加工條件對核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

鹿旭　華欲飛　陳業(yè)明　張彩猛　孔祥珍

摘要 [目的]探討加工條件對核桃蛋白溶出率的影響，為利用核桃蛋白以及核桃乳的加工工藝提供依據(jù)。[方法]以脫脂核桃粉為原料，研究了高速剪切、pH和加熱這3種加工條件對核桃蛋白溶出率的影響。[結(jié)果]核桃蛋白在堿性pH中蛋白溶出率較高，熱處理可以增大蛋白溶出率，增加高速剪切時(shí)間和提高剪切溫度均可以使核桃蛋白溶出率增大。相同pH下，核桃蛋白經(jīng)過高溫剪切可以增大蛋白溶出率，pH 7.0條件下60 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由5.67%增加到16.45%；pH 8.0條件下60 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由24.33%增加到62.81%；pH 9.0條件下60 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由50.93%增加到76.65%；pH 10.0條件下80 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由5787%增加到78.67%。[結(jié)論]經(jīng)過電泳分析得知，高速剪切可以使原本不溶的核桃谷蛋白溶出，使核桃乳穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞 核桃蛋白質(zhì)；高速剪切；pH；加熱溫度；溶出率

中圖分類號 TS255 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）13-0155-05

Effect of Processing Conditions on the Dissolution Rate of Walnut Protein

LU Xu， HUA Yufei， CHEN Yeming et al

（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi ，Jiangsu 214122 ）

Abstract [Objective]The influence of processing conditions on walnut protein dissolution rate was discussed， so as to provide basis for walnut protein and walnut milk processing technology. [Method]With skimmed walnut powder as raw material， the high speed shearing， pH and heating these three kinds of the effect of processing conditions on the walnut protein dissolution rate were investigated. [Result] The dissolution rate of the walnut protein in alkaline pH was high， the heat treatment could increase the protein dissolution rate， and the walnut protein dissolution rate increased with increasing the shear time and temperature of high shearing. At the same pH， the protein dissolution rate of walnut protein was increased after high speed shear at high temperature， under the condition of pH 7.0， shearing at 60 ℃ for 5 min， the protein dissolution rate of the walnut protein increased from 5.67% to 16.45%；under the condition of pH 8.0， shearing at 60 ℃ for 5 min， the protein dissolution rate of the walnut protein increased from 24.33% to 62.81%；under the condition of pH 9.0， shearing at 60 ℃ for 5 min， protein dissolution rate of the walnut protein increased from 50.93% to 76.65%；under the condition of pH 10.0 shearing at 80 ℃ for 5 min， protein dissolution rate of the walnut protein increased from 57.87% to 78.67%. [Conclusion]After electrophoresis analysis， it was found that the high speed shear could dissolve the original insoluble walnut gluten， and enabling the stability of walnut milk.

Key words Walnut protein；High speed shearing；pH；Heating temperature；Dissolution rate

核桃是四大堅(jiān)果之一，在我國栽培歷史悠久，種植面積也比較廣泛，我國核桃的種植面積和產(chǎn)量均居世界之首[1-2]。核桃中的蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，并且營養(yǎng)成分豐富，其藥用價(jià)值也逐漸被開發(fā)利用[3]。核桃仁中蛋白質(zhì)含量高達(dá)15%～20%，屬于優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，被廣泛應(yīng)用到核桃乳等產(chǎn)品的加工制作中[4-5]。由于核桃蛋白主要由谷蛋白構(gòu)成，谷蛋白不溶于水，溶于堿液，水溶性差，因此限制了核桃蛋白在食品中的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)的溶解性是指蛋白質(zhì)在水中的溶解能力，在食品加工中具有重要作用。關(guān)于核桃蛋白功能性質(zhì)的研究也較多集中在蛋白的溶解性方面。崔莉等[6]對核桃分離蛋白在不同pH條件下的溶解性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明核桃蛋白的溶解性在pH 5.0左右時(shí)最差。Szetao等[7]對不同pH條件下脫脂核桃粉的溶解性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)核桃蛋白的溶解性在pH 4.0時(shí)最差，隨著 pH升高，核桃蛋白的溶解性逐漸增加。姜莉[8]研究了溫度對核桃蛋白溶解性的影響，發(fā)現(xiàn)核桃蛋白在55 ℃時(shí)溶解性達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度溶解性會逐漸下降。

大部分未經(jīng)改性的天然蛋白質(zhì)在生產(chǎn)加工中不能充分發(fā)揮其功能性質(zhì)，因此通常運(yùn)用一些改性手段使蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)得以改善，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的利用率。一些物理方法如機(jī)械振蕩、高壓均質(zhì)和熱反應(yīng)等均可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行改性[9]?；瘜W(xué)改性是使用化學(xué)試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂、重組，或者引入其他功能基團(tuán)。pH對核桃蛋白的溶解性影響較大，在堿性條件下更有利于提高蛋白質(zhì)的溶解性[6]。目前在安全性上被大眾所接受的且廣泛應(yīng)用在工業(yè)中的化學(xué)改性是酸堿處理，鹽酸和氫氧化鈉是常用的pH調(diào)節(jié)劑[9]。

高速剪切是一種均質(zhì)化技術(shù)，可以提高產(chǎn)品的提取率，效果好且耗能低，因此在有效成分的分離提取中應(yīng)用廣泛[10]。張彩猛等[11]將高速剪切技術(shù)應(yīng)用到醇法大豆?jié)饪s蛋白中對其進(jìn)行改性研究，結(jié)果表明，經(jīng)過高速剪切處理后大豆?jié)饪s蛋白的溶解性提高。而高速剪切技術(shù)在核桃蛋白提取中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。調(diào)節(jié)pH、加熱、剪切是核桃乳制備過程中常見的加工工藝。筆者以脫脂核桃粉為原料，探討pH、加熱溫度、高速剪切條件對核桃蛋白溶出率的影響，為進(jìn)一步利用核桃蛋白生產(chǎn)核桃乳的加工工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料與主要試劑：核桃仁，購于繽果世家網(wǎng)店，屬云南大理生核桃仁；氫氧化鈉、碳酸氫鈉、濃鹽酸、石油醚、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、疊氮鈉、硫酸銅、硫酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、牛血清蛋白（BSA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、β-巰基乙醇（β-ME）、甘氨酸、三氯乙酸（TCA）、過硫酸銨和考馬斯亮藍(lán)G-250均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二二鈉甲酸（BCA），蘇州亞科科技股份有限公司。

主要儀器：

K9840自動凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；pH計(jì)、電子天平、AB204-N型分析天平，梅特勒-托利多有限公司；LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；磁力攪拌器，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；Himac CR21GⅡ型冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；FA25型高速剪切機(jī)，弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；UV-2100型紫外分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇榮華儀器制造有限公司；DYY-8C型垂直電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 核桃脫脂粉的制備。

將核桃仁去皮后用打漿機(jī)打漿、膠體磨磨漿后得到核桃漿，冷凍干燥。將凍干后的核桃漿與石油醚以料液比 1 ∶5（W/V）混合，充分混勻攪拌1 h后進(jìn)行抽濾，收集抽濾后所得殘?jiān)俅蚊撝?，直至濾液無色透明，收集殘?jiān)旁谕L(fēng)櫥內(nèi)揮干溶劑，將所得的核桃脫脂粉于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 核桃蛋白的分級分離。

核桃蛋白組分的分離提取方法參照毛曉英等[12]、Osborne[13]和Szetao [7]的方法略微改動。核桃中谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白的分離提取按照圖1所示的方法進(jìn)行。為了充分提取核桃中各蛋白組分，每個提取步驟重復(fù)2次，然后將各蛋白組分離心后的清液于4 ℃下透析48 h后凍干，將所得的蛋白凍干粉于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同pH核桃蛋白樣品的制備。

稱取適量脫脂粉，與去離子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的 pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，攪拌提取2 h。

1.2.4 不同加熱溫度核桃蛋白樣品的制備。

稱取適量脫脂粉，與去離子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH為7.0，攪拌提取2 h，分別在溫度20、40、60、80、100和121 ℃熱處理20 min，之后冷卻至室溫。

1.2.5

不同剪切時(shí)間核桃蛋白樣品的制備。

稱取適量脫脂粉，與去離子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室溫下充分混勻攪拌。分別調(diào)節(jié)溶液的pH 為 7.0、8.0、9.0、10.0，攪拌提取2 h。之后分別用高速剪切機(jī)在室溫下10 000 r/min剪切2、4、6、8、10 min。

1.2.6 不同剪切溫度核桃蛋白樣品的制備。

稱取適量脫脂粉，與去離子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室溫下充分混勻攪拌。分別調(diào)節(jié)溶液的pH 為 7.0、8.0、9.0、10.0，攪拌提取2 h。之后分別用高速剪切機(jī)在20、40、60、80 ℃溫度下10 000 r/min剪切5 min。

1.2.7 蛋白溶出率的測定。

將制備好的核桃蛋白樣品在4 ℃下以11 200 r/min離心25 min。取一定量的上清液采用BCA法測定蛋白質(zhì)含量（以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白），蛋白質(zhì)溶出率的計(jì)算公式如下。

蛋白質(zhì)溶出率（%）= 清液蛋白質(zhì)含量×清液體積 脫脂粉蛋白質(zhì)含量×脫脂粉取樣量 ×100

1.2.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。

核桃蛋白組分的凝膠電泳參照沈敏江的方法略微改動[14]。電泳中分離膠和濃縮膠的濃度分別為12.5%和40%。將樣品溶于樣品溶解液中，使蛋白濃度為2 mg/mL，再加入1%溴酚藍(lán)，還原性SDS-PAGE需要在其中加入2%巰基乙醇，沸水浴加熱5 min后10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣10 μL。分別用考馬斯亮藍(lán)G-250和去離水對凝膠進(jìn)行染色和脫色。

1.2.9 核桃蛋白乳液的制備。

稱取適量脫脂粉，與去離子水混勻使蛋白濃度為0.6%，分別調(diào)節(jié)溶液的pH 為 7.0、80，室溫下充分混勻攪拌，加入2.0%大豆油，60 ℃剪切5 min使蛋白和油充分乳化。

1.2.10 核桃蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

將制備好的核桃蛋白乳液搖勻后取10 μL滴加到載玻片上，緩慢蓋好蓋玻片避免產(chǎn)生氣泡，然后用普通光學(xué)顯微鏡放大100倍進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個樣品測定3次平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，作圖工具為Origin 8.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白和蛋白組分

核桃蛋白的組分及比例如表1所示。由表1可以看出，核桃中主要包含4種蛋白，分別是谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白，所占比例分別為58.80%、2428%、8.01%和0.08%，還有8.84%是殘余蛋白。核桃蛋白中谷蛋白所占的比例最大，接近60%；其次是球蛋白，所占比例接近25%；核桃蛋白中清蛋白和醇溶蛋白所占比例較小。這與毛曉英等[12]對核桃蛋白質(zhì)及其分離組分的分析得到的結(jié)果類似。

由于核桃醇溶蛋白含量非常少，所以選取清蛋白、球蛋白和谷蛋白對核桃蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，目的是為了得到核桃蛋白組分的分子量分布情況，結(jié)果如圖2所示。清蛋白的分子量分布范圍比較廣，非還原狀態(tài)下分子量在10～250 kD范圍內(nèi)都有分布，還原狀態(tài)下分子量分布在10～100 kDa，說明清蛋白分子間的巰基二硫鍵在還原狀態(tài)下被打斷。球蛋白在非還原狀態(tài)下分子量主要在10～15、32～34、38～40、50～70 kD 4個區(qū)間，同時(shí)在18～22、200～270 kD也有蛋白分布；還原狀態(tài)下分子量主要分布在17～20、32～35、45～73 kD，其中45～73 kD的蛋白條帶為4個單獨(dú)分開的條帶，200～270 kD的蛋白條帶消失。谷蛋白的電泳條帶顏色比較深，在非還原狀態(tài)下分子量主要集中在17～19、33～35、55～70和大于250 kD的區(qū)域；在還原狀態(tài)下分子量主要集中在16～19、30～35、50～55和大于250 kD的區(qū)域，并且還原與非還原電泳條帶在大于250 kD處的顏色都較深，說明谷蛋白多為分子量比較大的蛋白。

2.2 pH對核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

由圖3可以看出，在pH 2.0～12.0蛋白質(zhì)的溶出率有顯著差異。核桃蛋白質(zhì)在中性和酸性pH中溶出率比較低，在pH 2.0～5.0，隨著pH增加，蛋白溶出率由27.02%減少到7.04%；在pH 5.0～7.0，蛋白溶出率都低于10%。在堿性條件下，隨著pH的升高，蛋白質(zhì)的溶出率逐漸提高。在pH為8.0時(shí)，蛋白質(zhì)溶出率為24.33%，到pH為11.0時(shí)，溶出率達(dá)73.19%，隨后溶出率增加緩慢，到pH 12.0時(shí)，溶出率達(dá)78.37%。由于谷蛋白是核桃蛋白的主要組成成分，因此在堿性條件下由于大部分谷蛋白溶出，所以核桃蛋白的溶出率較高。

2.3 加熱溫度對核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

由圖4可以看出，在20 ℃時(shí)核桃蛋白溶出率為5.58%，隨著加熱溫度的升高，核桃蛋白溶出率增大。當(dāng)溫度在40～100 ℃時(shí)，核桃蛋白溶出率差異不大。40 ℃時(shí)蛋白質(zhì)溶出率為11.89%；當(dāng)溫度升至 60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)溶出率略微增加，溶出率為1251%；當(dāng)溫度達(dá)到 80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)溶出率略微下降，溶出率為1157%；100 ℃時(shí)，蛋白溶出率又略微增加至1246%；當(dāng)溫度繼續(xù)升高到121 ℃時(shí)，蛋白溶出率達(dá)到1636%，比20 ℃時(shí)蛋白溶出率提高了10.78百分點(diǎn)，比40～100 ℃時(shí)蛋白溶出率提高了3.85～4.47百分點(diǎn)。這可能是由于在熱處理的過程中蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵被部分打開，因此改善了溶解性[15]。

2.4 高速剪切對核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

高速剪切可以使蛋白與蛋白之間相互擠壓，在外力的作用下減小蛋白質(zhì)粒徑，增大其表面積[16]。由于在高速剪切的過程中蛋白質(zhì)顆粒間的共價(jià)鍵會被破壞，所以使蛋白質(zhì)的溶解度增加。為了研究高速剪切對核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響，分別選取pH 70～10.0和20 ～ 80 ℃范圍對核桃蛋白的溶出率進(jìn)行考察，防止在過酸、過堿和高溫條件下對蛋白質(zhì)的性質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值造成破壞，以便應(yīng)用到核桃蛋白的實(shí)際加工中。

剪切時(shí)間對核桃蛋白溶出率的影響如圖5a所示?？梢钥闯?，蛋白溶出率隨剪切時(shí)間的增加而增大。pH 7.0條件下，未剪切時(shí)溶出率為5.67%，剪切10 min后溶出率增加到1889%，提高了13.22百分點(diǎn)；pH 8.0條件下，未剪切時(shí)溶出率為24.33%，剪切8 min后溶出率達(dá)到47.61%，提高了23.28百分點(diǎn)；pH 9.0條件下，未剪切時(shí)溶出率為50.93%，剪切10 min后溶出率增加到58.97%，提高了8.04百分點(diǎn)；pH 10 .0條件下，未剪切時(shí)溶出率為57.87%，剪切10min后溶出率增加到70.67%，提高了12.80百分點(diǎn)。由此可以得出，增加剪切時(shí)間可以促進(jìn)核桃蛋白質(zhì)溶出，但相對于pH而言，在剪切時(shí)提高蛋白質(zhì)溶液的pH比增加剪切時(shí)間對蛋白的增溶效果更顯著。

剪切溫度對核桃蛋白溶出率的影響如圖5b所示?？梢钥闯?，pH 7.0條件下，核桃蛋白經(jīng)過60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由5.67%增加到16.45%，提高了10.78百分點(diǎn)；pH 8.0條件下，核桃蛋白經(jīng)過60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由24.33%增加到62.81%，提高了34.48百分點(diǎn)；pH 9.0條件下，核桃蛋白經(jīng)過60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由5093%增加到76.65%，提高了25.72百分點(diǎn)；pH 10.0條件下，核桃蛋白經(jīng)過80 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由57.87%增加到78.67%，提高了20.80百分點(diǎn)。由此可以得出，升高剪切溫度可以促進(jìn)核桃蛋白質(zhì)溶出，但相對于pH而言，在剪切時(shí)提高蛋白質(zhì)溶液的pH比升高剪切溫度對蛋白的增溶效果更顯著。

2.5 高溫剪切對溶出核桃蛋白質(zhì)SDS-PAGE條帶的影響

為了考察在中性條件下和在堿性條件下高溫剪切后溶出蛋白的差異，分別選取pH 7.0、8.0高溫剪切前后溶出的核桃蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖6所示。不同分子量下還原電泳各泳道蛋白比例見表2。可以看出，在還原狀態(tài)下，pH 7.0高溫剪切后溶出的蛋白（圖6 a 泳道2）在分子量50～75 kD的比例增加，由21.01%增加到36.10%，增加了1509百分點(diǎn)；在分子量18～21 kD的比例增加，由32.57%增加到34.30%，增加了1.73百分點(diǎn)。pH 8.0高溫剪切后溶出的蛋白（圖6 a 泳道4）在分子量30～35 kD的比例增加，由32.72%增加到45.81%，增加了13.09百分點(diǎn)；在分子量18 ～21 kD的比例增加，由29.01%增加到29.30%，增加了0.29百分點(diǎn)。條帶顏色加深的區(qū)域?qū)?yīng)的蛋白既有清蛋白、球蛋白，又有谷蛋白，但只有清蛋白和球蛋白2種蛋白不足以使蛋白的比例增加如此多，說明谷蛋白同樣起到了作用，由此推測高溫剪切可以使谷蛋白增溶。

2.6 核桃蛋白質(zhì)的乳化性

為了將高速剪切工藝應(yīng)用到核桃蛋白的實(shí)際加工中，分別對中性條件下和堿性條件下高溫剪切后蛋白的乳化性進(jìn)行考察，其中堿性條件以pH 8.0高溫剪切后溶出的蛋白為代表。圖7為pH 7.0、8.0條件下

60 ℃剪切5 min后核桃蛋白質(zhì)的乳化性。由顯微圖片可以

看出，pH 7.0高溫剪切制備的核桃蛋白乳狀液的乳化性不好，蛋白和油滴之間形成了聚集體，且有很多小油滴在聚集后融合成大油滴；pH 8.0高溫剪切制備的核桃蛋白乳狀液的乳化性較好，顯微圖片中無大量聚集體出現(xiàn)，蛋白和油分散的較均勻。由此說明，高速剪切對核桃蛋白的乳化作用在堿性條件下好于在中性條件下。

3 結(jié)論

核桃蛋白中，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的含量分別為8.01%、24.28%、0.08%和58.80%，核桃中主要蛋白成分是谷蛋白。核桃蛋白在中性和酸性pH中溶出率比較低，在堿性pH中溶出率比較高，在pH 2.0～5.0，隨著pH增加，蛋白溶出率由27.02%減少到7.04%；在pH 5.0～7.0，蛋白溶出率都低于10%；在pH 8.0～12.0，隨著pH增加，蛋白溶出率由24.33%增加到78.37%。核桃蛋白在經(jīng)過加熱之后，可以增加它的蛋白溶出率，當(dāng)溫度由20 ℃升高到121 ℃，蛋白溶出率由5.58%增加到16.36%。高溫剪切可以使核桃蛋白增溶，在pH 7.0、8.0、9.0、10.0條件下，經(jīng)過高溫剪切的蛋白溶出率均比未經(jīng)高溫剪切的蛋白溶出率高。pH 7.0條件下，核桃蛋白在60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由5.67%增加到1645%；pH 8.0條件下，核桃蛋白在60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由24.33%增加到62.81%；pH 9.0條件下，核桃蛋白在60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由50.93%增加到76.65%；pH 10.0條件下，核桃蛋白在80 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由57.87%增加到78.67%。通過電泳分析高速剪切前后溶出的蛋白得知，高速剪切可以使原本不溶的核桃谷蛋白溶出。將該工藝應(yīng)用到核桃乳的制備中，可以提高核桃蛋白的乳化性，促進(jìn)核桃乳穩(wěn)定。

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