鄧霏
摘要從古菌的發(fā)現(xiàn)出發(fā),綜述古菌的分類、分布、系統(tǒng)進化關系、研究方法及現(xiàn)狀,分析古菌發(fā)展存在的一些問題,對今后古菌發(fā)展的方向進行展望。
關鍵詞古菌;分類;研究方法
中圖分類號X172文獻標識碼
A文章編號0517-6611(2018)28-0011-04
Research Progress of Archaea
DENG Fei(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui ,Gansu 741000)
AbstractBased on finding of archaea,and the classification,the distribution,the phylogenetic relationship,research methods and current research situation were summarized.Problems of archaea development were analyzed,and the future development direction was proposed.
Key wordsArchaea;Classification;Research methods
古菌以其既不同于細菌也有別于真核生物的特點,在全球的生物地球化學作用中扮演著不可替代的角色。古菌研究對闡明生命運動的基本規(guī)律,揭示生命起源和物種進化,生物與生物、生物與環(huán)境的相互作用具有重要意義。
1古菌的發(fā)現(xiàn)
多年以來,人們認為地球上的生命形式只分為原核生物和真核生物。但在后續(xù)的研究過程中,人們從火山口、鹽湖等高熱、高鹽、缺氧等極端環(huán)境下分離得到一些微生物,這些微生物中包含大量產甲烷的微生物,當時的科學家認為這些微生物可能是產甲烷的細菌,但發(fā)現(xiàn)這些微生物與已知的細菌有本質的區(qū)別。1977年Woese等[1]提出的16S rRNA生命樹將這些微生物劃歸為新的生命類型——archaebacteria。他在比較了3類生物的小亞基核糖體RNA序列后,發(fā)現(xiàn)三域生物間的序列相似性都低于60%,而域內的序列相似性高于70% [2],因而認為生命是由細菌域(Bacteria)、真核生物域(Eucarya)和古菌域(Archaea)組成,并在1990年首次提出三域學說,把自然界的生物分成不同的三大領域,并把archaebacteria改名為archaea,正式提出古菌概念[3]。
作為三域之一的生物,古菌有著特殊的性質。古菌細胞壁不含肽聚糖,細胞骨架由蛋白質或假肽聚糖構成,細胞膜由甘油分子和支鏈烴以醚鍵相連。古菌雖與細菌同為原核生物,但卻與真核生物在進化樹上具有更近的親緣關系。例如,在遺傳信息傳遞方面,古菌具有明顯的真核生物特征。但在代謝過程中,如產能等方面卻與細菌相似[4]。
古菌不僅存在于高溫、高鹽、缺氧、強酸、強堿等極端環(huán)境,也廣泛存在于湖泊、海洋以及土壤等各種普通環(huán)境中,且含量巨大[5-6],在全球地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。例如海洋沉積物中的厭氧產甲烷古菌可將有機物降解為甲烷,對于海底甲烷的產生、存貯、轉化甚至全球氣候和全球碳循環(huán)等都有著不可估量的影響[7]。海洋浮游泉古菌能夠利用可溶性無機碳作為碳源[8-9],進而影響海洋碳循環(huán)。此外,有數(shù)據(jù)顯示,在某些海洋和土壤環(huán)境中,氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)數(shù)量遠大于氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)[10-14],在N循環(huán)中的作用更大。在多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的海洋沉積物厭氧甲烷氧化環(huán)境中,硫酸鹽的降解和甲烷的氧化有密切關系[15],硫酸鹽還原菌和甲烷氧化古菌可形成集團在對硫酸鹽進行還原的同時對甲烷進行氧化[16]。
2古菌的分類、分布及其系統(tǒng)進化關系
根據(jù)16S rDNA序列將古菌分為5個不同的門類:奇古菌門[17](Thaumarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、納古菌門(Nanoarchaeota)[18]和初生古菌門(Korarchaeota)[19-20]。目前發(fā)現(xiàn)的主要類群為奇古菌、廣古菌和泉古菌。初生古菌和納古菌目前均只發(fā)現(xiàn)1個種[19-20]。
與其他4個類群相比,廣古菌(Euryarchaeota)多樣性比較豐富,分布極其廣泛。主要包括一些產甲烷菌(methanogens)、嗜熱菌(thermophiles)和極端嗜鹽菌(halophiles)。研究表明,在淺水環(huán)境中,廣古菌的多樣性和豐度更大[21-22]。廣古菌中的一些嗜熱古菌、產甲烷古菌、極端嗜鹽古菌等都是可培養(yǎng)的古菌類群。
泉古菌(Crenarchaeota)最初是在極端環(huán)境下發(fā)現(xiàn)的一個古菌類群。很長一段時間以來,泉古菌一直被認為只存在于極端環(huán)境中,絕對厭氧并且依賴硫進行代謝。最初分離的泉古菌也都來源于海底熱泉和熱液區(qū)等地,但通過16S rDNA序列分析后發(fā)現(xiàn),從低溫環(huán)境和中溫環(huán)境中均得到冷適應的泉古菌,這些序列構成泉古菌的新分支。這類冷適應泉古菌也被認為是地球上數(shù)目最大的原核生物之一。泉古菌的生存環(huán)境包括海洋、湖泊沉積物、土壤等。在深水環(huán)境中,泉古菌也是優(yōu)勢類群。近年來,基于對中溫泉古菌基因組學、生理生態(tài)特征等的分析顯示,中溫泉古菌與泉古菌具有明顯不同的特征。2008年Brochier-Armanet等[17]將中溫泉古菌劃分為一個新的門——Thaumarchaeota (奇古菌門) 。
迄今為止,納古菌門(Nanoarchaeota)中只發(fā)現(xiàn)1個種——騎行納古菌(Nanoarchaeumequitans),它是2002年科學家在冰島的熱泉口發(fā)現(xiàn)的,專性共生于另一種古菌燃球菌(Ignicoccus)上。納古菌是目前發(fā)現(xiàn)的除病毒之外的基因組最小的生物[23]。
初生古菌門(Korarchaeota)是用分子生物學手段從美國黃石公園超熱環(huán)境樣品中檢測到的一類古菌[19],目前只通過FISH技術檢測到它的存在,還未得到純培養(yǎng)物[24]。這類古菌在進化上與中溫古菌比較接近,但在生物學特性上與嗜熱微生物有許多共同點。在古菌系統(tǒng)發(fā)育樹中,初生古菌位于系統(tǒng)發(fā)育樹的根部,這是生命熱起源理論的又一理論依據(jù)[25]。
古菌的分布受多種因素的影響,特殊環(huán)境中往往生存著一些特殊類型的古菌。已有研究表明,高鹽、高壓、低溫、冷泉、深海熱液口或低營養(yǎng)等特殊的生境中生活著許多特殊的古菌[26]。除這些極端環(huán)境之外,非極端環(huán)境中的古菌的分布也表現(xiàn)出一定的規(guī)律。如王峰等[27]研究表明,西太平洋深海沉積物中古菌有明顯的垂直分布特點;Hu等[28]研究表明,中國南海浮游泉古菌的豐度和群落結構隨著海洋深度的變化呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化趨勢;Cruz-Martínez等[29]研究表明,不同季節(jié)降雨量的不同影響土壤古菌群落結構的變化。除上述因素外,環(huán)境中含氧量[30]、海水鹽度[31]、原位水文、潮汐、波浪等[32]也能影響相應環(huán)境中古菌的多樣性。
3古菌研究方法
目前,由于對古菌分離培養(yǎng)需要的溫度、鹽度、碳源、pH、是否需要生長因子以及所需生長因子的種類、是否需要與其他微生物共培養(yǎng)等都不是十分清楚,得到的古菌純培養(yǎng)物十分稀少,因此需要借助不同的研究方法對古菌進行研究。目前,常用的研究方法主要包括以下幾種。
3.1原位研究
原位研究是實驗室最初加壓等條件不成熟時常用的研究方法。試驗時,可以預先用同位素進行標記,從而對不同位置及不同置入底物等條件下古菌生長機制進行研究[33]。雖然目前實驗室條件有長足的進展,但由于原位研究的特殊性,仍然是海洋古菌尤其是深海古菌研究的一種常用手段。
3.2脂類結構研究
脂類是細胞膜的骨架成份,細胞膜將胞內物質與外界環(huán)境分隔開來,使單細胞生物形成一個微小的、獨立的、相對穩(wěn)定的系統(tǒng)。由于古菌的脂類結構相當穩(wěn)定,所以脂類結構研究也是古菌研究的重要方法之一[5]。古菌之所以能夠在高溫、強酸、堿等條件下生存,是因為古菌脂類側鏈的特殊結構。細菌等常見脂類側鏈是以酯鍵和甘油酸分子相連,而古菌脂類側鏈是以非常穩(wěn)定的醚鍵與甘油酸分子相連,正是這種穩(wěn)定的結構使得古菌死亡后其碳骨架還可以長期保存,通過測定古菌脂類結構即可揭示無法培養(yǎng)古菌的種類、分布以及演化等信息[34]。
3.3克隆文庫的構建
克隆文庫的構建是對樣品中古菌的16S rRNA基因或相應的功能基因進行擴增,再將擴增純化后的產物連接到載體上轉入受體細胞,通過選擇性培養(yǎng)后,對已插入的目的片段進行大量擴增,再通過測序、數(shù)據(jù)庫比對等確定樣品中古菌的系統(tǒng)發(fā)育地位??寺∥膸炜梢院芎玫亟鉀Q樣品中古菌難培養(yǎng)或者含量非常低的問題,但由于其繁瑣耗時,難以對古菌群落結構的動態(tài)變化進行實時監(jiān)測。
3.4指紋圖譜技術
常見的指紋圖譜技術包括限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、末端限制性片段長度多態(tài)分析(T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)以及溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)等。RFLP技術是根據(jù)限制性核酸內切酶對不同DNA的序列進行特異性切割,得到不同長度和數(shù)量的DNA片段,再通過高分辨率的電泳得到特異電泳圖譜,對不同酶切帶型的序列進行測序分析,從而了解樣品包含的古菌群落信息。T-RFLP是在RFLP的基礎上發(fā)展來的,二者的不同在于T-RFLP在PCR引物的末端引入1個或2個熒光標記物質。與RFLP相比,T-RFLP可直接對混合的PCR產物進行酶切,且靈敏度更高,可以快速得到準確的數(shù)據(jù)化結果[35]。這2種方法在環(huán)境微生物多樣性檢測及群落結構的研究中已得到廣泛應用。DGGE是指在尿素和甲酰胺等變性劑形成的連續(xù)變性梯度的凝膠中,加入雙鏈的短片段PCR產物,不同G+C含量的DNA在相應濃度變性劑下部分解鏈,分子構象發(fā)生改變,從而影響其電泳遷移率,在凝膠中形成位置不同的譜帶。因此,利用DGGE可以直接觀察不同樣品中古菌的多樣性,也可從凝膠上切下譜帶,通過測序分析樣品中古菌的系統(tǒng)進化關系。TGGE的方法基本類似于DGGE,不同之處是利用溫度梯度將不同G+C含量的DNA加以區(qū)分。目前,DGGE和TGGE技術已經(jīng)廣泛應用于微生物生態(tài)學的研究[36],研究內容包括微生物的群落結構及隨環(huán)境變化的動態(tài)變化、尋找環(huán)境中新的特異微生物、比較不同環(huán)境中微生物群落結構的差異等。
3.5高通量測序技術
高通量測序技術也稱第2代測序技術或深度測序技術。與普通測序技術相比,高通量測序技術可獲得海量數(shù)據(jù),偏耗性低,運行成本也相對較低,理論上可以測出樣品中全部的微生物。目前,廣泛應運于環(huán)境樣品微生物測序的方法主要有Roche的454、Illumina 的Solexa和Life technologies的SOLiD、Ion Torrent等[37]。Roche的454測序讀長較長,錯誤率也相對較低(僅為0.38%),但運行成本高[38]。Illumina 的Solexa技術通量大,單位成本低,錯誤率也很低(HiSeq 和MiSeq 測序平臺的錯誤率分別為0.26%和0.80%)[39]。雖然Illumina測序技術的單位讀長相對較短,但目前已經(jīng)通過雙向測序(PE)可以達到2×250 bp,并且有望達到2×400 bp。Life technologies技術的突出優(yōu)點是成本低,但其錯誤率較其他2種測序技術高,達到1.71%[40],目前該技術的應用范圍也較其他2種技術小。高通量測序技術突破傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性,也幫助研究者跨過了克隆文庫這一繁瑣耗時的步驟,減少試驗過程的偏差,通過后續(xù)生物信息學分析,能夠快速高效完成測序任務。目前,高通量測序技術已被廣泛應用于各種環(huán)境微生物群落的研究中,如耕地土壤[41]、南極苔原土壤[42]、海水[43]、人類消化道[44]以及海洋沉積物等環(huán)境[45-47]。
4古菌主要研究成果
隨著分子生物學技術的不斷進步和一些大型數(shù)據(jù)庫的建立,如GenBank 、RDP(ribosomal RNA data base project)、Silva、Greengene等,以及一些分析軟件的涉入,古菌16S rRNA基因及功能基因等方面的資料不斷完善,這些都為古菌研究提供了基礎數(shù)據(jù)[48]。目前,國際上對古菌的研究已取得許多重要的進展,同時也糾正了某些認識上的錯誤。例如,過去很長一段時間,人們認為海洋古菌只存在于3個特定的生境中:深?;鹕娇?、缺氧沉積物和高鹽海區(qū),但隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)古菌雖受一定環(huán)境的制約,但其分布卻是極其廣泛的。
目前,國際上對古菌的研究主要集中在以下3個方面:一是極端環(huán)境下某些特殊古菌的研究。極端環(huán)境下的微生物是一個潛在的寶庫,它們獨特的基因組成、蛋白質結構以及細胞組分等都有可能對人類的生產生活產生重大影響。例如1997年Michels等[49]研究指出,Methanococcus jannaschii(一種深海嗜熱嗜壓菌)能夠產生嗜壓蛋白酶,當壓力增加至500個大氣壓時,該酶催化反應速率提高3.4倍,熱穩(wěn)定性提高2.7倍。二是古菌在地球化學循環(huán)中所起的作用。例如,海洋沉積物中的厭氧產甲烷古菌可將有機物降解為甲烷,對于海底甲烷的產生、存貯、轉化甚至全球氣候和碳循環(huán)等都有著不可估量的影響[7]。三是古菌群落結構與環(huán)境特征的相關關系。目前,雖然古菌群落與生物地球化學因素、沉積特點、地質事件等之間的關系尚不明確,但越來越多的研究表明,典型的古菌群落都反應出對特殊小生境的適應。例如在巴布亞新幾內亞東北部高溫、高鹽的熱液口環(huán)境中,古菌的群落結構與這種熱液沉積物的環(huán)境非常一致[50]。日本海溝沉積物中的古菌群落結構也很符合這一地區(qū)沉積物孔隙大、滲透性強的特點[51]。
對功能性古菌——氨氧化古菌的研究也得到長足發(fā)展。長久以來,氨氧化細菌(AOB)被公認為是氨氧化過程的主要驅動者。2004 年,Venter等[52]用鳥槍法對馬尾藻海中的宏基因組進行測序分析表明,海水中存在泉古菌的氨單加氧酶基因(ammonia monooxygenase,AMO)序列,首次提出海洋中某些泉古菌可能具有氨氧化的能力。2005 年,Knneke等[53]從海水中分離出一株具有amoA基因的奇古菌門的亞硝化侏儒菌(Nitrosopumilus maritimus),該菌株以氨為唯一能源物質進行自養(yǎng)生長,F(xiàn)rancis等[54]將這類泉古菌命名為氨氧化古菌。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),amoA基因不只存在于海水環(huán)境中,土壤泉古菌中也存在amoA基因,有可能驅動土壤氨氧化過程[55]。2006年,Leininger 等[14]報道了土壤中氨氧化古菌可能是氨氧化細菌的3 000倍之多。此后陸續(xù)有研究報道海水[13]、農業(yè)土壤[56]、酸性茶園[57]等不同環(huán)境中氨氧化古菌amoA基因的拷貝數(shù)遠大于氨氧化細菌,在氮循環(huán)過程中可能扮演著比氨氧化細菌更重要的角色。根據(jù)氨氧化古菌amoA基因序列和所處的生態(tài)環(huán)境,可將氨氧化古菌大致分為3類:陸地土壤/淡水沉積物氨氧化古菌族群、海水/海洋沉積物氨氧化古菌族群以及嗜高溫環(huán)境氨氧化古菌族群[58-59]。目前,已在許多生境中發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌的存在,這些生境包括海洋沉積物[60]、海水[54]、旱地紅壤[61]、濕地[62]以及根際[63]等??傊?,這些發(fā)現(xiàn)都證明氨氧化古菌的廣泛存在及其在生物地球化學氮循環(huán)中可能起到舉足輕重的作用。
5古菌研究存在的問題及其展望
5.1古菌純培養(yǎng)物的獲得
古菌純培養(yǎng)物的獲得仍是古菌研究發(fā)展的瓶頸問題[5]。由于人們對于古菌的培養(yǎng)條件還在摸索中,得到的純培養(yǎng)物特別稀少。如果能得到較多的古菌純培養(yǎng)物,就能夠為16S rDNA測序和脂類分析提供標準依據(jù),古菌研究將會進入一個嶄新階段。為了更早地摸清古菌純培養(yǎng)的條件,要在現(xiàn)有條件下,盡可能多的了解古菌的生存環(huán)境及條件,找到控制不同古菌生長的最有利因素。
5.2分子生物學技術有待發(fā)展
分子生物學技術的發(fā)展為古菌的研究提供了很大的便捷,但是分子生物學技術在古菌研究上仍然存在許多缺陷。首先,核酸提取過程中部分細胞可能未完全裂解。其次,所設計的引物往往會漏掉所檢測樣品中的某些種類,即便是通用引物也可能存在片面性。再次,探針的設計,一般而言,探針具有物種特異性,是根據(jù)試驗者預期的種屬來設計的,這就意味著會忽略PCR產物的許多成分,很難兼顧到一些不為人知的種類。最后,人們往往會選擇一定長度的PCR產物,這也不可避免地會遺失許多數(shù)據(jù);并且模板的序列不同,克隆的效率也不同,比如低G+C含量的模板的克隆效率大大高于高G+C含量的模板,這就不可避免地會掩蓋某些模板特性,甚至產生較大的錯配、誤配[64]。
盡管分子生物學技術存在諸多不足,但與傳統(tǒng)試驗方法相比,分子生物技術仍具有更大的精確度和適應性,相信不久的將來,隨著試驗方法的改進和科技工作者經(jīng)驗及數(shù)據(jù)的累積,分子生物學技術在古菌研究領域將扮演越來越重要的角色。
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