玉葉金花SSR—PCR體系的優(yōu)化

鄭艷　胡章立　陳濤

摘要 [目的]優(yōu)化玉葉金花SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。[方法]以紅紙扇為材料，采用正交設(shè)計(jì)和單因素試驗(yàn)方法，從Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA濃度以及退火溫度4個(gè)方面對(duì)玉葉金花SSR-PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，并采用4對(duì)SSR引物和4種玉葉金花植物樣品進(jìn)行驗(yàn)證。[結(jié)果]玉葉金花20 μL的 SSR-PCR反應(yīng)最優(yōu)體系為Mg2+濃度1.50 mmol/L、dNTPs濃度0.150 mmol/L、引物濃度0.45 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.00 U、模板DNA 15 ng、退火溫度53.4 ℃。[結(jié)論]該反應(yīng)體系的擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于玉葉金花的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、物種分子鑒定、遺傳多樣性分析和譜系關(guān)系構(gòu)建等相關(guān)研究。

關(guān)鍵詞 玉葉金花；正交設(shè)計(jì)；SSR分子標(biāo)記；PCR體系優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0098-06

Optimization of SSR-PCR System for Mussaenda L.

ZHENG Yan1，2，HU Zhangli1，CHEN Tao1，2*

（1.College of Life Sciences and Oceanography，Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518060；2.Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，CAS， Shenzhen，Guangdong 518004）

Abstract [Objective]To optimize SSR-PCR amplification reaction system for Mussaenda by orthogonal design.[Method]The orthogonal design and single factor test were adopted to optimize the SSR-PCR system using M.erythrophylla genomic DNA as template.Six factors including the concentration of Mg2+，dNTPs，Taq DNA polymerase，primer，DNA template and annealing temperature were tested separately in this system，which was further verified by four primers and samples of four Mussaenda species.[Result]The optimized SSR-PCR reaction system condition was obtained in a 20 μL system containing 1.50 mmol/L Mg2+，0.150 mmol/L dNTPs，0.45 μmol/L SSR primer，2.00 U Taq DNA polymerase and 15 ng DNA template，and the annealing temperature 53.4 ℃.[Conclusion]With clear，stable and reproducible bands，the system can be used for SSR maker development，germplasm identification，genetic diversity and relationship analyses.

Key words Mussaenda L.；Orthogonal design；SSR molecular marker；PCR system optimization

玉葉金花屬（Mussaenda L.）植物屬于茜草科（Rubiaceae）金雞納亞科（Cinchonoideae）玉葉金花族（Mussaendeae），主要分布于非洲、亞洲及西南太平洋島嶼，全世界有130多種，我國(guó)玉葉金花屬植物約有28種，主產(chǎn)于西南部至東南部以及西藏和臺(tái)灣[1-3]。玉葉金花屬植物一般為纏繞藤本、灌木和小喬木，主要特征是具有擴(kuò)大的花瓣?duì)钶嗳~，不開(kāi)裂漿果，具有較高的觀賞價(jià)值[4]。部分玉葉金花屬植物全株可入藥，有清熱解毒、去濕、止渴、活血化瘀等功效，也可作為涼茶配料，預(yù)防感冒等，有的種類(lèi)提取物還具有抗菌和抗癌等功效[5-6]，因此玉葉金花具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）在真核和原核生物基因組中分布廣泛。SSR分子標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、易檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在植物的親緣關(guān)系鑒定、遺

傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等方

面應(yīng)用廣泛[7-10]。目前，基于SSR標(biāo)記技術(shù)的玉葉金花屬植物的研究較少，結(jié)果不夠理想[11-13]。筆者采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA的濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以期為后續(xù)玉葉金花SSR分子標(biāo)記的全面開(kāi)發(fā)、遺傳多樣性分析和分子分類(lèi)鑒定等相關(guān)研究提供參考和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

以紅紙扇、大葉玉葉金花、廣東玉葉金花、墨脫玉葉金花為材料，材料采自廣東省深圳市仙湖植物園玉葉金花保育與研發(fā)基地。采集幼嫩健康的葉片用硅膠進(jìn)行干燥處理，其中紅紙扇用于SSR-PCR體系優(yōu)化試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)采用4種樣品（表1）。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑。DL2000 DNA Marker、PCR擴(kuò)增所用的10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。 試驗(yàn)所用的SSR引物由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司合成，其中引物M8用于正交試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)，引物M2、M10和M11用于體系驗(yàn)證試驗(yàn)（表2）。

1.2.2 主要儀器。NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)、BIO-RAD T100TM Thermal Cycler、DYCP-31DN水平電泳儀購(gòu)于北京六一儀器廠、BIO-RAD全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 玉葉金花基因組DNA提取。采用CTAB法提取玉葉金花基因組DNA[14]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，并用TE buffer稀釋至50 ng/L備用。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用L16（45）正交設(shè)計(jì)，對(duì)玉葉金花SSR-PCR體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量進(jìn)行5因素4水平的優(yōu)化試驗(yàn)。SSR-PCR總反應(yīng)體系為20 μL，除上述5個(gè)變化因素外，每個(gè)體系還包含2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O補(bǔ)齊，每個(gè)處理重復(fù)3次（表3、4）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中16組試驗(yàn)的結(jié)果，選出1組結(jié)果最佳的濃度組合，以此為基準(zhǔn)進(jìn)行PCR體系單因素試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化SSR-PCR體系。每個(gè)因素設(shè)置8個(gè)水平，每個(gè)處理重復(fù)3次（表5）。

1.3.4 SSR-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。PCR反應(yīng)在BIO-RAD T100TM Thermal Cycler上進(jìn)行，采用Touchdown PCR擴(kuò)增程序[15]：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，7個(gè)循環(huán)且每個(gè)循環(huán)降低1 ℃；之后94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)的結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，以DL2000 DNA Marker作為對(duì)照，采用BIO-RAD全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.5 退火溫度的優(yōu)化。選用以上試驗(yàn)所得最佳反應(yīng)體系，對(duì)SSR引物退火溫度進(jìn)行篩選。設(shè)置退火溫度為48～65 ℃，用BIO-RAD T100TM Thermal Cycler自動(dòng)生成8個(gè)退火溫度：48.0、49.0、50.7、53.4、56.5、59.1、60.9、62.0 ℃。

1.3.6 反應(yīng)體系驗(yàn)證。通過(guò)正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)篩選出玉葉金花SSR-PCR最佳反應(yīng)體系以及最佳退火溫度，使用4對(duì)引物M2、M8、M10和M11對(duì)4個(gè)不同種的玉葉金花樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)2次，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以驗(yàn)證反應(yīng)體系的可靠性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果 用CTAB法提取的玉葉金花基因組DNA OD260/OD280為1.81～1.91，濃度為105～243 ng/μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰，說(shuō)明DNA完整性好，可用于SSR-PCR試驗(yàn)（圖1）。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖2可知，L16（45）正交設(shè)計(jì)的16個(gè)處理3次重復(fù)的結(jié)果，因Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物及DNA濃度的不同組合，擴(kuò)增效果出現(xiàn)了明顯差異。第2、3、4、5、6、11、12、14、16組條帶模糊，出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，且結(jié)果不穩(wěn)定；第1和13組擴(kuò)增結(jié)果較穩(wěn)定，但條帶不清晰；第7、8、9和15組擴(kuò)增條帶明亮，較清晰；第10組條帶最明亮、清晰，條帶大小與理論值相符，無(wú)引物二聚體，且重復(fù)性好，亮度一致。

根據(jù)對(duì)各組合擴(kuò)增結(jié)果的比較分析，第10組的各種因素組合為最佳選擇，即20 μL反應(yīng)體系中含2.00 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、2.00 U Taq DNA聚合酶、0.50 μmol/L 引物及20 ng DNA。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

以SSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果最好的第10組為基準(zhǔn)，對(duì)Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA這5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，圖3為1次試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果。

2.3.1 Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)的影響。

Mg2+通過(guò)調(diào)控Taq DNA聚合酶的活性影響PCR反應(yīng)。由圖3可知，隨著Mg2+濃度的升高，PCR產(chǎn)物條帶的亮度呈先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明Mg2+濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響PCR擴(kuò)增效率。第3組即Mg2+濃度為1.50 mmol/L時(shí)，條帶最為明亮，因此Mg2+最佳濃度選用1.50 mmol/L。

2.3.2 dNTPs濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)的影響。dNTPs是PCR反應(yīng)的底物，該試驗(yàn)中dNTPs的濃度不同時(shí)，PCR擴(kuò)增結(jié)果相當(dāng)，影響不大，因此選擇正交試驗(yàn)結(jié)果中的最佳濃度0.150 mmol/L。

2.3.3 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)SSR- PCR反應(yīng)的影響。Taq DNA 聚合酶濃度低時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度低，結(jié)果不理想，隨著濃度的增加，擴(kuò)增的條帶亮度上升。由圖3可知，當(dāng)Taq DNA聚合酶的量低于1.00 U時(shí)，條帶很淡，高于1.00 U時(shí)擴(kuò)增效果較好，當(dāng)Taq DNA聚合酶為2.00 U時(shí)，條帶最為清晰，擴(kuò)增效果最好，因此最佳選擇是2.00 U。

2.3.4 引物濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)的影響。。

SSR引物濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響不是很大，其中第4、5、6、7和8組條帶清晰，擴(kuò)增效果均很好，第1、2、3組相對(duì)較差，即引物濃度為045～0.65 μmol/L時(shí)，PCR結(jié)果很好，濃度為0.30～0.40 μmol/L時(shí)擴(kuò)增結(jié)果稍差。引物濃度過(guò)高時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，綜合考慮到成本，選擇濃度較低的第4組，即引物濃度的最佳選擇為0.45 μmol/L。

2.3.5 模板DNA濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)的影響。由圖3可知，DNA模板對(duì)PCR擴(kuò)增的影響較大，隨著DNA濃度的增高，條帶逐漸變淡，最低濃度15 ng為最佳選擇。

2.4 退火溫度篩選結(jié)果分析

在PCR反應(yīng)中，退火溫度影響引物與模板的特異性結(jié)合。由圖4可知，在8個(gè)不同退火溫度下，均能擴(kuò)增出目的條帶。在退火溫度為48.0、49.0、50.7、53.4 ℃時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果條帶明亮，清晰；當(dāng)退火溫度高于53.4 ℃時(shí)，條帶亮度較弱。因此在48.0～53.4 ℃內(nèi)，擴(kuò)增效果較好。退火溫度過(guò)高會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效率，而退火溫度較低時(shí)，容易出現(xiàn)引物二聚體，所以選擇53.4 ℃為最佳退火溫度。

2.5 體系驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

應(yīng)用SSR-PCR正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果所得到的最佳反應(yīng)體系，選用4對(duì)SSR引物M2、M8、M10和M11對(duì)4種玉葉金花樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶清晰、明亮，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，無(wú)引物二聚體，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好（圖5）。

綜上所述，玉葉金花SSR-PCR的20 μL最佳反應(yīng)體系為1.50 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、0.45 μmol/L引物、2.00 U Taq DNA聚合酶、15 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O補(bǔ)齊，最佳退火溫度為53.4 ℃。

3 討論

SSR標(biāo)記作為一種重要的分子標(biāo)記，在物種的遺傳多樣性分析、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等方面具有廣泛的應(yīng)用[9，16]。SSR-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效果受諸多因素影響，探索玉葉金花SSR的最佳PCR反應(yīng)體系，對(duì)SSR分子標(biāo)記在玉葉金花屬植物研究中的應(yīng)用十分關(guān)鍵。

該研究采用正交設(shè)計(jì)和單因素試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)玉葉金花SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，其中正交試驗(yàn)?zāi)軌蚓飧鱾€(gè)試驗(yàn)因素，綜合各因素之間的交互作用，以便快速找出最佳的組合。在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，充分考慮到各因素的影響，提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[17-19]。

SSR-PCR反應(yīng)體系中，各因素交互影響。Mg2+能夠影響Taq DNA聚合酶的活性，還會(huì)與dNTPs結(jié)合，產(chǎn)生拮抗作用[20]。dNTPs濃度過(guò)高，容易產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，還會(huì)與Mg2+結(jié)合導(dǎo)致Taq DNA聚合酶的活性降低。Taq DNA聚合酶濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致活性不夠，反應(yīng)不充分；濃度過(guò)高不僅浪費(fèi)原料，還會(huì)降低反應(yīng)的特異性。引物的特異性及穩(wěn)定性會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)率，引物濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量下降或擴(kuò)增失敗，濃度過(guò)高則容易引起堿基錯(cuò)配，形成引物二聚體[21-22]。

在繡球[18]、紅椿[23]、綠豆[24]等植物的研究中發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)的影響最大。該研究中，PCR的效果隨著Mg2+濃度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與眾多研究結(jié)果類(lèi)似，但是Mg2+濃度的變化并未導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，可能是由于該研究所設(shè)計(jì)的濃度梯度變化不大。在大多數(shù)研究中，PCR反應(yīng)對(duì)DNA模板的量要求很寬泛，認(rèn)為模板DNA對(duì)反應(yīng)影響最小[19，24]。該研究結(jié)果顯示，隨著DNA模板濃度的提高，PCR反應(yīng)效果明顯下降。這可能是由于玉葉金花材料中多糖等其他成分的含量較高，而該試驗(yàn)采用的CTAB法提取基因組DNA，未能將雜質(zhì)去除干凈，瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果顯示模板DNA主帶明顯，但濃度不高，含有雜質(zhì)。在DNA濃度高的同時(shí)，因雜質(zhì)含量較高，從而影響了PCR反應(yīng)結(jié)果。PCR試驗(yàn)對(duì)模板DNA含量要求不高，因此僅15 ng便能滿足試驗(yàn)要求，并且效果很好。然而，玉葉金花模板DNA的提取及純化方法還需要改進(jìn)。退火溫度影響PCR反應(yīng)中引物與模板的特異性結(jié)合。退火溫度過(guò)高會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效率；退火溫度過(guò)低時(shí)，容易發(fā)生錯(cuò)配，出現(xiàn)引物二聚體，該試驗(yàn)篩選出53.4 ℃為最佳退火溫度。

該研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合單因素試驗(yàn)，建立了玉葉金花SSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)體系：1.50 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、0.45 μmol/L引物、2.00 U Taq DNA聚合酶、15 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL，最佳退火溫度53.4 ℃。此反應(yīng)體系可用于玉葉金花屬植物的SSR引物開(kāi)發(fā)、物種分類(lèi)鑒定、遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面的研究。

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