基于原球莖培養(yǎng)的白芨育苗技術(shù)研究

江本利，於春，王紅娟，朱加保，路獻(xiàn)勇，胡積送，閆曉明

摘要 [目的]研究白芨原球莖增殖液體培養(yǎng)及原球莖直播育苗技術(shù)。[方法]通過正交試驗(yàn)篩選MS培養(yǎng)基濃度、馬鈴薯汁濃度及KT濃度，對原球莖增殖液體培養(yǎng)進(jìn)行研究；通過單因素試驗(yàn)篩選原球莖直播育苗的播種基質(zhì)。[結(jié)果]白芨原球莖增殖液體培養(yǎng)各因素的優(yōu)勢組合為MS + KT 1.0 mg/L +馬鈴薯汁120 g/L；白芨原球莖直播有比較優(yōu)勢的基質(zhì)為腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L +香蕉汁100 g/L。[結(jié)論]白芨原球莖增殖液體培養(yǎng)及原球莖播種育苗的技術(shù)路線在生產(chǎn)上具有可行性，該方法簡化了培養(yǎng)程序。

關(guān)鍵詞 原球莖； 增殖； 育苗

中圖分類號 S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0039-04

Study on Seeding Technique of Bletilla striata Based on Protocorm Cultivation

JIANG Benli，YU Chun，WANG Hongjuan et al （Cotton Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）

Abstract [Objective] To study the Bletilla striata protocorm liquid cultivation and protocorm direct seeding technique.[Method] Orthogonal test was used to screen the concentrations of MS medium，potato juice and KT，so as to study the protocorm liquid proliferation cultivation.Single factor test was used to screen the seeding mediumn of protocorm.[Result] The most suitable factor combination for Bletilla striata protocorm liquid culture was MS + KT 1.0 mg/L + potato juice 120 g/L，and the most suitable matrix for Bletilla striata seeding was humus soil 50% + scraps of wood 50%+NAA 0.5 mg/L + banana juice 100.0 g/L.[Conclusion] The technology route of Bletilla striata protocorm liquid cultivation and protocorm seedlingraising was feasible in production，which simplified the cultivation procedure.

Key words Protocorm；Proliferation；Seedling cultivation

白芨（Bletilla striata）是蘭科白芨屬植物，多年生草本，其干燥假鱗莖為我國民間傳統(tǒng)中藥材[1]，具有極高的藥用價(jià)值，其味苦、甘、澀，性涼，歸肺、胃、肝經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌的功能，主治肺胃出血、外傷出血、癰腫瘡瘍、皮膚皸裂、水火燙傷等[2-4]。近年來，隨著醫(yī)藥、化工技術(shù)水平及生活質(zhì)量的提高，白芨在醫(yī)藥工業(yè)、化妝品工業(yè)、觀賞園藝等領(lǐng)域的應(yīng)用迅速擴(kuò)大[5]，導(dǎo)致需求激增，而大量的白芨原料供給只能通過人工栽培獲得。

成熟的育苗技術(shù)是白芨人工栽培必不可少的支撐條件。然而白芨分株移栽，繁殖系數(shù)太小；白芨種子非常細(xì)小且無胚乳，在自然條件下萌發(fā)困難，繁殖效率低。白芨的繁育特性抬高了批量育苗的技術(shù)門檻。近年來，各種組織培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用于白芨快速繁育研究，在促使白芨種子萌發(fā)、細(xì)胞誘導(dǎo)、芽根分化等方面取得了較大進(jìn)展[6-9]，形成了無菌萌發(fā)→瓶苗培育（壯苗增殖、芽誘導(dǎo)、根誘導(dǎo)）→煉苗移栽為主要路線的育苗模式，初步實(shí)現(xiàn)了批量育苗。但因?yàn)槠棵甾D(zhuǎn)接較多、操作繁瑣、無菌保持及褐化控制等技術(shù)要求高，所以育苗成本很高。為了最大限度地降低人工及環(huán)境控制成本，筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，提出以原球莖誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)為重點(diǎn)，探索原球莖直播方法，從而簡化白芨繁育流程，完善育苗技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試白芨蒴果采自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所安慶基地種質(zhì)資源圃，胚齡（從開花開始計(jì)算）達(dá)20周，未開裂，果莢飽滿，外表無霉變，顏色為黃綠色與褐色相間，4 ℃冷藏放置。

取白芨成熟未開裂蒴果，用自來水洗凈，經(jīng)洗衣粉水浸泡 20 min，自來水反復(fù)沖洗，用衛(wèi)生紙吸干水分，置超凈工作臺上，用75%酒精浸泡的棉球擦表皮2次，然后用0.1%的升汞浸泡10 min，依次用無菌水反復(fù)沖洗5次，然后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分。在無菌條件下，用解剖刀切開蒴果，將種子用0.09%的無菌瓊脂水混懸，形成均勻一致的種子懸液，種子濃度定量按蒴果4個(gè)/L配制。借鑒魯光耀等[10]、張宇思等[11]研究結(jié)果，采用液體培養(yǎng)法，用移液槍吸取種子懸液，播于1/2MS + 100g/L 馬鈴薯汁 +20 g/L 蔗糖，pH 5.8的液體培養(yǎng)基中，22 ℃，100 r/min，光照12 h/d培養(yǎng)。7～10 d可見種子吸水膨脹，經(jīng)30 d培養(yǎng)種子由原來的黃褐色變成淡綠色，繼而成為小球體狀（即原球莖）。此時(shí)的原球莖即為試驗(yàn)研究的無菌材料。

1.2 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)過程分為2個(gè)階段，第一階段原球莖增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)，第二階段原球莖播種。具體步驟如下：

1.2.1 原球莖增殖液體培養(yǎng)。以培養(yǎng)基濃度類別、有機(jī)物添加劑馬鈴薯汁濃度、細(xì)胞分裂素KT濃度為因素，每因素3水平，設(shè)計(jì)L9（3）3正交試驗(yàn)（表1）。將預(yù)先培養(yǎng)的原球莖（黏連在一起的原球莖切開）按100粒/處理準(zhǔn)備9個(gè)處理，在超凈臺上用無菌吸水紙吸至恒重，稱量并記錄鮮重G1，接種于液體培養(yǎng)基。其他培養(yǎng)條件如下：NAA 0.1 mg/L，AC 0.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃滅菌20 min，光照度為 2 500 lx，光照時(shí)間為 12 h/d，100 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)原球莖生長數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)增殖后原球莖數(shù)量、稱量各處理原球莖總鮮重G2，計(jì)算增重率（G2-G1）/G1×100%；每處理隨機(jī)選取 50 粒原球莖，利用游標(biāo)卡尺測量原球莖的粒徑，并對原球莖的其他直觀生長狀況進(jìn)行描述。

1.2.2 原球莖固體壯苗培養(yǎng)。將各配方培養(yǎng)所得的原球莖轉(zhuǎn)移到MS + 蔗糖30 g/L固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH 5.8，溫度22 ℃，相對濕度 55%～75%，光照度 2 500 lx，光照周期為 10 h/d，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。

1.2.3 原球莖播種。采用3種播種基質(zhì)，分別為：A： 腐殖土+NAA 0.5 mg/L澆灌；B：腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L澆灌；C：腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L澆灌+ 10%濃度香蕉汁澆灌。將基質(zhì)濕熱滅菌，裝于105孔穴盤；經(jīng)壯苗培養(yǎng)15 d的原球莖開蓋煉苗3 d后，取出原球莖，洗凈黏附基質(zhì)，隨機(jī)播于穴盤中，100顆/穴盤，每處理3次重復(fù)；置于溫度 25 ℃，相對濕度 55%～75%，光照度 2 500～3 000 lx，光照周期10 h/d的溫室培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計(jì)生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用 SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 因素對原球莖增殖的影響 從圖 1 可以看出，接種后經(jīng)增殖培養(yǎng)30 d，原球莖實(shí)現(xiàn)了增殖，新增原球莖不同程度叢生黏連，顏色從白色到淺綠、深綠不一。根據(jù)表2正交試驗(yàn)方案結(jié)果可知，2號、3號及9號處理原球莖數(shù)量增加較多，7號、1號處理原球莖數(shù)量增加較少；9號、8號處理原球莖增重較多，1號、4號及7號處理增重較少；9號、3號處理原球莖粒徑較大，1號、8號、7號處理粒徑較小。綜合來看，9號處理在增殖及生長方面都有優(yōu)勢。

極差分析結(jié)果（表3）顯示，各因素對原球莖數(shù)量增加的影響程度由高到低依次為馬鈴薯汁濃度、KT濃度、培養(yǎng)基濃度；各因素對原球莖增重率的影響程度由高到低依次為馬鈴薯汁濃度、培養(yǎng)基濃度、KT濃度；各因素對增殖培養(yǎng)中原球莖粒徑的影響程度由高到依次為馬鈴薯汁濃度、KT濃度、培養(yǎng)基濃度。

對3個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)作進(jìn)一步方差分析可知，馬鈴薯汁濃度對原球莖數(shù)量增加、增重及粒徑大小的影響均達(dá)到顯著水平（P<0.05） ，KT濃度對原球莖數(shù)量增加、粒徑大小的影響均達(dá)到顯著水平（P<0.05），與極差分析結(jié)果一致。

綜上所述，該試驗(yàn)中馬鈴薯汁濃度對原球莖增殖影響最大，KT濃度主要影響數(shù)量增加，MS對原球莖增殖培養(yǎng)影響較小。白芨原球莖增殖液體培養(yǎng)可在處理9的因素組合下進(jìn)行，即MS + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L +馬鈴薯汁120 g/L +AC 0.5 g/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃下滅菌20 min，光照度為 2 500 lx，光照時(shí)間 12 h/d，100 r/min 。

2.2 播種基質(zhì)對出苗的影響 由表4可知，原球莖播種1個(gè)月后可以實(shí)現(xiàn)育苗，3 種基質(zhì)上播種出苗情況差異達(dá)極顯著水平，基質(zhì)C出苗率極顯著優(yōu)于基質(zhì)A，基質(zhì)C、B生根率極顯著優(yōu)于基質(zhì)A。苗情生長如圖1所示，基質(zhì)C上的幼苗葉片顏色、厚度均優(yōu)于基質(zhì)B，而基質(zhì)B優(yōu)于基質(zhì)A。

3 討論

白芨種子萌發(fā)成苗期間，原球莖是形態(tài)發(fā)育的典型階段，此階段白芨可向根芽分化方向生長、也可向原球莖自身增殖方向生長[12-13]。據(jù)此特點(diǎn)，在種子萌發(fā)誘導(dǎo)原球莖的成熟技術(shù)基礎(chǔ)上，筆者研究了原球莖增殖與播種技術(shù)，探討原球莖作為白芨“種子”播種育苗的可行性。

研究結(jié)果顯示，各濃度的液體MS培養(yǎng)基都能支持白芨原球莖的增殖生長，但相互之間差異并不顯著，與張宇思等[11]研究結(jié)果不同。這可能是因?yàn)轳R鈴薯汁有機(jī)營養(yǎng)充足，致使培養(yǎng)基的作用弱化，需要進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。 研究結(jié)果還顯示，適宜濃度的有機(jī)添加物馬鈴薯汁與KT在原球莖增殖生長中具有重要作用。馬鈴薯汁濃度高，則增殖生長較旺盛，這可能與復(fù)合營養(yǎng)供給充足、有利于增殖生長的各因素比例適當(dāng)、符合生長需求、協(xié)同效應(yīng)好有關(guān)；1.5 mg/L KT濃度的原球莖數(shù)量與質(zhì)量增長弱于1.0 mg/L KT，可能出現(xiàn)了類似于固體培養(yǎng)時(shí)發(fā)生的玻璃體現(xiàn)象，抑制了原球莖生長。原球莖播種試驗(yàn)顯示，增強(qiáng)通透性（添加木屑）和澆灌有機(jī)質(zhì)有利于播種成苗，這可能是因?yàn)檩^好的通透性與香蕉汁均有利于生根，這與袁寧[14]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

該研究通過液體培養(yǎng)方式對白芨原球莖增殖培養(yǎng)的 3個(gè)影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明MS + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L + 馬鈴薯汁120 g/L +AC 0.5/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃下滅菌20 min，光照度為 2 500 lx，光照時(shí)間 12 h/d，100 r/min條件下進(jìn)行原球莖液體培養(yǎng)可較好的實(shí)現(xiàn)增殖。單因素原球莖直播育苗試驗(yàn)結(jié)果顯示，基質(zhì)C，即腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L澆灌+ 10%濃度香蕉汁澆灌育苗效果較好。

白芨原球莖增殖液體培養(yǎng)及原球莖播種育苗的技術(shù)路線生產(chǎn)上具有可行性，培養(yǎng)程序及操作較傳統(tǒng)組培育苗相對簡化，降低了育苗成本。但影響白芨原球莖誘導(dǎo)、增殖及進(jìn)一步分化成苗的因素較多[15]，如培養(yǎng)基配方、激素配比、碳氮比例調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)、污染控制、玻璃化、褐化控制以及培養(yǎng)溫度、光照、培養(yǎng)方式（固體或液體）等都會影響育苗，僅幾次簡單試驗(yàn)無法探討清楚，因此原球莖播種育苗技術(shù)仍需進(jìn)一步研究。

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