生物土壤結皮土生對齒蘚轉錄組SSR位點分析

陳莉　趙浩然　黃琳淞　玉蘇甫江

摘要[目的]分析生物土壤結皮土生對齒蘚轉錄組SSR位點。[方法]以生物土壤結皮土生對齒蘚為材料，分析土生對齒蘚轉錄組數(shù)據(jù)，開發(fā)土生對齒蘚SSR分子標記技術。[結果]通過MISA軟件對土生對齒蘚高通量測序獲得的73084條unigenes進行SSR篩選。從搜索序列中發(fā)現(xiàn)4103個符合條件的SSRs，分布在3420條unigenes上，出現(xiàn)頻率為5.62%。三核苷酸和二核苷酸為主要重復類型，分別占SSR總數(shù)的47.9%和26.1%，AGC/CTG（31.9%）和AG/CT（75.5%）分別是其主要重復基元。69.0%的基序長度為12～20bp。[結論]土生對齒蘚轉錄組SSR位點出現(xiàn)頻率高、類型豐富、多態(tài)性潛能大，為土生對齒蘚分子生物學機制研究等方面提供理論依據(jù)。

關鍵詞 土生對齒蘚；轉錄組；SSR

中圖分類號 S188 文獻標識碼A 文章編號0517-6611（2018）11-13078-03

土生對齒蘚（Didymodonvinealis）屬于土壤結皮蘚類植物，廣泛存在于干旱、半干旱地區(qū)，對于維持生物土壤結皮的穩(wěn)定，抵御風蝕、水蝕起著關鍵作用。人們對生物土壤結皮中苔蘚的干旱適應性形態(tài)特征和繁殖特性已有相關研究。

簡單重復序列（simplesequencerepeat，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA（microsatdliteDNA），是由1～6個核苷酸串聯(lián)重復單元組成，長度為10～100bp。SSR具有分布廣泛、多態(tài)性強、數(shù)量豐富和共顯性遺傳易于分析等特點，可作為較為理想的遺傳標記。SSR標記已被廣泛應用于水稻、大麥、小麥、玉米等植物的遺傳圖譜構建、遺傳多態(tài)性分析、品種鑒定、分子標記輔助育種等研究。

隨著新一代高通量測序技術的成熟，轉錄組學得到快速發(fā)展，除小立碗蘚之外，對蘚類植物轉錄組學的測定鮮有報道。筆者通過高通量測序方法，從分子水平對土生對齒蘚的SSR進行多態(tài)性研究，為進一步探索土生對齒蘚分子生物學機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 供試樣品生物土壤結皮土生對齒蘚采集自騰格里沙漠東南緣寧夏中衛(wèi)市沙坡頭地區(qū)。沙坡頭地區(qū)屬草原化荒漠地帶，氣候干旱而多風，土壤基質為松散的流沙，沙層穩(wěn)定含水量僅2%～3%。

1.2提取ToralRNA 稱取樣品0.03g放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入提取液振蕩混勻，具體操作參考RNApreppure植物總RNA提取試劑盒說明書。利用Nanodrop2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent2100測定RIN值。單次建庫要求RNA總量1μg，濃度≥50ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀介于1.8～2.2。

1.3RNA-seq測序流程利用帶有Oligo（dT）的磁珠與ployA進行A-T堿基配對，可以從總RNA中分離出mR-NA，用于分析轉錄組信息。反轉合成cDNA在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mRNA為模板反轉合成一鏈cDNA，隨后進行二鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結構。連接ada-ptor雙鏈的cDNA結構為黏性末端，加入EndRepairMix將其補成平末端，隨后在3末端加上1個A堿基，用于連接Y字形的接頭，最后進行IlluminaHiseq上機測序。

1.4土生對齒蘚轉錄組SSR的篩選 采用MISA1.0軟件（hnp：//pgre.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對組裝后獲得的unigenes進行SSR檢測，參數(shù)為單核苷酸至少重復10次；二核苷酸至少重復6次；三至六核苷酸至少重復5次。

2結果與分析

2.1土生對齒蘚轉錄組SSR位點數(shù)量與分布頻率 由表1可知，利用MIsA軟件搜索土生對齒蘚轉錄組中的73084條unigenes序列，共在3420條unigenes中找到4103個符合條件的SSR8，SSR發(fā)生頻率（包含SSR的unigenes數(shù)與總uni-genes數(shù)之比）為4.68%。545條unigenes含有1個以上SSR位點，227條unigenes含有復合SSRs。土生對齒蘚轉錄組中SSR的出現(xiàn)頻率（SSR數(shù)與總unigenes數(shù)之比）為5.62%。土生對齒蘚轉錄組SsR種類較為豐富，從重復次數(shù)看，發(fā)現(xiàn)重復基元以重復5次出現(xiàn)的頻率最高，占總SSR的29.6%；其次為6、10、7次重復，分別占總SSR的24.6%、12.9%和12.4%；而重復11次以上的基序，占比僅7.4%（表2）。

從核苷酸的基序類型來看，土生對齒蘚轉錄組SSR以三核苷酸重復基序為主要類型，占總SSR的47.9%；其次是二核苷酸、單核苷酸重復基序，出現(xiàn)頻率分別為26.1%和23.1%。單核苷酸重復基元以A/T占比達92.6%；二核苷酸重復類型中，以AG/CT重復基元為主，占比可達75.5%；三核苷酸重復類型中，AGC/CTG重復基元所占比例最多，達31.9%，其次是AGG/CCT和AAG/CTT，所占比例分別為14.4%和12.5%。四、五、六核苷酸重復類型中，重復基序出現(xiàn)次數(shù)普遍偏低（表3）。

2.2土生對齒蘚轉錄組SSR的可用性評價 依據(jù)SSR標記多態(tài)性可判斷其使用性能，SSR多態(tài)性受其長度影響很大。通常，當SSR長度小于12bp時，多態(tài)性很低；當長度為12～20bp時，多態(tài)性中等；而當多態(tài)性大于或者等于20bp時多態(tài)性較高。該研究中，土生對齒蘚轉錄組SSR長度小于12bp的有609個，占總數(shù)的15.7%；長度為12～20bp的SSR最多，達2674個，占總數(shù)的69.0%；長度為20bp以上的SSR總計593個，占總數(shù)的15.3%?？梢娡辽鷮X蘚轉錄組檢測到的SSR位點具有較高的多態(tài)性（圖1）。

3討論

土生對齒蘚是土壤結皮植物的重要組成部分，該研究基于高通量測序拼接后得到unigenes，首次對土生對齒蘚轉錄組進行SSR位點信息搜索與分析。在得到的73084條unl-genes中進行SSR搜索，共在3420條unigenes中找到了4103個符合條件的SSRs，SSR的出現(xiàn)頻率為5.62%。通過與蕨類及藻類植物比較發(fā)現(xiàn)，土生對齒蘚的出現(xiàn)頻率要比蕨類植物芒萁（Dicranopterispedata，21.03%）、鳥巢蕨（Neottopterisnidus，14.14%）、紫萁（Osmundajaponica，21.73%）、姬蕨（Hypolepisputtee，19.37%）低，但是比藻類植物大葉藻（ZosteramarinaL.，1.7%）、條斑紫菜（Porphyrayezoensis，1.53%）高。因此推測，SSR出現(xiàn)頻率具有種屬特異性。

很多植物的SSR都以三核苷酸和二核苷酸為主，但主要的重復基元不同。在該研究中，土生對齒蘚SSR中三核苷酸為主要重復類型，出現(xiàn)頻率最高，占總SSR的47.9%，二核苷酸重復類型中以AG/CT為主要重復基元。值得注意的是蕨類植物鳥巢蕨、紫萁、姬蕨的主要重復類型都是二核苷酸，且重復基元都為AG/CT，可推測AG/CT在SSR標記中扮演著十分重要的角色。

該研究結果表明，土生對齒蘚轉錄組SSR數(shù)量多、種類較為豐富，并具有較高的多態(tài)性。土生對齒蘚轉錄組SSR對于今后土生對齒蘚功能基因資源的開發(fā)利用、遺傳資源評價、豐富其分子標記、種質資源開發(fā)和比較基因組學研究都具有重要的價值。