UPLC—MS/MS法測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留的不確定度評定

刁銀軍，劉莉，肖珊美，楊德毅，洪佳琪，沈一蕾

摘要 [目的]對采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留的不確定度進行評估。[方法]根據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》中的有關(guān)規(guī)定，采用UPLC-MS/MS法測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留。建立測定元胡中4種有機磷殘留量不確定度的數(shù)學(xué)模型，逐層對不確定度來源進行分析，計算各不確定度分量并合成出標準不確定度和擴展不確定度。[結(jié)果]當(dāng)試樣中馬拉硫磷含量為0.048 57 μg/kg時，其擴展不確定度為（0.048 57±0.011 55） μg/kg，包含因子k=2；當(dāng)試樣中氧化樂果含量為0.065 34 μg/kg時，其擴展不確定度為（0.065 34±0.016 41） μg/kg，包含因子k=2；當(dāng)試樣中水胺硫磷含量為0.043 14 μg/kg時，其擴展不確定度為（0.043 14±0.011 02） μg/kg，包含因子k=2；當(dāng)試樣中三唑磷含量為0.058 36 μg/kg時，其擴展不確定度為（0.058 36±0.013 02） μg/kg，包含因子k=2。[結(jié)論]影響測定結(jié)果不確定度的主要來源為添加回收、標準溶液配制的準確性、測定重復(fù)性和方法的準確度，其他因素的影響相對較小。

關(guān)鍵詞 不確定度評定；有機磷農(nóng)藥殘留；元胡；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）

中圖分類號 S-03 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0157-05

Uncertainty Evaluation of Determination of Organic Organophosphorus Residues in Corydalis yanhusuo by UPLCMS/MS

DIAO Yinjun1，LIU Li2，XIAO Shanmei1 et al （1.Jinhua Polytecnical，Jinhua，Zhejiang 321017；2.Jinhua Comprehensive Quality Supervision and Testing Center of Agricultural Products，Jinhua，Zhejiang 321017）

Abstract [Objective] This study aimed to evaluate the uncertainty of measurement in the determination of organic organophosphorus residues in Corydalis yanhusuo by ultraperformance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS）.[Method] According to JJF 1135-2005.Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis Measurement and JJF 1059.1-2012 Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement，a mathematical model was established for uncertainty evaluation.The sources of uncertainty that may be introduced were analyzed and each component of uncertainty was quantified for the calculation of the combined uncertainty.[Result] The expanded uncertainty of （0.048 57±0.011 55） μg/kg （k=2） was obtained for the determination of the presence of 0.048 57 μg/kg malathion； the uncertainty of （0.043 14±0.011 02） μg/kg （k=2） was obtained for the determination of the presence of 0.043 14 μg/kg isocarbophos； the uncertainty of （0.065 34±0.016 41） μg/kg （k=2） was obtained for the determination of the presence of 0.065 34 μg/kg omethoate； the uncertainty of （0.058 36±0.013 02） μg/kg （k=2） was obtained for the determination of the presence of 0.058 36 μg/kg triazophos.[Conclusion] The preparation of standard solution，curve fitting and measurement repeatability were found to be the main sources of uncertainty.

Key words Uncertainty evaluation；Organic organophosphorus residues；Corydalis yanhusuo；Ultraperformance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS）

元胡（Corydalis yanhusuo）又名延胡索或玄胡，是罌粟科紫堇屬植物延胡索的干燥塊莖，味微苦，微辛溫，有活血化瘀、理氣止痛的功效，主治胃痛、胸腹痛、疝痛、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后淤血、跌打損傷等疾病，是婦科、傷科的常用藥[1-6]。隨著生活水平的不斷提高，人們的保健意識不斷增強，中藥材倍受青睞。然而目前市售中藥材多為人工栽培，為抵抗病蟲害侵襲，在中草藥的生產(chǎn)期會噴灑大量殺蟲劑，這就使農(nóng)藥殘留成為制約中藥安全使用的首要問題，對中草藥農(nóng)藥殘留量檢測技術(shù)的研究顯得尤為重要[7-8]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性、與測量結(jié)果相關(guān)性的參數(shù)，其數(shù)值的大小反映了測量結(jié)果質(zhì)量的高低，并直接與檢驗結(jié)果的合格判定相關(guān)[8]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留方法與標準推薦的方法相比，更簡便和環(huán)保，然而該方法非標準檢測方法，為確保檢測數(shù)據(jù)準確可靠以及測量結(jié)果的表達和質(zhì)量評定更規(guī)范，有必要對該方法進行測量不確定度的評估。同時，不確定度的評估在方法確認和量值溯源方面也具有重要意義。為此，筆者按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》以及CNAS.GL06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》規(guī)定的方法和程序，對新建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定元胡中4種有機磷的方法進行了不確定度的評估，分析了不確定度的主要來源，以期找出影響測定結(jié)果的主要因素，對這些因素進行重點控制，從而提高檢測質(zhì)量[9-14]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品。元胡干燥樣品購于浙江磐安藥材市場。

1.1.2 試劑。甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸、乙酸、異丙醇、乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚均為分析純。

1.1.3 儀器。Waters UPLC/ Xevo TQ-MS-MS（配電噴霧電離源），美國Waters公司； 組織勻漿儀、混合器，德國IKA公司；Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore公司；N-EVAP112 氮吹儀，美國Organonation Associates Jnc公司；電熱恒溫水浴鍋，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；3-15離心機，德國Sigma公司；微孔有機過濾膜（0.22 μm）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱：ACQUITYBEH C18 2.1 mm×100 mm×1.7 μm；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：20 ℃；流速：0.4 mL/min；流動相：甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～1.5 min，10%A；1.5～4.0 min，10%A→50%A；4.0～8.0 min，50%A→90%A；8.0～10.5 min，90% A；10.5～10.6 min，90%A→10%A；>10.6～13.0 min，10%A。進樣。

1.2.2 質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度：150 ℃；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），質(zhì)譜采集參數(shù)見表1；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣（氮氣）溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔反吹氣（氮氣）流速：40 L/h；碰撞氣（氬氣）流速：0.15 mL/min；定量方式：外標法。

1.2.3 樣品前處理。將中藥材樣品用切片機切割、粉碎機粉碎，過20目篩，-20 ℃保存，備用。稱取5.00 g元胡樣品，置于250 mL樣品瓶中，加入約1g助濾劑，搖勻，加入50 mL二氯甲烷，超聲提取30 min，抽濾，用30 mL二氯甲烷分2～3次洗滌殘渣，合并濾液，于45 ℃下旋蒸濃縮至約5 mL，轉(zhuǎn)移至盛有40 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的氯化鈉溶液的分液漏斗中，混勻，加入二氯甲烷（40 mL×2），振蕩提取2 min；有機相用10 g無水硫酸鈉脫水，于45 ℃下減壓濃縮至近干，用氮氣吹干，用5 mL正己烷溶解并定容，待凈化。

氨基固相萃取柱用5 mL二氯甲烷-甲醇（95∶5）活化，將樣品轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用二氯甲烷-甲醇（95∶5）洗滌樣品瓶，每次4 mL，洗滌2次，并將洗滌液全部轉(zhuǎn)入固相萃取柱中，收集全部流出液，在40 ℃水浴條件下氮氣吹至近干，用5 mL乙腈復(fù)溶，過0.22 μm有機相濾膜，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分析

2.1.1 數(shù)學(xué)模型的建立。有機磷農(nóng)殘量計算：

x=c×（v/m）

式中，x為試樣中被測物殘留量，μg/kg；c為從標準工作曲線得到的試樣溶液中被測組分的質(zhì)量濃度，ng/mL；v為試樣溶液最終定容體積，mL；m為試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量，g。

2.1.2 不確定度來源分析。根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，從標準樣品的制備、樣品處理到有機磷農(nóng)殘測定數(shù)學(xué)模型分析，有機磷農(nóng)藥殘留的不確定度來源主要包括：①標準溶液引入的不確定度。包括標準物質(zhì)本身引入的不確定度、標準工作溶液配制過程中引入的不確定度，校準曲線擬合引入的不確定度。②樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度。包括樣品稱量、樣品定容及添加回收率產(chǎn)生的不確定度。③由樣品重復(fù)測定產(chǎn)生的不確定度。④分析儀器引入的不確定度[15-16]。元胡中4種有機磷農(nóng)殘測定不確定度來源見圖1。

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 標準物質(zhì)引入的不確定度。

2.2.1.1 標準品純度引入的不確定度Urel（p）。根據(jù)標準證書，馬拉硫磷、氧化樂果、水胺硫磷、三唑磷提供的不確定度分別是±0.032、±0.140、±0.120、±0.190 μg/mL，標準溶液的濃度均為100.00 μg/mL。則馬拉硫磷、氧化樂果、水胺硫磷、三唑磷相對不確定度分別為0.000 32、0.001 400、0.001 20、0.001 90。

2.2.1.2 標準儲備液定容體積引入的不確定度Urel（v）。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定，20 ℃時100 L移液槍容量允差為±2 μL，假設(shè)為矩形分布，其標準不確定度為U（v1）=1.154 7，相對不確定度Urel（v1）=0.011 55。

10 mL容量瓶（A級）允許誤差為±0.02 mL，假設(shè)為矩形分布，其標準不確定度為U（10v）=0.011 55，相對不確定度Urel（10v）=0.001 155。

乙腈溶液的體積膨脹系數(shù)β乙腈/ ℃=1.37×10-3，實驗室溫度為（20±3）℃，假設(shè)溫度波動呈均勻分布，故由溫度引起的相對不確定度為Urel（1t）=0.002 373。

故由配制標準工作溶液時引入的相對不確定度為Urel（v）=0.011 85。

2.2.1.3 標準系列溶液配制過程產(chǎn)生的不確定度Urel（ms）。由配制標準系列溶液時引入的相對不確定度Urel（ms）。用單標吸量管和移液槍移取標準工作溶液于10 mL單標線容量瓶（A級）中，用乙腈定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為5、20、50、100、200 μg/L的標準系列溶液。由配制標準系列溶液引入的相對不確定度見表2。

2.2.1.4 標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度Urel（sv）。取對應(yīng)質(zhì)量濃度為5、20、50、100、200 μg/L的5種標準系列溶液各10 μL分別測定，根據(jù)相應(yīng)的色譜峰面積（Ai），擬合而成的線性回歸方程為A=aC+b，其中，a為斜率，b為截距，測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表3所示。由標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度為：

Urel（sv）=SRa1P+1n+（C0-C平）2ni=1（C0-C1）2

式中，SR為標準溶液峰面積殘差的標準差，計算方法為：

SR=ni=1[A-（aC+b）]2n-2

n為測定次數(shù)，該試驗中5個質(zhì)量濃度依次測定，n=15；p為對C的測定次數(shù)，p=6。

對設(shè)計陽性樣品中馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、水胺硫磷含量進行6次測定，根據(jù)峰面積大小，由線性回歸方程求得平均含量分別為0.048 57、0.065 34、0.043 14、0.058 36 μg/kg。

計算出元胡中馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、水胺硫磷標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分別為0.013 09、0.020 287、0.005 737、0.023 98。

2.2.1.5 標準物質(zhì)純度、配制、稀釋和擬合工作曲線的合成不確定度Urel（sp）。

Urel（sp）=Urel（p）2+Urel（v）2+Urel（ms）2+Urel（sv）246卷6期 刁銀軍等 UPLC-MS/MS法測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留的不確定度評定

根據(jù)上式計算出馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、水胺硫磷因標準物質(zhì)純度、配制、稀釋和擬合工作曲線引入的合成不確定度Urel（sp）分別為0.019 66、0.019 71、0.019 69、0.019 75。

2.2.2 樣品測定過程中引入的不確定度Urel（ss）。

2.2.2.1 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度Urel（m）。稱取5 g元胡樣品，天平校準證書說明最大允許誤差為±0.001，按照均勻分布計算，其不確定度U（m）=0.000 408 2，相對不確定度Urel（m）=0.000 081 65。

2.2.2.2 樣品體積量取產(chǎn)生的不確定度Urel（ssv）。

（1）樣品定容產(chǎn)生的不確定度。樣品經(jīng)過萃取、凈化后用刻度試管定容至1 mL，其體積允許誤差為±0.008 mL，按照均勻分布計算，不確定度為0.004 041，相對不確定度為0.004 041。

乙腈溶液的體積膨脹系數(shù)β乙腈/ ℃=1.37×10-3，實驗室溫度為（20±3）℃，假設(shè)溫度波動呈均勻分布，故由溫度引起的相對不確定度為0.002 373。

故由配制標準工作溶液時引入的相對不確定度為0.004 686 24。

（2）儀器進樣體積產(chǎn)生的不確定度。氣相色譜配備的微量注射器體積為10 μL，樣品上機進樣量為10 μL，微量注射器體積的相對標準偏差（RSD）為±1%，按矩形分布處理，則相對標準不確定度為0.005 8。

故由樣品體積量取產(chǎn)生的不確定度Urel（ssv）=0.007 457。

2.2.2.3 回收率產(chǎn)生的不確定度Urel（A）。將平均回收率A、標準偏差S（A）結(jié)果分別代入公式U=S（A）/3和Urel（A）=U（A）/A，計算得到回收率引入的不確定度和相對不確定度，結(jié)果見表4。

2.2.2.4 重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度Urel（w）。對設(shè)計陽性樣品中馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、水胺硫磷含量進行6次測定，重復(fù)測定產(chǎn)生的不確定度Urel（w）見表5。相對不確定度分量及合成不確定度見表6。

2.2.3 合成不確定度。計算公式如下： Urel=Urel（p）2+Urel（v）2+Urel（ms）2+Urel（sv）2+Urel（m）2+Urel（ssv）2+Urel（A）2+Urel（w）2

2.2.4 擴展不確定度。根據(jù)依據(jù)JJF 1135—2005，對于大多數(shù)測定采用包含因子k=2衡量，則元胡中有機磷含量的擴展不確定度U=Urel×2×X，由此得到氣相色譜法測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留含量結(jié)果見表7。

2.2.5 測定結(jié)果報告。元胡中馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、水胺硫磷4種有機磷農(nóng)藥殘留含量檢測結(jié)果分別為（0.048 57±0.011 55）、（0.065 34±0.016 41）、（0.043 14±0.011 02）、（0.058 36±0.013 02）μg/kg。

2.2.6 不確定度影響因素分析。由圖2可知，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定元胡中有機磷殘留含量產(chǎn)生不確定度的因素有8種，分別為由標準品純度、標準儲備液定容、標準系列溶液配制、標準曲線擬合、樣品稱量、體積量取、回收率、重復(fù)性所產(chǎn)生的不確定度，其不確定度在0.000 082～0.011 640，其中由回收率和重復(fù)性所產(chǎn)生的不確定度相對較大，最大的為添加回收產(chǎn)生的不確定度。三唑磷的不確定度的評估中因為整體的不確定度的水平較低，因而稱樣中的不確定度所占的比重比馬拉硫磷、氧化樂果、水胺硫磷大。

3 結(jié)論

元胡中有機磷殘留測定試驗過程中，稱量、提取、凈化、測定等過程均會引入不確定度，通過對實驗室溫度、玻璃儀器、溶液配制、稀釋、重復(fù)測定、回收率、質(zhì)量、體積等因素的考察，發(fā)現(xiàn)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定元胡中4種有機磷農(nóng)藥殘留含量方法中，標準曲線擬合過程和標準溶液配制所產(chǎn)生的不確定度最大，其次為測量重復(fù)性和體積量取引入的不確定度分量。因此，在實際操作過程中，可通過增加混合標準系列溶液的測定次數(shù)，增加平行樣品測定，保持超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器較高的靈敏度，并定期對所涉儀器進行檢定和提高操作人員的熟練水平，減小測量不確定度，從而保證檢測結(jié)果的準確性。

參考文獻

[1] 梅明清，林敏莉，林鮑才，等.元胡高產(chǎn)高效栽培技術(shù)[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2013（3）：119-120.

[2] 李松濤，張芳，楊洋.HPLC測定不同產(chǎn)地土元胡中原阿片堿含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（14）：139-141.

[3] 施菁，王瑋，陳柳蓉，等.白花土元胡藥材中延胡索甲素和乙素的含量測定[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22（2）：199-201.

[4] 肖杰明，潘建明.不同方法對元胡中生物堿提取率的影響[J].中成藥，2008，30（1）：135-137.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[6] 范卓文，武斌.延胡索藥理研究及臨床應(yīng)用進展[J].黑龍江醫(yī)藥，2007，20（5）：522-524.

[7] 王賽妮，李蘊成.我國農(nóng)藥使用現(xiàn)狀、影響及對策[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（20）：3853-3855.

[8] 伍一軍.有機磷農(nóng)藥對人類健康的危害[C]//農(nóng)業(yè)與環(huán)境安全國際學(xué)術(shù)研討會論文集.北京：北京農(nóng)藥學(xué)會，2003：79-82.

[9] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國計量出版社，2012.

[10] 中國合格評定國家認可委員會.化學(xué)分析中不確定度的評估指南：CNAS-GL06：2006[S].北京：中國標準出版社，2006.

[11] 舒平，楊衛(wèi)花，徐幸.氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定核桃油中酚類抗氧化劑的不確定度評估[J].食品科學(xué)，2016，37（6）：194-198.

[12] 楊秀梅，劉養(yǎng)仲，孫德剛，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定兔肉中氟苯尼考含量的不確定度評估[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2016，7（2）：612-616.

[13] 劉黎，鄧可.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定番茄中腐霉利農(nóng)藥殘留量的不確定度評定[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37（8）：55-58.

[14] 寧霄，金紹明，梁瑞強，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中β-受體激動劑殘留量的不確定度分析[J].食品科學(xué)，2017，38（6）：315-320.

[15] 郭麗娜，劉成文，符元春.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的不確定度評定[J].現(xiàn)代食品，2017（2）：101-105.

[16] 趙健，付巖，張亮，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定元胡中19種農(nóng)藥殘留量[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2017，38（1）：43-48.