古菌研究進(jìn)展

鄧霏

摘要從古菌的發(fā)現(xiàn)出發(fā)，綜述古菌的分類、分布、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、研究方法及現(xiàn)狀，分析古菌發(fā)展存在的一些問(wèn)題，對(duì)今后古菌發(fā)展的方向進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞古菌；分類；研究方法

中圖分類號(hào)X172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0011-04

Research Progress of Archaea

DENG Fei（College of Bioengineering and Technology，Tianshui Normal University，Tianshui ，Gansu 741000）

AbstractBased on finding of archaea，and the classification，the distribution，the phylogenetic relationship，research methods and current research situation were summarized.Problems of archaea development were analyzed，and the future development direction was proposed.

Key wordsArchaea；Classification；Research methods

古菌以其既不同于細(xì)菌也有別于真核生物的特點(diǎn)，在全球的生物地球化學(xué)作用中扮演著不可替代的角色。古菌研究對(duì)闡明生命運(yùn)動(dòng)的基本規(guī)律，揭示生命起源和物種進(jìn)化，生物與生物、生物與環(huán)境的相互作用具有重要意義。

1古菌的發(fā)現(xiàn)

多年以來(lái)，人們認(rèn)為地球上的生命形式只分為原核生物和真核生物。但在后續(xù)的研究過(guò)程中，人們從火山口、鹽湖等高熱、高鹽、缺氧等極端環(huán)境下分離得到一些微生物，這些微生物中包含大量產(chǎn)甲烷的微生物，當(dāng)時(shí)的科學(xué)家認(rèn)為這些微生物可能是產(chǎn)甲烷的細(xì)菌，但發(fā)現(xiàn)這些微生物與已知的細(xì)菌有本質(zhì)的區(qū)別。1977年Woese等[1]提出的16S rRNA生命樹(shù)將這些微生物劃歸為新的生命類型——archaebacteria。他在比較了3類生物的小亞基核糖體RNA序列后，發(fā)現(xiàn)三域生物間的序列相似性都低于60%，而域內(nèi)的序列相似性高于70% [2]，因而認(rèn)為生命是由細(xì)菌域（Bacteria）、真核生物域（Eucarya）和古菌域（Archaea）組成，并在1990年首次提出三域?qū)W說(shuō)，把自然界的生物分成不同的三大領(lǐng)域，并把a(bǔ)rchaebacteria改名為archaea，正式提出古菌概念[3]。

作為三域之一的生物，古菌有著特殊的性質(zhì)。古菌細(xì)胞壁不含肽聚糖，細(xì)胞骨架由蛋白質(zhì)或假肽聚糖構(gòu)成，細(xì)胞膜由甘油分子和支鏈烴以醚鍵相連。古菌雖與細(xì)菌同為原核生物，但卻與真核生物在進(jìn)化樹(shù)上具有更近的親緣關(guān)系。例如，在遺傳信息傳遞方面，古菌具有明顯的真核生物特征。但在代謝過(guò)程中，如產(chǎn)能等方面卻與細(xì)菌相似[4]。

古菌不僅存在于高溫、高鹽、缺氧、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等極端環(huán)境，也廣泛存在于湖泊、海洋以及土壤等各種普通環(huán)境中，且含量巨大[5-6]，在全球地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。例如海洋沉積物中的厭氧產(chǎn)甲烷古菌可將有機(jī)物降解為甲烷，對(duì)于海底甲烷的產(chǎn)生、存貯、轉(zhuǎn)化甚至全球氣候和全球碳循環(huán)等都有著不可估量的影響[7]。海洋浮游泉古菌能夠利用可溶性無(wú)機(jī)碳作為碳源[8-9]，進(jìn)而影響海洋碳循環(huán)。此外，有數(shù)據(jù)顯示，在某些海洋和土壤環(huán)境中，氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea，AOA）數(shù)量遠(yuǎn)大于氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）[10-14]，在N循環(huán)中的作用更大。在多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的海洋沉積物厭氧甲烷氧化環(huán)境中，硫酸鹽的降解和甲烷的氧化有密切關(guān)系[15]，硫酸鹽還原菌和甲烷氧化古菌可形成集團(tuán)在對(duì)硫酸鹽進(jìn)行還原的同時(shí)對(duì)甲烷進(jìn)行氧化[16]。

2古菌的分類、分布及其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

根據(jù)16S rDNA序列將古菌分為5個(gè)不同的門(mén)類：奇古菌門(mén)[17]（Thaumarchaeota）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）、泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）、納古菌門(mén)（Nanoarchaeota）[18]和初生古菌門(mén)（Korarchaeota）[19-20]。目前發(fā)現(xiàn)的主要類群為奇古菌、廣古菌和泉古菌。初生古菌和納古菌目前均只發(fā)現(xiàn)1個(gè)種[19-20]。

與其他4個(gè)類群相比，廣古菌（Euryarchaeota）多樣性比較豐富，分布極其廣泛。主要包括一些產(chǎn)甲烷菌（methanogens）、嗜熱菌（thermophiles）和極端嗜鹽菌（halophiles）。研究表明，在淺水環(huán)境中，廣古菌的多樣性和豐度更大[21-22]。廣古菌中的一些嗜熱古菌、產(chǎn)甲烷古菌、極端嗜鹽古菌等都是可培養(yǎng)的古菌類群。

泉古菌（Crenarchaeota）最初是在極端環(huán)境下發(fā)現(xiàn)的一個(gè)古菌類群。很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，泉古菌一直被認(rèn)為只存在于極端環(huán)境中，絕對(duì)厭氧并且依賴硫進(jìn)行代謝。最初分離的泉古菌也都來(lái)源于海底熱泉和熱液區(qū)等地，但通過(guò)16S rDNA序列分析后發(fā)現(xiàn)，從低溫環(huán)境和中溫環(huán)境中均得到冷適應(yīng)的泉古菌，這些序列構(gòu)成泉古菌的新分支。這類冷適應(yīng)泉古菌也被認(rèn)為是地球上數(shù)目最大的原核生物之一。泉古菌的生存環(huán)境包括海洋、湖泊沉積物、土壤等。在深水環(huán)境中，泉古菌也是優(yōu)勢(shì)類群。近年來(lái)，基于對(duì)中溫泉古菌基因組學(xué)、生理生態(tài)特征等的分析顯示，中溫泉古菌與泉古菌具有明顯不同的特征。2008年Brochier-Armanet等[17]將中溫泉古菌劃分為一個(gè)新的門(mén)——Thaumarchaeota （奇古菌門(mén)） 。

迄今為止，納古菌門(mén)（Nanoarchaeota）中只發(fā)現(xiàn)1個(gè)種——騎行納古菌（Nanoarchaeumequitans），它是2002年科學(xué)家在冰島的熱泉口發(fā)現(xiàn)的，專性共生于另一種古菌燃球菌（Ignicoccus）上。納古菌是目前發(fā)現(xiàn)的除病毒之外的基因組最小的生物[23]。

初生古菌門(mén)（Korarchaeota）是用分子生物學(xué)手段從美國(guó)黃石公園超熱環(huán)境樣品中檢測(cè)到的一類古菌[19]，目前只通過(guò)FISH技術(shù)檢測(cè)到它的存在，還未得到純培養(yǎng)物[24]。這類古菌在進(jìn)化上與中溫古菌比較接近，但在生物學(xué)特性上與嗜熱微生物有許多共同點(diǎn)。在古菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，初生古菌位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的根部，這是生命熱起源理論的又一理論依據(jù)[25]。

古菌的分布受多種因素的影響，特殊環(huán)境中往往生存著一些特殊類型的古菌。已有研究表明，高鹽、高壓、低溫、冷泉、深海熱液口或低營(yíng)養(yǎng)等特殊的生境中生活著許多特殊的古菌[26]。除這些極端環(huán)境之外，非極端環(huán)境中的古菌的分布也表現(xiàn)出一定的規(guī)律。如王峰等[27]研究表明，西太平洋深海沉積物中古菌有明顯的垂直分布特點(diǎn)；Hu等[28]研究表明，中國(guó)南海浮游泉古菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)隨著海洋深度的變化呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化趨勢(shì)；Cruz-Martínez等[29]研究表明，不同季節(jié)降雨量的不同影響土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的變化。除上述因素外，環(huán)境中含氧量[30]、海水鹽度[31]、原位水文、潮汐、波浪等[32]也能影響相應(yīng)環(huán)境中古菌的多樣性。

3古菌研究方法

目前，由于對(duì)古菌分離培養(yǎng)需要的溫度、鹽度、碳源、pH、是否需要生長(zhǎng)因子以及所需生長(zhǎng)因子的種類、是否需要與其他微生物共培養(yǎng)等都不是十分清楚，得到的古菌純培養(yǎng)物十分稀少，因此需要借助不同的研究方法對(duì)古菌進(jìn)行研究。目前，常用的研究方法主要包括以下幾種。

3.1原位研究

原位研究是實(shí)驗(yàn)室最初加壓等條件不成熟時(shí)常用的研究方法。試驗(yàn)時(shí)，可以預(yù)先用同位素進(jìn)行標(biāo)記，從而對(duì)不同位置及不同置入底物等條件下古菌生長(zhǎng)機(jī)制進(jìn)行研究[33]。雖然目前實(shí)驗(yàn)室條件有長(zhǎng)足的進(jìn)展，但由于原位研究的特殊性，仍然是海洋古菌尤其是深海古菌研究的一種常用手段。

3.2脂類結(jié)構(gòu)研究

脂類是細(xì)胞膜的骨架成份，細(xì)胞膜將胞內(nèi)物質(zhì)與外界環(huán)境分隔開(kāi)來(lái)，使單細(xì)胞生物形成一個(gè)微小的、獨(dú)立的、相對(duì)穩(wěn)定的系統(tǒng)。由于古菌的脂類結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，所以脂類結(jié)構(gòu)研究也是古菌研究的重要方法之一[5]。古菌之所以能夠在高溫、強(qiáng)酸、堿等條件下生存，是因?yàn)楣啪悅?cè)鏈的特殊結(jié)構(gòu)。細(xì)菌等常見(jiàn)脂類側(cè)鏈?zhǔn)且怎ユI和甘油酸分子相連，而古菌脂類側(cè)鏈?zhǔn)且苑浅７€(wěn)定的醚鍵與甘油酸分子相連，正是這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得古菌死亡后其碳骨架還可以長(zhǎng)期保存，通過(guò)測(cè)定古菌脂類結(jié)構(gòu)即可揭示無(wú)法培養(yǎng)古菌的種類、分布以及演化等信息[34]。

3.3克隆文庫(kù)的構(gòu)建

克隆文庫(kù)的構(gòu)建是對(duì)樣品中古菌的16S rRNA基因或相應(yīng)的功能基因進(jìn)行擴(kuò)增，再將擴(kuò)增純化后的產(chǎn)物連接到載體上轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，通過(guò)選擇性培養(yǎng)后，對(duì)已插入的目的片段進(jìn)行大量擴(kuò)增，再通過(guò)測(cè)序、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)等確定樣品中古菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。克隆文庫(kù)可以很好地解決樣品中古菌難培養(yǎng)或者含量非常低的問(wèn)題，但由于其繁瑣耗時(shí)，難以對(duì)古菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

3.4指紋圖譜技術(shù)

常見(jiàn)的指紋圖譜技術(shù)包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（T-RFLP）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以及溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）等。RFLP技術(shù)是根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)不同DNA的序列進(jìn)行特異性切割，得到不同長(zhǎng)度和數(shù)量的DNA片段，再通過(guò)高分辨率的電泳得到特異電泳圖譜，對(duì)不同酶切帶型的序列進(jìn)行測(cè)序分析，從而了解樣品包含的古菌群落信息。T-RFLP是在RFLP的基礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的，二者的不同在于T-RFLP在PCR引物的末端引入1個(gè)或2個(gè)熒光標(biāo)記物質(zhì)。與RFLP相比，T-RFLP可直接對(duì)混合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，且靈敏度更高，可以快速得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)化結(jié)果[35]。這2種方法在環(huán)境微生物多樣性檢測(cè)及群落結(jié)構(gòu)的研究中已得到廣泛應(yīng)用。DGGE是指在尿素和甲酰胺等變性劑形成的連續(xù)變性梯度的凝膠中，加入雙鏈的短片段PCR產(chǎn)物，不同G+C含量的DNA在相應(yīng)濃度變性劑下部分解鏈，分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響其電泳遷移率，在凝膠中形成位置不同的譜帶。因此，利用DGGE可以直接觀察不同樣品中古菌的多樣性，也可從凝膠上切下譜帶，通過(guò)測(cè)序分析樣品中古菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。TGGE的方法基本類似于DGGE，不同之處是利用溫度梯度將不同G+C含量的DNA加以區(qū)分。目前，DGGE和TGGE技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的研究[36]，研究?jī)?nèi)容包括微生物的群落結(jié)構(gòu)及隨環(huán)境變化的動(dòng)態(tài)變化、尋找環(huán)境中新的特異微生物、比較不同環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異等。

3.5高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)也稱第2代測(cè)序技術(shù)或深度測(cè)序技術(shù)。與普通測(cè)序技術(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)可獲得海量數(shù)據(jù)，偏耗性低，運(yùn)行成本也相對(duì)較低，理論上可以測(cè)出樣品中全部的微生物。目前，廣泛應(yīng)運(yùn)于環(huán)境樣品微生物測(cè)序的方法主要有Roche的454、Illumina 的Solexa和Life technologies的SOLiD、Ion Torrent等[37]。Roche的454測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，錯(cuò)誤率也相對(duì)較低（僅為0.38%），但運(yùn)行成本高[38]。Illumina 的Solexa技術(shù)通量大，單位成本低，錯(cuò)誤率也很低（HiSeq 和MiSeq 測(cè)序平臺(tái)的錯(cuò)誤率分別為0.26%和0.80%）[39]。雖然Illumina測(cè)序技術(shù)的單位讀長(zhǎng)相對(duì)較短，但目前已經(jīng)通過(guò)雙向測(cè)序（PE）可以達(dá)到2×250 bp，并且有望達(dá)到2×400 bp。Life technologies技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)是成本低，但其錯(cuò)誤率較其他2種測(cè)序技術(shù)高，達(dá)到1.71%[40]，目前該技術(shù)的應(yīng)用范圍也較其他2種技術(shù)小。高通量測(cè)序技術(shù)突破傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，也幫助研究者跨過(guò)了克隆文庫(kù)這一繁瑣耗時(shí)的步驟，減少試驗(yàn)過(guò)程的偏差，通過(guò)后續(xù)生物信息學(xué)分析，能夠快速高效完成測(cè)序任務(wù)。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物群落的研究中，如耕地土壤[41]、南極苔原土壤[42]、海水[43]、人類消化道[44]以及海洋沉積物等環(huán)境[45-47]。

4古菌主要研究成果

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和一些大型數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，如GenBank 、RDP（ribosomal RNA data base project）、Silva、Greengene等，以及一些分析軟件的涉入，古菌16S rRNA基因及功能基因等方面的資料不斷完善，這些都為古菌研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[48]。目前，國(guó)際上對(duì)古菌的研究已取得許多重要的進(jìn)展，同時(shí)也糾正了某些認(rèn)識(shí)上的錯(cuò)誤。例如，過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間，人們認(rèn)為海洋古菌只存在于3個(gè)特定的生境中：深?；鹕娇凇⑷毖醭练e物和高鹽海區(qū)，但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)古菌雖受一定環(huán)境的制約，但其分布卻是極其廣泛的。

目前，國(guó)際上對(duì)古菌的研究主要集中在以下3個(gè)方面：一是極端環(huán)境下某些特殊古菌的研究。極端環(huán)境下的微生物是一個(gè)潛在的寶庫(kù)，它們獨(dú)特的基因組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞組分等都有可能對(duì)人類的生產(chǎn)生活產(chǎn)生重大影響。例如1997年Michels等[49]研究指出，Methanococcus jannaschii（一種深海嗜熱嗜壓菌）能夠產(chǎn)生嗜壓蛋白酶，當(dāng)壓力增加至500個(gè)大氣壓時(shí)，該酶催化反應(yīng)速率提高3.4倍，熱穩(wěn)定性提高2.7倍。二是古菌在地球化學(xué)循環(huán)中所起的作用。例如，海洋沉積物中的厭氧產(chǎn)甲烷古菌可將有機(jī)物降解為甲烷，對(duì)于海底甲烷的產(chǎn)生、存貯、轉(zhuǎn)化甚至全球氣候和碳循環(huán)等都有著不可估量的影響[7]。三是古菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境特征的相關(guān)關(guān)系。目前，雖然古菌群落與生物地球化學(xué)因素、沉積特點(diǎn)、地質(zhì)事件等之間的關(guān)系尚不明確，但越來(lái)越多的研究表明，典型的古菌群落都反應(yīng)出對(duì)特殊小生境的適應(yīng)。例如在巴布亞新幾內(nèi)亞?wèn)|北部高溫、高鹽的熱液口環(huán)境中，古菌的群落結(jié)構(gòu)與這種熱液沉積物的環(huán)境非常一致[50]。日本海溝沉積物中的古菌群落結(jié)構(gòu)也很符合這一地區(qū)沉積物孔隙大、滲透性強(qiáng)的特點(diǎn)[51]。

對(duì)功能性古菌——氨氧化古菌的研究也得到長(zhǎng)足發(fā)展。長(zhǎng)久以來(lái)，氨氧化細(xì)菌（AOB）被公認(rèn)為是氨氧化過(guò)程的主要驅(qū)動(dòng)者。2004 年，Venter等[52]用鳥(niǎo)槍法對(duì)馬尾藻海中的宏基因組進(jìn)行測(cè)序分析表明，海水中存在泉古菌的氨單加氧酶基因（ammonia monooxygenase，AMO）序列，首次提出海洋中某些泉古菌可能具有氨氧化的能力。2005 年，Knneke等[53]從海水中分離出一株具有amoA基因的奇古菌門(mén)的亞硝化侏儒菌（Nitrosopumilus maritimus），該菌株以氨為唯一能源物質(zhì)進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，F(xiàn)rancis等[54]將這類泉古菌命名為氨氧化古菌。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，amoA基因不只存在于海水環(huán)境中，土壤泉古菌中也存在amoA基因，有可能驅(qū)動(dòng)土壤氨氧化過(guò)程[55]。2006年，Leininger 等[14]報(bào)道了土壤中氨氧化古菌可能是氨氧化細(xì)菌的3 000倍之多。此后陸續(xù)有研究報(bào)道海水[13]、農(nóng)業(yè)土壤[56]、酸性茶園[57]等不同環(huán)境中氨氧化古菌amoA基因的拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于氨氧化細(xì)菌，在氮循環(huán)過(guò)程中可能扮演著比氨氧化細(xì)菌更重要的角色。根據(jù)氨氧化古菌amoA基因序列和所處的生態(tài)環(huán)境，可將氨氧化古菌大致分為3類：陸地土壤/淡水沉積物氨氧化古菌族群、海水/海洋沉積物氨氧化古菌族群以及嗜高溫環(huán)境氨氧化古菌族群[58-59]。目前，已在許多生境中發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌的存在，這些生境包括海洋沉積物[60]、海水[54]、旱地紅壤[61]、濕地[62]以及根際[63]等?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)都證明氨氧化古菌的廣泛存在及其在生物地球化學(xué)氮循環(huán)中可能起到舉足輕重的作用。

5古菌研究存在的問(wèn)題及其展望

5.1古菌純培養(yǎng)物的獲得

古菌純培養(yǎng)物的獲得仍是古菌研究發(fā)展的瓶頸問(wèn)題[5]。由于人們對(duì)于古菌的培養(yǎng)條件還在摸索中，得到的純培養(yǎng)物特別稀少。如果能得到較多的古菌純培養(yǎng)物，就能夠?yàn)?6S rDNA測(cè)序和脂類分析提供標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，古菌研究將會(huì)進(jìn)入一個(gè)嶄新階段。為了更早地摸清古菌純培養(yǎng)的條件，要在現(xiàn)有條件下，盡可能多的了解古菌的生存環(huán)境及條件，找到控制不同古菌生長(zhǎng)的最有利因素。

5.2分子生物學(xué)技術(shù)有待發(fā)展

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為古菌的研究提供了很大的便捷，但是分子生物學(xué)技術(shù)在古菌研究上仍然存在許多缺陷。首先，核酸提取過(guò)程中部分細(xì)胞可能未完全裂解。其次，所設(shè)計(jì)的引物往往會(huì)漏掉所檢測(cè)樣品中的某些種類，即便是通用引物也可能存在片面性。再次，探針的設(shè)計(jì)，一般而言，探針具有物種特異性，是根據(jù)試驗(yàn)者預(yù)期的種屬來(lái)設(shè)計(jì)的，這就意味著會(huì)忽略PCR產(chǎn)物的許多成分，很難兼顧到一些不為人知的種類。最后，人們往往會(huì)選擇一定長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，這也不可避免地會(huì)遺失許多數(shù)據(jù)；并且模板的序列不同，克隆的效率也不同，比如低G+C含量的模板的克隆效率大大高于高G+C含量的模板，這就不可避免地會(huì)掩蓋某些模板特性，甚至產(chǎn)生較大的錯(cuò)配、誤配[64]。

盡管分子生物學(xué)技術(shù)存在諸多不足，但與傳統(tǒng)試驗(yàn)方法相比，分子生物技術(shù)仍具有更大的精確度和適應(yīng)性，相信不久的將來(lái)，隨著試驗(yàn)方法的改進(jìn)和科技工作者經(jīng)驗(yàn)及數(shù)據(jù)的累積，分子生物學(xué)技術(shù)在古菌研究領(lǐng)域?qū)缪菰絹?lái)越重要的角色。

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