我國金銀花分子生物學研究進展

董薇

摘要 綜述了DNA條碼、分子標記、液相色譜技術等分子生物技術在金銀花中的應用，并簡述了金銀花組培快繁技術、金銀花功能基因克隆情況，為更深入地開展金銀花研究奠定理論基礎。

關鍵詞 金銀花；組培快繁技術；分子生物技術；基因克隆

中圖分類號 S567.7+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0015-04

Abstract The application of molecular biology techniques such as DNA barcodes，molecular markers and liquid chromatography techniques in Lonicera japonica was reviewed.The rapid propagation of Lonicera japonica tissue culture and the cloning of functional genes of Lonicera japonica were briefly described，which lays a theoretical foundation for the further study of Lonicera japonica.

Key words Lonicera japonica；Rapid propagation technology of tissue culture； Molecular biology technology；Gene cloning

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物[1]。金銀花的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱的功效，為常用的大宗中藥材。中國各省均有分布，種植區(qū)域主要集中在山東、陜西、河南、河北、湖北、江西、廣東等地。分子生物手段在金銀花中的應用雖然較晚，但已經(jīng)在金銀花快繁、金銀花鑒定等方面取得了顯著成果。為今后更深入地開展金銀花研究，筆者對分子技術在金銀花研究中取得的進展進行了綜述。

1 金銀花組培快繁技術

脫毒和離體快繁是植物組織培養(yǎng)應用最多、最廣泛和最有效的一個方面。脫毒苗具有無雜菌、適應能力較強、繁育較快、質(zhì)量優(yōu)、抗性好等優(yōu)點。近年來，金銀花脫毒快繁、工廠化育苗有很大的發(fā)展。金銀花不同部位的外植體在金銀花組培快繁中均有應用，但誘導率不同，幼葉最易誘導愈傷組織[2]，易滅菌且萌發(fā)力強的當年嫩枝也可以成功誘導[3-5]，外植體木質(zhì)化和半木質(zhì)化莖段以4～6 mm為宜，未木質(zhì)化和頂芽莖段的大小以操作方便為宜[6]，頂芽通過誘導生芽、增殖培養(yǎng)、誘導生根，也可以得到金銀花幼苗[7-8]。

誘導增殖培養(yǎng)基一般是以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加激素種類有6-BA、2，4-D、NAA、IBA、IAA、KT等，誘導幼葉愈傷使用MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L[2]，誘導頂芽外植體愈傷組織選擇最優(yōu)培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA[3]。楊冬業(yè)等[5]使用MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.01～0.05 mg/L進行不定芽的誘導，誘導率為100%；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01～0.05 mg/L 適合繼代壯苗培養(yǎng)；1/2 MS+IBA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 適合金銀花的生根誘導培養(yǎng)。王文靜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，誘導紅金銀花頂芽生芽培養(yǎng)基為MS+KT 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+α-NAA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS+KT 1.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+α-NAA 0.3 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+α-NAA 2.0 mg/L + IAA 0.15～0.20 mg/L。劉敏杰[8]分析得出，以金銀花的芽尖誘導叢生芽培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 3.0 mg/L+0.15%活性炭培養(yǎng)基。趙先海等[4]研究表明，適合誘導的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L；較好的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，芽健壯整齊，增殖系數(shù)可達4.5左右；較好的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L，生根率達90%以上。任斌[9]以金銀花試管苗帶腋芽莖段為外植體，研究指出金銀花經(jīng)腋芽擴繁的最佳培養(yǎng)基為B5+NAA 0.05 mg/L+BA 2.0 mg/L+GA 31.0 mg/L，繁殖系數(shù)達4.1；另外研究萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和多效唑（MET）對組培苗生根的影響，不同濃度的激素配比對組培苗根系指標影響不同，結果表明，生根率、主根數(shù)、須根數(shù)為統(tǒng)計指標最佳培養(yǎng)基配比中激素濃度差別很大[10]。

金銀花的組織培養(yǎng)中，防止組織褐變是培養(yǎng)成功的關鍵技術之一。王鵬等[6]研究表明，0.1% Vc和0.3%活性炭在紅金銀花的組織培養(yǎng)中可有效地防止外植體組織褐化；2 mg/L 6-BA 易引發(fā)褐變，2 mg/L KT 和2 mg/L α-NAA 對組織褐變影響與對照相比差異不大；采用仿自然氣候（20 ℃-1 500 lx-4 h-85%→25 ℃-2 000 lx-8 h-85%→20 ℃-1 500 lx-4 h-85%→18 ℃-0 lx-8 h-85%）培養(yǎng)可有效抑制褐變的發(fā)生。

2 分子生物技術在金銀花鑒定中的應用

2.1 DNA條碼在金銀花鑒定中的應用

DNA分子鑒定技術用于物種鑒定具有準確可靠、重復性高等優(yōu)點。以ITS2為主體的中藥材DNA條形碼鑒定新方法體系和數(shù)據(jù)庫平臺已獲準納入《中華人民共和國藥典》。宋雯舒等[11]提取金銀花、山銀花對照藥材及河北和山東產(chǎn)地金銀花樣品DNA，檢測DNA濃度和純度，采用基于聚合酶鏈式反應（PCR）方法的DNA分子標記技術鑒別樣品。崔志偉等[12]研究ITS2和psb A-trn H作為鑒定金銀花不同品種的優(yōu)勢條形碼組合，不同品種金銀花ITS2和psb A-trn H序列的擴增成功率為100%，測序成功率分別為72.7%、91.0%，且兩者均存在較多的變異位點。胡凱等[13]探討B(tài)ar-HRM聯(lián)用技術在金銀花及山銀花藥材鑒別中的應用，發(fā)現(xiàn)利用psb A -trn H 序列設計引物，HRM 曲線能夠區(qū)分不同的金銀花和山銀花藥材品種，Bar-HRM能在金銀花類藥材混合物中檢測出低至5%的山銀花樣品，說明Bar-HRM在金銀花及山銀花藥材品種的分類、鑒別上具有可靠的分辨能力，適用于金銀花及山銀藥材摻混的快速鑒定，能夠?qū)崿F(xiàn)一管式閉合分析。

2.2 分子標記在金銀花鑒定中的應用

利用簡單有效的方法鑒定藥用植物種及其變種一直是中藥材鑒定首先要解決的問題。EST-SSR多態(tài)位點多，信息量大，遺傳變異信息豐富，并且檢測快速、穩(wěn)定，常用來鑒定藥材品種。蔣超等[14]通過生物信息學手段對實驗室保存的忍冬及其變種紅白忍冬（L.japonica var. chinensis Thunb.）EST序列進行分析，共獲得3 705條忍冬EST-SSRs，2 818條紅白忍冬 EST-SSRs；分析結果表明，金銀花及其變種紅白忍冬主要SSR重復為二核苷酸，其次為三核苷酸，主要重復基序類型為AG/TC和GAG/TCT；通過同源比對，在忍冬及其變種中共篩選出87對重復次數(shù)具有差異的EST-SSR；選出15對堿基數(shù)差異大于6的EST-SSR進行驗證，結果表明其中的13對引物在52份金銀花類藥用植物中具有有效擴增產(chǎn)物，且引物Jp.ssr4、Jp.ssr64及Jp.ssr65可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。徐石勇等[15]以金銀花及其常見變種為材料，利用SSR標記技術構建分子指紋圖譜，并用于遺傳多樣性分析；選擇25個SSR位點用于多態(tài)性分析，其中3個位點具有較強多態(tài)性，并構建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，包括3對引物在6個供試材料中擴增到的18條多態(tài)性條帶信息；應用該指紋圖譜對金銀花及其變種的遺傳多樣性進行分析，結果表明，金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠，僅0.28；應用該指紋圖譜對87個市售金銀花進行分析，能夠區(qū)分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。

ISSR分子標記能夠靈敏地揭示2個親緣關系十分相近個體之間的差異，可以應用于金銀花樣品間遺傳多樣性分析，分析金銀花種內(nèi)不同地域或不同植物來源的材料間存在的遺傳差異，為金銀花的種質(zhì)資源鑒定、遺傳關系分析及栽培育種提供分子生物學依據(jù)。王湘瑩等[16]采用ISSR標記技術從100個引物中篩選出10個重復性高、擴增效果好的引物，對23個金銀花品種的樣本進行PCR擴增，23個金銀花品種間的遺傳相似系數(shù)為0.471 3～0.100 0，平均遺傳相似數(shù)為0.629 9，平均基因多樣度（He）和Shannon多樣性指數(shù)分別是0.379 3和0.556 3，表明品種間的遺傳基礎較寬及遺傳多樣性較高；聚類分析（UPGMA）表明，23個供試金銀花品種劃分為忍冬、美國忍冬、灰氈毛忍冬3大類。韓琳娜等[17]應用ISSR分子標記技術對三大道地產(chǎn)區(qū)的27個金銀花原植物種質(zhì)資源進行遺傳多態(tài)性、相似性和聚類分析，篩選出16個多態(tài)性引物，獲得344條帶，多態(tài)性比率為88.4%；遺傳相似系數(shù)為0.50～0.90；聚類分析表明，27個品種被分為2個類群。孫稚穎等[18]對采自金銀花主產(chǎn)區(qū)的18農(nóng)家品種及野生忍冬和近緣種灰氈毛忍冬共計36個樣品進行ISSR-PCR分析，采用NTSYS-pc軟件計算金銀花不同農(nóng)家品種及近緣種間的Jaccard遺傳相似系數(shù)，按非加權配對算術平均法（UPGMA）建立所研究類群的系統(tǒng)聚類圖；使用12條引物共擴增出129個條帶，其中多態(tài)帶為114條，占總擴增條帶數(shù)的88.37%；從聚類分析圖可以看出，金銀花不同樣本首先聚在一起，表明是一自然類群；野生忍冬與栽培品種具有明顯的遺傳差異；主產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)品系毛花系列遺傳相對較穩(wěn)定，而雞爪花系列品種繁雜，遺傳變異大；新品種九豐一號已獨立成一穩(wěn)定品種。

RAPD分子標記已經(jīng)在作物品種或種子純度鑒定方面廣泛應用，這種檢測方法簡便快速，但是存在條帶穩(wěn)定性差、飾演重復性低等問題[19-22]。為了保證檢驗結果的準確性和可重復性，可以采取保證反應條件一致，多次重復每個引物，放棄重復性低的模糊條帶，統(tǒng)計穩(wěn)定出現(xiàn)、重復性高的條帶并進行遺傳分析。王一斐等[19]利用RAPD分子標記技術對膠東地區(qū)31個金銀花品種的遺傳多樣性及遺傳關系進行研究，聚類分析結果表明，31個金銀花品種可以分為兩大類：采自昆崳山太白頂?shù)慕疸y花品種為一類，其余30個金銀花品種為一類；從遺傳距離來看，采自昆崳山太白頂?shù)钠贩N與中醫(yī)世家引進金銀花品種大毛花遺傳距離最遠，為2.507；采自龍口蘭高鎮(zhèn)馬藺塂（Ⅱ）與中醫(yī)世家引進金銀花品種四季豐遺傳距離最近，為0.020；不同金銀花種源間具有較高的遺傳多樣性，不同金銀花種源間的遺傳關系與地理分布有一定的相關性。

2.3 液相色譜技術在金銀花鑒定中的應用

高效液相色譜（HPLC）法具有分離效率高、速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性和可重復性好、流動相選擇性廣、檢測器種類多、色譜柱可反復使用等特點，現(xiàn)已成為研究中藥指紋圖譜的重要手段之一。趙君峰等[23-24]采用HPLC法測定10個不同商品來源的金銀花樣品，建立川渝地區(qū)金銀花藥材甲醇溶解部分的HPLC指紋圖譜；色譜條件為C18柱，甲醇-1%磷酸為流動相進行梯度洗脫，檢測波長237 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃；該方法能夠很好地分離川渝地區(qū)金銀花的主要成分；不同產(chǎn)地金銀花藥材指紋圖譜相似度較好，建立了含有11個特征指紋峰的川渝地區(qū)金銀花標準指紋圖譜。楊欣欣等[25]采用指紋圖譜技術對不同產(chǎn)地金銀花藥材進行分析比較，采用Agilent TC-C18色譜柱，流動相為0.5%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫，波長為327 nm，對14種不同產(chǎn)地金銀花藥材進行測定，建立金銀花藥材指紋圖譜，并確定14種不同產(chǎn)地金銀花藥材的18個共有峰，且14種金銀花藥材的指紋圖譜相似度為0.9以上；不同產(chǎn)地金銀花藥材的指紋圖譜存在明顯差異，又存在一定程度的相關性。何兵等[26]以綠原酸為參照物建立金銀花HPLC指紋圖譜，同時以斜率校正法建立綠原酸與其余8個成分（新綠原酸、隱綠原酸、當藥苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）的相對校正因子，計算其含量，實現(xiàn)一測多評；同時采用外標法測定該9個成分的含量，并比較二者的差異；建立了金銀花HPLC特征指紋圖譜共有模式，標定了21個共有峰，指認了其中9個共有峰，20批金銀花的相似度為0.959～0.997；20批金銀花中9個成分的計算值與實測值間無顯著差異；驗證了一測多評法的準確性和可行性。黃海燕等[27]通過指紋圖譜比較金銀花和山銀花的質(zhì)量，對50批樣品進行指紋圖譜分析，木犀草苷分析系統(tǒng)說明金銀花與山銀花有共同的有效成分物質(zhì)基礎，該系統(tǒng)指紋圖譜不能區(qū)別具體品種；皂苷分析系統(tǒng)中不同品種的指紋圖譜有較明顯的區(qū)別，可用于金銀花與山銀花具體品種的鑒別參考。宋雯舒等[11]以綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙為指標成分，利用HPLC測定指標成分含量，結果發(fā)現(xiàn)，河北和山東產(chǎn)地金銀花中綠原酸質(zhì)量分數(shù)為3.1%～3.3%，河北、山東產(chǎn)地金銀花中木犀草苷質(zhì)量分數(shù)分別為0.049%～0.050%、0.069%～0.078%。

韓永成等[28]采用UPLC指紋圖譜方法，Agilent C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相乙腈-0.2%磷酸水，以0.4 mL/min的流速進行梯度洗脫，檢測波長238 nm，柱溫30 ℃；在21 min內(nèi)得到金銀花藥材的指紋圖譜，對其中5個色譜峰進行了初步歸屬，并對14批藥材樣品進行了分析，其相似度為0.915～0.987。UPLC指紋圖譜方法較HPLC大大縮短了分析時間。

3 金銀花功能基因克隆情況

基因克隆是分子育種的基礎。吳敏琳等[29]以不同產(chǎn)地及品種的金銀花為材料，通過RT-PCR法擴增其HQT基因編碼區(qū)，直接測序，發(fā)現(xiàn)HQT基因編碼區(qū)變異包括堿基置換突變、插入/缺失突變，部分變異會引起HQT蛋白的改變，并影響綠原酸的表達量。蔣向輝等[30]采用RT-PCR和RACE技術，首次從金銀花中克隆丙酮酸激酶基因全長cDNA，命名為LiPkc（GenBank登錄號JQ621946.1），LiPkc基因編碼區(qū)序列全長為1 533 bp，共編碼510個氨基酸；基于基因序列親緣關系分析結果顯示，LiPkc基因與煙草Pkc基因親緣關系最近，屬于雙子葉植物Pkc基因家族；蛋白質(zhì)亞細胞定位分析認為LiPkc在線粒體或葉綠體中發(fā)揮作用；LiPkc蛋白質(zhì)的三維空間結構預測結果顯示，LiPkc蛋白主要由α-螺旋、不規(guī)則盤繞組成；定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，LiPkc基因在金銀花不同組織中廣泛表達，但表達水平各有差異，黃花中表達量最高。劉霞宇等[31]選取金銀花的9個候選內(nèi)參基因Lonja.ACT11、Lonja.ACT2/7、Lonja.G6PD、Lonja.GAPDH、Lonja.MTP、Lonja.TUA、Lonja.UBQ10、Lonja.EF1A、Lonja.UBC，利用q RT-PCR技術及Ge Norm、Norm Finder軟件對它們的表達穩(wěn)定性進行分析評價，得出可選用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD組合作為內(nèi)參基因。喬中全等[32]根據(jù)已知的其他物種黃酮醇合成酶cDNA保守序列設計引物，用RT-PCR技術從金銀花葉片中擴增獲得黃酮醇合成酶基因部分cDNA序列，再用RACE技術獲得其兩端序列；序列拼接得到完整的1 248 bp的黃酮醇合成酶基因，根據(jù)獲得的序列，設計引物擴增獲得1 001 bp的開放閱讀框，編碼333個氨基酸；序列分析顯示，金銀花黃酮醇合成酶基因與煙草、馬鈴薯和桔梗的黃酮醇合成酶基因具有高度同源性。亓希武等[33]在藥用植物金銀花中克隆得到1條肌動蛋白（Actin）基因序列，命名為Lj Actin （Gen Bank 登錄號：KY114518），序列比對結果表明，金銀花的Actin和其他植物的Actin在序列上高度保守；進化分析結果表明，金銀花的Actin與擬南芥的At ACT7和水稻的Os ACT2聚為一支；RT-PCR結果顯示，Lj Actin在金銀花5個不同發(fā)育時期的花中表達穩(wěn)定。汪周勇等[34]從忍冬（Lonicera japonica Thunb.）轉(zhuǎn)錄組測序結果中分析獲得1個Fat B基因，分別以忍冬、紅白忍冬[Lonicera japonica Thunb.var.chinensis （Wats.） Bak.]、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）和水忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.）新鮮花蕾為材料，利用RT-PCR技術克隆獲得了LJFat B、LHFat B、LJCFat B、LDFat B基因的全長cDNA，并進行生物信息學分析，結果表明，LJFat B、LJCFat B、LHFat B 和LDFat B 與擬南芥At Fat B具有較近的親緣關系；LJFat B、LJCFat B、LHFat B和 LDFat B的核苷酸序列、蛋白特性及其二級結構有所差異，但其蛋白均具有保守的Fat B底物結合位點和催化活性位點，且在花蕾中的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異；因此推測LJFat B、LJCFat B、LHFat B 和 LDFat B 可能具有與At Fat B相同的生物學功能。莽草酸/奎寧酸香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）是金銀花中綠原酸合成途徑的關鍵酶。何柳等[35]利用已經(jīng)獲得的金銀花大量表達序列標簽（EST）數(shù)據(jù)，通過cDNA末端快速擴增（RACE）技術克隆金銀花HCT（LiHCT）基因。蔣向輝等[36]采用設計簡并性引物和RACE克隆相結合，從金銀花中克隆了捕光葉綠素a/b結合蛋白基因全長，命名為LjCad（Gen Bank登錄號：JQ621945.1）；基因全長為960 bp，開放閱讀框為798 bp，其編碼265個氨基酸，基因不含內(nèi)含子，屬于光系統(tǒng)Ⅱ的Cab基因；LjCad基因受光、6-BA、GA3和NAA誘導表達，但是黑暗和ABA激素處理對LjCad基因的表達沒有明顯的影響。齊琳潔等[37]通過生物信息學的方法從金銀花轉(zhuǎn)錄組中獲得4個DNA去甲基化酶基因，分別為LJDME1、LJDME2、LJDME3和LJDME4，并預測其編碼蛋白的理化性質(zhì)和表達模式；系統(tǒng)進化樹結果表明，LJDME1、LJDME2聚為一類，LJDME3、LJDME4聚為一類，與擬南芥中的DME關系更為密切；基因表達分析表明，4個DNA去甲基化酶基因在變種間差異表達明顯，LJDME1、LJDME2基因表達水平在紅金銀花中高于金銀花，推測其可能參與調(diào)控金銀花活性成分積累的過程，并且4個DNA去甲基化酶基因具有組織表達特異性。

4 我國金銀花研究中的問題和建議

金銀花藥用價值和保健用途廣泛，需求量不斷增加，種植面積不斷擴大。分子生物技術在金銀花繁殖、育種、分類、鑒定等方面的研究取得了一定進展，尤其是鑒定方面，現(xiàn)在已擁有DNA條碼、HPLC指紋圖譜等快速、穩(wěn)定、高效的金銀花種間、種內(nèi)鑒定技術。但與其他植物相比，金銀花的分子生物研究仍處于起步階段，如金銀花快繁研究沒有一套成熟的體系，關于金銀花遺傳圖譜構建、功能基因研究較少。在今后的金銀花研究中，一方面要在現(xiàn)有常規(guī)育種基礎上解決金銀花生產(chǎn)中的低產(chǎn)、染病等問題，同時分子生物輔助育種方面，如尋找綠原酸、木犀草苷緊密連鎖的分子標記或生化標記，克隆關鍵基因同步開展，以期更快地促進我國金銀花科學研究的發(fā)展。

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