[15]；此外，陳東海等[16]和Kim等[17]分別在兩棲動(dòng)物虎紋蛙 （Hoplobatrachus chinensis） 和昆蟲小紅蜻蜓 （Nannophya pygmaea） 中通過跨種擴(kuò)增獲得了物種特異的微衛(wèi)星位點(diǎn)。該研究通過利用113個(gè)安吉小鯢和中國小鯢的微衛(wèi)星位點(diǎn)成功篩選得到11個(gè)具有多態(tài)性的義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)，這也再次證明了跨物種篩選是獲取物種特異微衛(wèi)星位點(diǎn)的重要方法。

然而，對(duì)于不同的目標(biāo)物種，其跨種擴(kuò)增的成功率卻有顯著差異。如在哺乳動(dòng)物中，其微衛(wèi)星位點(diǎn)的跨種擴(kuò)增成功率為56%左右[18]；在鳥類的微衛(wèi)星跨種擴(kuò)增研究中其成功率約為91%[19]；而在蛙類中其成功率僅為11%～29%[20]。導(dǎo)致不同類群微衛(wèi)星位點(diǎn)跨種擴(kuò)增成功率相差較大的原因可能是：①不同類群物種的基因組大小相差較大，兩棲動(dòng)物的基因組大小約是哺乳類的2倍，鳥類的4倍。物種的基因組越大，其基因序列相似性的概率越低，其跨種擴(kuò)增的成功率就越低。因此，不同類群物種進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的跨物種擴(kuò)增其成功率相差較大。此前也有研究指出物種在進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的跨種PCR擴(kuò)增時(shí)，其成功率與物種的基因組大小呈負(fù)相關(guān)[21]。②不同研究中備擇微衛(wèi)星位點(diǎn)的來源物種與目標(biāo)研究物種之間的親緣關(guān)系不同。親緣關(guān)系越近，其基因序列組成越相似，序列越保守，跨種擴(kuò)增的成功率也將越高。劉羅等[22]用烏龜（Mauremys reevesii）的微衛(wèi)星位點(diǎn)分別對(duì)來自于同科和不同科的7個(gè)物種進(jìn)行跨種擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與烏龜同科物種的跨種擴(kuò)增成功率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同科物種的擴(kuò)增成功率；而選用異齒裂腹魚（Schizothorax oconnori）的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)來自于同屬和不同屬的5個(gè)物種進(jìn)行跨種擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)同屬之間的跨種擴(kuò)增成功率要高于不同屬之間的物種[23]。以較近親緣關(guān)系物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)為目標(biāo)物種的備擇位點(diǎn)將使得跨物種PCR擴(kuò)增具有更高的成功率。

兩棲動(dòng)物作為脊椎動(dòng)物從水生過渡到陸生的重要類群，一直以來在生態(tài)系統(tǒng)中扮演了重要的角色。然而，近年來由于氣候變暖、棲息地破碎化及喪失、捕獵和疾病等原因，其種群下降速率一直居于脊椎動(dòng)物第1位，全球評(píng)估發(fā)現(xiàn)有42.5%的兩棲類動(dòng)物數(shù)量呈下降趨勢(shì)[24]。為保護(hù)該類群，兩棲動(dòng)物的保護(hù)遺傳學(xué)和種群遺傳學(xué)研究得到極大發(fā)展[25-27]。義烏小鯢是受人為活動(dòng)影響較大的兩棲有尾類物種之一，隨城市化發(fā)展和經(jīng)濟(jì)作物的種植，適合義烏小鯢生存的棲息地發(fā)生劇烈的改變，導(dǎo)致義烏小鯢適生環(huán)境減少。該研究篩選到的具有多態(tài)性的11個(gè)義烏小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)，可有效用于義烏小鯢種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、有效種群大小以及基因流等保護(hù)遺傳學(xué)和種群遺傳學(xué)研究，從而為保護(hù)該物種提供重要的技術(shù)方法支持。

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