四倍體馬鈴薯“合作88”P(pán)VY、PLRV抗性基因的基因型分析

羅杰　唐唯　王培　唐飛　李燦輝

摘要 [目的]分析四倍體馬鈴薯“合作88”P(pán)VY、PLRV抗性基因的基因型。[方法]利用969個(gè)自交分離群體株系，采用田間性狀調(diào)查、DAS-ELISA病毒檢測(cè)、抗性基因連鎖分子標(biāo)記檢測(cè)。[結(jié)果]田間調(diào)查PVY、PLRV抗病與感病的比為968.000∶1和41.130∶1，推測(cè)基因型分別為YYYy和RRrr，分離方式為染色單體隨機(jī)分離和染色體隨機(jī)分離；DAS-ELISA檢測(cè)PVY、PLRV陰性與陽(yáng)性的比為483.500∶1和19.617∶1，推測(cè)基因型分別為YYYy和RRrr，分離方式均為完全均衡式分離；分子標(biāo)記RYSC3檢測(cè)PVY抗性基因Ryadg有特異性和無(wú)特異性的比為322.000∶1，推測(cè)PVY基因型為YYYy，分離方式為完全均衡式分離；分子標(biāo)記DMB32-11檢測(cè)PLRV抗性基因Rlretb有特異性和無(wú)特異性的比為32.414∶1，推測(cè)PLRV基因型為RRrr，分離方式為染色體隨機(jī)分離。[結(jié)論]3種試驗(yàn)方法均表明四倍體馬鈴薯“合作88”P(pán)VY抗性基因的基因型是YYYy，PLRV抗性基因的基因型是RRrr，二者在遺傳分離時(shí)存在多種分離方式。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯；PVY；PLRV；抗性基因；基因型

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0098-04

Abstract [Objective] To analyze the genotype of PVY and PLRV resistance genes in tetraploid potato ‘Cooperation88. [Method] In this study， field investigation， DASELISA assays and resistance gene linked molecular marker detection were used to analyze 969 selfinbred lines. [Result] In field investigation， the ratios of PVY and PLRV resistance and susceptibility plants were 968.000∶1 and 41.130∶1， respectively. It was speculated that the resistance genotypes of PVY and PLRV were YYYy and RRrr， and the corresponding separation ways were chromatids random separation and chromosomes random separation. The DASELISA detection results showed that the PVY and PLRV infection ratios between negative and positive were 483.500∶1 and 19.617∶1. The deduced resistance genotypes of PVY and PLRV were YYYy and RRrr and they all run the complete equilibrium segregation way. The PVY resistance gene， Ryadg， had a genotype of YYYy and a ratio of 322.000 existence to 1 deficiency in self inbred lines according to the detection of PVY linked molecular marker RYSC3， segregated in a complete equilibrium segregation way. Meanwhile， PLRY linked molecular marker DMB3211 was used to check the ratio between the existence or deficiency of PLRV resistance gene Rlretb. The ratio was 32.414∶ 1. The result showed Rlretb may has a genotype of RRrr with the way of random chromosome segregation. [Conclusion] Three methods were used to investigate genotypes of PVY and PLRV resistance genes in potato cultivar ‘Cooperation 88. Each method can deduce to the same genotypes of PVY and PLRV （YYYy and RRrr）， and two potato virus genes shared several segregation ways during genetic reproduction.

Key words Potato；PVY；PLRV；Resistance genes；Genotype

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬茄科，原產(chǎn)于智利和安第斯山區(qū)，是全球四大糧食作物之一，從2005年起發(fā)展中國(guó)家的馬鈴薯生產(chǎn)就占全球主體地位[1-2]。馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）和馬鈴薯卷葉病毒（Potato Leafroll Virus，PLRV）主要依靠蚜蟲(chóng)傳播，PLRV也可以依靠摩擦傳播，由它們引起的馬鈴薯病害的危害程度僅次于晚疫病[3]。馬鈴薯被PVY和PLRV侵染后會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)量、品質(zhì)和商品性下降并且種質(zhì)資源衰減嚴(yán)重[4]。因此，馬鈴薯的抗病性便成為目前新品種選育的主要關(guān)注點(diǎn)之一。

四倍體馬鈴薯“合作88（Cooperation-88，簡(jiǎn)稱C88）”是云南師范大學(xué)、會(huì)澤縣農(nóng)技推廣中心和國(guó)際馬鈴薯中心合作選育的抗病害較高的馬鈴薯品種，具有馬鈴薯野生種S.andigena、S.demissum和普通栽培種S.tuberosum遺傳背景，基因組可能為異源四倍體[5]。C88為西南地區(qū)主栽品種，其抗病害研究對(duì)西南地區(qū)馬鈴薯的經(jīng)濟(jì)發(fā)展起了至關(guān)重要的作用。據(jù)云南省馬鈴薯品種區(qū)域試驗(yàn)表明，C88對(duì)PVY、PLRV具有抗性，但基因型并不清楚，相關(guān)研究報(bào)道較少[6]。PVY、PLRV為單基因控制，但PLRV抗性相關(guān)基因的表達(dá)存在修飾基因和環(huán)境的影響，同源四倍體單基因存在染色體隨機(jī)分離、染色單體隨機(jī)分離和完全均衡式分離3種分離方式[7-11]。筆者選用C88自交分離群體即自交一代相當(dāng)于F2代，進(jìn)行田間性狀調(diào)查、DAS-ELISA檢測(cè)及抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記相結(jié)合的方法來(lái)分析親本C88的PVY、PLRV抗性基因的基因型及遺傳分離方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料。四倍體馬鈴薯C88自交分離群體1 111個(gè)株系及親本C88（CK）。脫毒塊莖播種，時(shí)間：2017年3月18日，地點(diǎn)：云南師范大學(xué)馬鈴薯試驗(yàn)育種基地大田。調(diào)查期間不施任何藥物殺蟲(chóng)、殺菌。

1.1.2 主要試劑。DAS-ELISA試劑盒，由美國(guó)Agdia生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器。GF-M3000型號(hào)酶標(biāo)儀，由山東高密彩虹分析儀器有限公司生產(chǎn)；9700型號(hào)電泳儀，由中國(guó)北京六一公司生產(chǎn)；5418型高速離心機(jī)，由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；4200型凝膠成像系統(tǒng)，由上海天能公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 田間性狀調(diào)查。PVY、PLRV性狀統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1[12]。為了更準(zhǔn)確地分析C88抗性水平的表型并且排除復(fù)合感染或其他病毒侵染表現(xiàn)出的類似癥狀等，只將等級(jí)為3級(jí)及以上的株系作為發(fā)病處理。在現(xiàn)蕾期和開(kāi)花期之間記載，調(diào)查共分3次進(jìn)行，分別為2017年5月18日、6月2日、6月22日，取各等級(jí)下的發(fā)病株數(shù)平均值作為性狀調(diào)查記錄。

1.2.2 DAS-ELISA檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PVY、PLRV的檢測(cè)。提取液：帶皮塊莖1 g加10 mL裂解液（美國(guó)Agdia）研磨；顯色時(shí)間：以23 ℃顯色1 h的OD值進(jìn)行判定；結(jié)果判定：在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，樣品顯黃色且OD值為陰性O(shè)D值的2倍及以上判定為陽(yáng)性，即樣品侵染上了病毒。陽(yáng)性、陰性對(duì)照均來(lái)自美國(guó)Agdia公司提供的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 DNA制備。摘取新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法經(jīng)液氮研磨提取總DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.4 分子標(biāo)記檢測(cè)。引物相關(guān)信息見(jiàn)表2[14-15]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，1×PCR Mastermix（北京擎科新生物有限公司生產(chǎn)）22 μL，引物各1 μL（10 μmol/L，北京擎科新生物有限公司合成），模板DNA 1 μL（50 ng）。PCR擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性2 min；35個(gè)PCR循環(huán)（98 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s），72 ℃總延伸1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀調(diào)查、DAS-ELISA檢測(cè)、分子標(biāo)記結(jié)果分析

2.1.1 性狀調(diào)查。共種植1 111個(gè)株系，97個(gè)株系未出苗，35個(gè)株系在統(tǒng)計(jì)期間死亡，3次調(diào)查均統(tǒng)計(jì)的共969個(gè)株系，后續(xù)分析均用以上969個(gè)株系。田間調(diào)查結(jié)果表明：被PVY侵染的植株在葉背出現(xiàn)典型的葉脈壞死癥狀（圖1A）；被PLRV侵染的植株其葉片卷曲成匙狀或筒狀（圖1B）；沒(méi)被PVY或PLRV侵染的植株無(wú)任何癥狀（圖1C）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.2 DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)969個(gè)株系帶皮塊莖進(jìn)行了PVY、PLRV檢測(cè)，微孔板顯色結(jié)果表明：陽(yáng)性對(duì)照為黃色，陰性對(duì)照為無(wú)色，空白對(duì)照為無(wú)色，各OD值見(jiàn)圖3。直接觀察顯色和酶標(biāo)儀讀數(shù)表明：對(duì)照C88均沒(méi)有被PVY、PLRV侵染；969個(gè)株系中，2個(gè)株系被PVY侵染，47個(gè)株系被PLRV侵染。

2.1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果。對(duì)969個(gè)樣品提取DNA后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖4），表明DNA電泳條帶清晰，無(wú)拖尾、彌散，微量紫外分光光度儀測(cè)定OD260/OD280為1.7～1.8，可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.1.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果。標(biāo)記RYSC3檢測(cè)的969個(gè)株系中，沒(méi)有擴(kuò)增出條帶的有3個(gè)株系，即C88-11、C88-792和C88-1274；標(biāo)記DMB32-11檢測(cè)的所有株系中，沒(méi)有擴(kuò)增出條帶的有29個(gè)株系，即株系C88-174、C88-190、C88-202、C88-208、C88-329、C88-330、C88-331、C88-463、C88-464、C88-465、C88-466、C88-620、C88-625、C88-652、C88-653、C88-684、C88-710、C88-725、C88-726、C88-734、C88-746、C88-749、C88-765、C88-1112、C88-1286、C88-1360、C88-1364、C88-1369。分子標(biāo)記擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳示意圖分別見(jiàn)圖5、6。

2.2 C88對(duì)PVY、PLRV抗性基因的基因型分析

C88性狀統(tǒng)計(jì)、DAS-ELISA和分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，C88對(duì)PVY和PLRV具有較高抗性，PVY抗性基因的基因型可能為YYYy（Y為顯性基因，y為隱性基因）或YYyy，PLRV抗性基因的基因型可能為RRRr（R為顯性基因，r為隱性基因）或RRrr。田間性狀統(tǒng)計(jì)、DAS-ELISA及分子標(biāo)記分析得到PVY、PLRV抗性基因的基因型和分離方式匯總結(jié)果見(jiàn)表3。

單基因座上同源四倍體自交和遺傳的理論分離情況為：①親代基因型是AAAa時(shí)，處于染色體隨機(jī)分離、染色單體隨機(jī)分離、完全均衡式分離下的后代分離比分別為1.000∶0、783.000∶1、575.000∶1；②親代基因型是AAaa時(shí)，分別為35.000∶1、20.778∶1、19.250∶1；③親代基因型是Aaaa時(shí)，分別為3.000∶1、2.484∶1、2.408∶1[9-11]。

性狀調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)：①PVY抗病與感病的比968.000∶1，與理論值783.000∶1最接近，因此推測(cè)PVY的基因型為YYYy，分離方式為染色單體隨機(jī)分離；②PLRV抗病與感病的比為41.130∶1，與理論值35.000∶1最接近，因此推測(cè)PLRV的基因型為RRrr，分離方式為染色體隨機(jī)分離。

DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：①PVY檢測(cè)結(jié)果的陰性與陽(yáng)性比為483.500∶1，與理論值575.000∶1最接近，因此推測(cè)PVY的基因型為YYYy，分離方式為完全均衡式分離；②PLRV檢測(cè)結(jié)果的陰性與陽(yáng)性的比為19.617∶1，與理論值19.250∶1最接近，因此推測(cè)PLRV的基因型為RRrr，分離方式為完全均衡式分離。雖然DAS-ELISA是檢測(cè)植株是否攜帶病毒及病毒含量，與抗性基因的基因型沒(méi)有直接關(guān)系，但該結(jié)果也能間接反映出抗性基因與病毒互作間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：①分子標(biāo)記RYSC3檢測(cè)PVY抗性基因Ryadg得到的陽(yáng)性與陰性的比為322.000∶1，與理論值575.000∶1最接近，因此推測(cè)PVY的基因型為YYYy，分離方式為完全均衡式分離；②分子標(biāo)記DMB32-11檢測(cè)PLRV抗性基因Rlretb得到的陽(yáng)性與陰性的比為32.414∶1，與理論值35.000∶1最接近，因此推測(cè)基因型為RRrr，分離方式為染色體隨機(jī)分離。

3 結(jié)論與討論

田間性狀調(diào)查、DAS-ELISA、分子標(biāo)記的所有結(jié)果都表明：四倍體馬鈴薯“合作88”P(pán)VY抗性基因的基因型是YYYy，PLRV抗性基因的基因型是RRrr；親本C88對(duì)PVY、PLRV具有較高的抗性，符合文獻(xiàn)報(bào)道[6]。

在不施用任何殺蟲(chóng)劑和殺菌劑的情況下，PVY和PLRV在自然條件下理論上應(yīng)為隨機(jī)傳播。但PVY、PLRV的抗性也可能受環(huán)境影響，造成在不同種植季節(jié)的調(diào)查結(jié)果差異較大。該試驗(yàn)材料種植于春季，在調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)蚜蟲(chóng)較多，且由于分離群體的其他性狀均存在分離，如抗晚疫病水平、出苗時(shí)間不同等，因此PVY、PLRV在該試驗(yàn)中的性狀調(diào)查結(jié)果并不能完全準(zhǔn)確地反映出親本C88及自交分離群體的抗性水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證表型結(jié)果，筆者對(duì)所有材料進(jìn)行了病毒檢測(cè)，即DAS-ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明性狀調(diào)查結(jié)果較為準(zhǔn)確。RYSC3和DMB32-11分別為PVY抗性基因Ryadg和PLRV抗性基因Rlretb緊密連鎖的分子標(biāo)記，所以標(biāo)記的分離情況可以直接代表目的基因的基因型[14-15]。該研究用3種試驗(yàn)方法推測(cè)的分離比和遺傳分離方式不一致，表明在實(shí)際的減數(shù)分離中，由于著絲點(diǎn)與目的基因總存在一定距離，并不會(huì)都進(jìn)行交換，4個(gè)等位基因也都是隨機(jī)配對(duì)，所以會(huì)存在多種遺傳分離方式，這符合Little觀點(diǎn)[16]。

四倍體基因組雜合度較高，其基因型研究相對(duì)二倍體復(fù)雜，目前沒(méi)有合適的基因型-表型連鎖的QTL（Quantitative Trait Locus，數(shù)量性狀基因座）分析模型。因此該研究利用性狀調(diào)查、病毒檢測(cè)和與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記相結(jié)合的手段來(lái)分析四倍體馬鈴薯C88的PVY、PLRV抗性基因的基因型，結(jié)合理論的基因分離情況，得到了PVY和PLRV的基因型。單倍體馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表，一些基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的四倍體作圖方法也相繼被報(bào)道[17-18]。在后續(xù)研究中可將馬鈴薯基因組學(xué)用于重要農(nóng)藝性狀的QTL分析，從而為加快四倍體馬鈴薯育種提供參考依據(jù)。

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