超高效液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的7種酚類物質(zhì)

許永　孔維松　王晉　黃海濤　劉欣　李雪梅　楊葉昆　向明　田麗梅　李晶

摘要[目的]采用超高效液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的7種酚類物質(zhì)。[方法]卷煙主流煙氣中的酚類用劍橋濾片捕集，然后用自主設(shè)計的新型樣品前處理裝置以1%乙酸超聲提取，萃取液采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分離，以1%乙酸（內(nèi)含0.01moL/LB-CD）和70%乙腈（內(nèi)含1%乙酸和0.01moL/LB-CD）為流動相進行梯度洗脫，卷煙主流煙氣中的主要7種酚類物質(zhì)在5.0min內(nèi)可達到基線分離。[結(jié)果]采用新的樣品前處理裝置可以有效簡化前處理步驟，提高分析效率；7種酚類物質(zhì)在濃度為0.02～25.00μg/mL時具有較好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)>0.99900；檢出限為2.5～6.5μg/L；在不同添加水平下，平均回收率為93.8%～98.5%，日內(nèi)精密度和日間精密度考察均小于5%，具有較好的重復(fù)性。[結(jié)論]該方法能較好地應(yīng)用于卷煙主流煙氣中7種酚類物質(zhì)的測定。

關(guān)鍵詞 卷煙；主流煙氣；酚類；超高效液相色譜法（UPLC）；新型前處理裝置

中圖分類號 0657.7⁺2；TS41⁺1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）11-0157-04

簡單酚類化合物（苯酚、苯二酚、甲基苯酚等）是卷煙主流煙氣中的一類重要有害成分，它們不但有較難聞的氣味，很難被掩蓋，對卷煙感觀評吸產(chǎn)生不良影響，而且還對皮膚及呼吸道黏膜有強烈的刺激作用和致癌作用。該類化合物被加拿大政府列入46種有害成分名單，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）“煙草制品管制研究小組”列為建議的管制成分清單。因此準確測定卷煙主流煙氣中酚類物質(zhì)對于降低卷煙中的有害成分，提高卷煙的抽吸品質(zhì)十分重要。

主流煙氣中酚類物質(zhì)的測定已有較多報道，主要有液相色譜法、氣相色譜法、連續(xù)流動分析法、分光光度法等。用連續(xù)流動分析法和分光光度法只能測定酚類的總量，而采用氣相色譜直接測定時峰形易拖尾，一般需要用衍生化。液相色譜法由于分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化，在簡單酚類化合物分析中得到了廣泛應(yīng)用。按照我國煙草行業(yè)標準YC/T255-2008，采用高效液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的酚，方法色譜分離時間長，每個樣品需要40min以上，不能滿足樣品快速測定的要求。

為了尋找更簡便、快速的分析方法，筆者采用超高效液相色譜法縮短了樣品分析時間，并通過自主設(shè)計的樣品萃取瓶，簡化樣品前處理流程，使樣品前處理周期明顯縮短。改進方法和目前常規(guī)液相色譜分析方法相比，日樣品分析量明顯提高。該方法的建立為卷煙主流煙氣中酚類化合物的測定提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要材料。市售卷煙5種，購自昆明市某超市。

1.1.2主要試劑。鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚和苯酚標準品（純度>99%，購自瑞士Fluka公司）；β-環(huán)糊精（β-CD，分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級，購自Merk公司）；乙酸（分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

無酚蒸餾水：每升水中加入1g硫酸銅，用石英亞沸蒸餾器重蒸，并用Millipore-Q50超純水儀（美國Millipore公司）處理。

1.1.3主要儀器。SM400直線型吸煙機（英國斯茹林公司）；WatersAcQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元梯度泵，Empower色譜工作站，熒光檢測器（美國waters公司）；AE240電子分析天平（精確至0.0001g，Mettler公司）；電熱恒溫超聲波水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；Millipore-Q50超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2方法

1.2.1樣品前處理裝置。試驗設(shè)計的新型樣品前處理裝置結(jié)構(gòu)見圖1，裝置由帶密封圈的外套管（圖1a）和帶0.45μm過濾篩板的內(nèi)套管（圖1b）組成。樣品提取狀態(tài)為圖lc，樣品過濾及轉(zhuǎn)移狀態(tài)為圖1d。

1.2.2標準溶液配制。分別準確稱取50mg的7種酚類化合物于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得1.0mg/mL的7種酚類標準儲備液，儲備液在4℃下避光保存。使用時分別取1.0mL儲備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容，得O.1mg/mL的酚類混合標準溶液，用該混合標準溶液逐級稀釋成所需濃度的標準工作液。

1.2.3色譜條件。色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫30℃；柱流速0.5mL/min；進樣量5.0μL；流動相A：1%的乙酸水溶液（內(nèi)含0.01mol/LB-CD）；流動相B：70%的乙腈（內(nèi)含1%的乙酸和0.01mol/LB-CD）；洗脫梯度：0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B。

采用熒光檢測器程序波長檢測，檢測波長（激發(fā)波長/發(fā)射波長，mm）為0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。采用比較標樣與樣品的熒光光譜色譜峰保留時間法定性，外標法定量。

1.2.4試驗設(shè)計。每種卷煙樣品取1條，在GB/T16447規(guī)定的條件下進行平衡，參照文獻用SM400直線型吸煙機按照標準GB/T19609-2004規(guī)定的條件抽吸卷煙，每個孔道抽吸4支煙，用44mm劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣。吸煙完畢，空吸一口空氣后，取出濾片。

將裝置放到固定架上，并將劍橋濾片置于外套管中（圖1a），用50mL移液槍在裝有樣品的套管中加入50mL1%的乙酸水溶液，然后把內(nèi)套管卡在外套管的口部（圖1c）。裝好后將固定架放到恒溫超聲波水浴鍋中超聲萃取25min。萃取完后把內(nèi)套管向下壓，萃取溶液通過過濾篩板進入到內(nèi)套管中，并從內(nèi)套管中的細彎管流出，達到樣品過濾的效果（圖1d）。從細彎管口收集萃取液，棄去最初的2.0～3.0mL，然后用色譜進樣瓶直接收集1.0～1.5mL的樣品萃取液，供液相色譜分析。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理 試驗參照YC/T255-2008的方法，每個44mm劍橋濾片抽吸4支卷煙，用50mL1%的乙酸水溶液超聲萃取。試驗結(jié)果表明，超聲萃取20min左右7種酚類化合物可萃取完全，收集殘渣再萃取1次，已經(jīng)沒有酚類化合物檢出，延長超聲萃取時間對酚類化合物的測定結(jié)果沒有影響，該試驗選擇超聲萃取25min。

為了進一步減少樣品前處理環(huán)節(jié)，該研究設(shè)計了樣品前處理裝置（圖1），該裝置由帶密封圈的外套管（圖la）和帶0.45μm過濾篩板的內(nèi)套管（圖1b）組成。在外套管中加入劍橋濾片（圖1a），然后加入萃取溶劑（1%乙酸水溶液）。把內(nèi)套管卡在外套管的口部（圖1c），可防止樣品萃取過程中萃取溶液濺出或超聲水浴鍋中的水濺入。裝好后將裝置放到超聲波水浴鍋中超聲萃取，萃取完后將萃取瓶的內(nèi)套管向下壓，萃取溶液就通過過濾篩板進入到內(nèi)套管中，并從內(nèi)套管中的細彎管流出，用色譜進樣瓶從細彎管口部收集流出的萃取溶液，可直接進行液相色譜分析。

整個樣品前處理過程中不需要樣品轉(zhuǎn)移就能得到過濾好的待分析樣品，前處理操作得到簡化。試驗操作過程中樣品前處理步驟得到簡化，有可能會增加引入誤差的環(huán)節(jié)也會相應(yīng)減少，分析結(jié)果的精密度也會提高。另外，按常規(guī)方法進行樣品前處理操作，用針頭過濾器過濾，超聲過程中產(chǎn)生的劍橋濾片碎屑會堵塞過濾頭，過濾速度較慢。而在改進的處理方法中，超聲萃取完成后稍加放置，劍橋濾片碎屑就沉到底下，過濾時內(nèi)套管中的篩板只與上層清液接觸，這樣可有效避免過濾過程中的篩板堵塞，過濾速度更快，過濾操作更容易實現(xiàn)。

2.2色譜條件優(yōu)化 為了縮短分析時間，該試驗通過超高效液相色譜分析，采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分離7種酚類化合物，參照YC/T255--2008的流動相條件，對甲酚和問甲酚無法實現(xiàn)分離。根據(jù)文獻報道，對甲酚、間甲酚和鄰甲酚與β-環(huán)糊精（β-CD）空腔的契合程度不同，所形成的包結(jié)物穩(wěn)定性不同，會導(dǎo)致保留時間有更大差異，可將甲酚異構(gòu)體分離。該試驗參照文獻的方法，在流動相中添加β-CD，使鄰、對、間甲酚達到分離。用1%乙酸（內(nèi)含0.01mol/Lβ-CD）和70%乙腈（內(nèi)含1%乙酸和0.01mol/Lβ-CD）為流動相，試驗結(jié)果表明，A為1%乙酸，B為70%乙腈，按0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%B～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B梯度條件，7種酚類化合物均可達到基線分離且分離時間短，因此試驗優(yōu)選該流動相條件進行色譜分離。

采用熒光檢測器檢測，不同的酚類化合物具有不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長，對苯二酚激發(fā)波長284nm，發(fā)射波長332nm；間苯二酚激發(fā)波長275nm，發(fā)射波長315nm；鄰苯二酚激發(fā)波長277nm，發(fā)射波長319nm；苯酚激發(fā)波K272nm，發(fā)射波長309nm；對甲酚、間甲酚、鄰甲酚激發(fā)波長273nm，發(fā)射波長323nm。試驗參照YC/T255-2008采用程序波長檢測，選擇的檢測波長（激發(fā)波影發(fā)射波長，nm）為0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。

2.3方法的線性關(guān)系和檢出限 分別配制不同濃度酚類化合物的標準溶液，在選定試驗條件下進行色譜進樣，圖2為7種酚類物質(zhì)的標準色譜圖。從圖2可看出，各待測組分均達到了基線分離，而且色譜峰對稱性好，無明顯拖尾。包括回到起始梯度和平衡時間在內(nèi)，整個樣品色譜分析時間只需7.5min，與YC/T255-2008方法相比分離時間縮短至1/5。

根據(jù)不同濃度的峰面積，計算出回歸方程，根據(jù)信噪比S/N=3計算檢測限，根據(jù)信噪比S/N=10計算定量限，結(jié)果見表1。

2.4加標回收率及方法精密度 取相同卷煙2份，其中1份作為空白，另外1份加入已知量酚類物質(zhì)的標樣（2.5、10.0、40.0μg），另1份不加，通過加標樣品測出量減去未加標樣品測出量再除以標準加入量計算回收率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，方法的回收率為93.8%～98.5%，說明方法具有很高的回收率。取3個不同卷煙樣品，按選定試驗條件在同一天內(nèi)和不同天內(nèi)分別平行測定7次，計算7次平行測定結(jié)果的相對標準偏差。結(jié)果表明7種酚類物質(zhì)測定結(jié)果的日內(nèi)精密度RSD為1.4%～2.5%，日間精密度RSD為1.8%～3.3%，說明方法精密度好，可以應(yīng)用于主流煙氣中酚類物質(zhì)的檢測。

2.5實際樣品分析 選擇不同類型的5個卷煙樣品，按選定試驗條件進行測定，圖3為某個實際樣品色譜圖。實驗室方法結(jié)果與煙草行業(yè)標準YC/T255-2008的分析結(jié)果比較見表3。從表3可以看出，5個樣品中7種酚類化合物的分析結(jié)果均和煙草行業(yè)標準的測定結(jié)果相符合。說明該方法測定結(jié)果準確，可以應(yīng)用于實際樣品檢測，相較于行業(yè)標準檢測效率明顯提高。

3結(jié)論

該研究針對目前煙草行業(yè)標準測定卷煙主流煙氣中的酚類化合物分析周期長的特點，對超高效液相色譜技術(shù)在卷煙煙氣酚類化合物分析中的應(yīng)用進行了研究。研究通過自主設(shè)計的樣品前處理裝置，明顯簡化了樣品前處理操作，使樣品前處理周期有效縮短，改進方法和目前行業(yè)標準相比，日樣品分析量可提高5倍以上；色譜分離方面，實現(xiàn)了煙草中的7種酚類物質(zhì)在5min內(nèi)完全分離，提高了樣品分析效率。該方法的建立為卷煙主流煙氣中酚類化合物的測定提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。