苗藥夜寒蘇中異姜花素D的提取及含量測(cè)定

蔣太白 林思 周曦曦?┩踅?喜

摘要 [目的]建立HPLC測(cè)定苗藥夜寒蘇中異姜花素D含量的方法，并考察其提取方法。[方法]采用Waters symmetry shieldTM RP 18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈-水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)233 nm。[結(jié)果]異姜花素D的分離度良好，在2.046～204.600 μg/mL（r=0.999 8）呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為96.55%（RSD=1.9）。[結(jié)論]該研究所建立的方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于黃姜花中異姜花素D的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 夜寒蘇；異姜花素D；提??；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）27-0183-03

Extraction and Determination of Isoflavone D in Rhizoma hedychii

JIANG Taibai1，LIN Si2，ZHOU Xixi1 et al

（1.Institute of Traditional Medicine of Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture，Kaili，Guizhou 556000；2.Department of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550002）

Abstract [Objective] The research aimed to establish a HPLC method for the determination of isochelon D in Rhizoma hedychii，and to investigate its extraction method.[Method]Chromatagraphic experiments were carried out on a Waters symmetry shieldTM RP 18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm），gradient elution was carried out with acetonitrilewater solution as mobile phase；the flow rate was 0.5 mL/min；the detection wavelength was 233 nm.[Result]The separation of isochelon D was good，and it showed a good linear relationship at 2.046～204.600 μg/mL （r=0.999 8），and the average recovery was 96.55% （RSD=1.9）.[Conclusion]The method is simple，repeatable and stable，which could be used for quality control of isocoronarin D from Rhizoma hedychii.

Key words Rhizoma hedychii；Isocoronarin D；Extraction；Content determination

基金項(xiàng)目 貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QZYY2015090）。

作者簡(jiǎn)介 蔣太白（1989—），男，苗族，貴州凱里人，執(zhí)業(yè)中藥師，碩士，從事民族醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者，主管中藥師，碩士，從事民族醫(yī)藥研究。

收稿日期 2018-05-16

苗藥夜寒蘇（Rhizoma hedychii）是姜科姜花屬植物黃姜花（Hedychium flavum Roxb.）的根莖，主要用于治療虛弱自汗、胃氣虛弱、消化不良等癥[1]，該藥收載于《貴州草藥》和《中華本草》[2]中。主要產(chǎn)地為我國(guó)云貴川地區(qū)，印度亦有分布[3]。目前研究表明，姜花屬植物富含揮發(fā)油，還有香豆素類、黃酮類、雙黃酮類、多種萜類（單萜、倍半萜及二萜類等）化合物[4-9]。王進(jìn)喜等[10]從夜寒蘇中分離到了多種半日花烷二萜類化合物，其中異姜花素D（isocoronarin D）含量較高。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，異姜花素D可以激活抗氧化反應(yīng)元件[11-14]。筆者對(duì)苗藥夜寒蘇藥材中具有抗氧化活性物質(zhì)的含量進(jìn)行分析，為該藥材的后續(xù)開(kāi)發(fā)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。試驗(yàn)藥材（共10批）采于貴州省黔東南州各地，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院王祥培教授鑒定為姜科姜花屬植物黃姜花（Hedychium flavum Roxb.），具體見(jiàn)表1。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），配Waters e2696 PDA檢測(cè)器（美國(guó)waters公司）；梅特勒-托利多 XA105DU電子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；SK7200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；DHG9070B型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.3 主要試劑。異姜花素D對(duì)照品由黔東南州民族醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)室自制，純度經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定，含量>98%，使用前置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重。甲醇、乙腈（霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司，色譜純）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備。稱取異姜花素D對(duì)照品適量，精密稱定，加色譜甲醇配制成含異姜花素D 204.6 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2 供試品溶液的制備。取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約5.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率150 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3 色譜分析條件。采用Waters symmetry shieldTM RP 18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm） （美國(guó)waters公司），流動(dòng)相為乙腈（D）-水（A），流速1.0 mL/min，梯度洗脫（0～30 min，60% D；30～40 min，100% D；40～60 min，100% D）；柱溫15 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。取供試品溶液1 mL，在 “1.2.3” 色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2 線性關(guān)系考察。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，使之配制成204.600、102.300、20.460、10.230、2.046 μg/mL的對(duì)照品溶液。取各濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在 “1.2.3” 項(xiàng)色譜條件下，測(cè)定峰面積。以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)。取同一份對(duì)照品溶液，在 “1.2.3” 項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取供試品溶液1 mL，室溫分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。

1.2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批黃姜花藥材粉末約5.0 g，共6份，按 “1.2.2” 方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。

1.2.4.6 加樣回收試驗(yàn)。精密稱取已知含量的同一批樣品9份，每份約5.0 g，分為3組，每組分別加入樣品含量一半的80%、100%、120%對(duì)照品溶液。按 “1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

1.2.5 樣品含量測(cè)定。精密稱取10批黃姜花樣品5.0 g，分別按 “1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各供試品中異姜花素D的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。由圖1可見(jiàn)，在 “1.2.4.1” 條件下，樣品中各待測(cè)組分與相鄰峰的分離度均>1.5，拖尾因子在0.95～1.05，塔板數(shù)按異姜花素D峰計(jì)算不低于4 000。異姜花素D出峰時(shí)間為40.22 min。

2.1.2 線性關(guān)系考察。按 “1.2.4.2” 方法操作，以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為Y=22.699X+3.3385（R2=0.999 8），表明各化合物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按照 “1.2.4.3” 方法操作，得出異姜花素D的峰面積均值為1 101.29，峰面積的RSD為1.7%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照 “1.2.4.4” 方法操作，得出異姜花素D的峰面積均值為1 211.49，峰面積的RSD為1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按照 “1.2.4.5” 方法操作，計(jì)算得出異姜花素D含量的RSD為2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn)。按照 “1.2.4.6” 方法操作，結(jié)果顯示（表2），異姜花素D的平均加樣回收率為96.55%，RSD為1.9%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 樣品含量測(cè)定 由表3可知，此次采集到的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量差異較明顯，不同地點(diǎn)采集的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量最高的為0.638 5 μg/g，最低為0.031 4 μg/g，兩者相差20倍。秋冬季節(jié)采集的樣品中姜花素D含量明顯高于夏末采集的樣品。

3 討論與結(jié)論

為了確保最大量地提取出異姜花素D，分別考察了超聲、加熱回流、冷浸3種提取方式，不同濃度的甲醇、乙醇等溶媒，提取時(shí)間以及提取溶劑體積。通過(guò)比較，最終的提取方案為：黃姜花藥材粉末（過(guò)40目篩）約5 g，精密加入30 mL無(wú)水乙醇，稱定重量，超聲提取30 min，靜置后補(bǔ)足重量，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

在色譜條件的選擇過(guò)程中，分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水等流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水溶液梯度洗脫分離效果好，能使異姜花素D達(dá)到基線分離。此外，在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇時(shí)，對(duì)異姜花素D待測(cè)成分在200～400 nm進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描后發(fā)現(xiàn)，異姜花素D在225 nm處整體紫外吸收良好，因此最終選擇225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

該研究所用樣品分別采至貴州省黔東南州各個(gè)地區(qū)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，收集到的藥材中均含有異姜花素D。此外采集到的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量差異較明顯，不同地點(diǎn)采集的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量最高的為0.638 5 μg/g，最低為0.031 4 μg/g，兩者相差20倍。秋冬季節(jié)采集的樣品中姜花素D含量明顯高于夏末采集的樣品，此外貴州黔東南州地貌屬于我國(guó)西部高原山地，地勢(shì)西高東低，自東南部向北、東、南三面傾斜。特定的地理位置和復(fù)雜的地形地貌，使貴州的氣候和生態(tài)條件復(fù)雜多樣，在此狀態(tài)下夜寒蘇的生長(zhǎng)受多方面的影響，因此該成分在藥材中含量差異較為明顯。

該試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定黔產(chǎn)夜寒蘇中異姜花素D含量，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999 8以上，精密度、重復(fù)性、回收率符合含量測(cè)定要求，樣品穩(wěn)定性好。

參考文獻(xiàn)

[1]

貴州省中醫(yī)研究所.貴州草藥：第2集[M].貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1970：671.

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草：第8冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：468-472.

[3] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第16卷第2分冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1981：26.

[4] 羅明華，雷利芬，林宏輝.黃白姜花化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（2）：180-182.

[5] 彭夢(mèng)潔，李玥，徐俊駒，等.長(zhǎng)瓣裂姜花根的二萜化學(xué)成分研究[J].中藥材，2017，40（7）：1604-1606.

[6] 陳建華，梁艷麗，彭夢(mèng)潔，等.小花姜花根化學(xué)成分研究[J].中藥材，2017（12）：2856-2858.

[7] 孫倩，武潔，李菲菲，等.芫花化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，31（2）：94-98.

[8] 趙慶，葉曉雯，陳凌云，等.圓瓣姜花中的單萜類成分[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，27（1）：35-36，45.

[9] 趙超，龔小見(jiàn)，陳華國(guó)，等.黔產(chǎn)夜寒蘇揮發(fā)性化學(xué)成分固相微萃取/氣相色譜/質(zhì)譜分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（7）：1090-1092.

[10] 王進(jìn)喜，周曦曦，蔣太白，等.苗藥夜寒蘇的化學(xué)成分研究[J].中藥材，2017，40（11）：2583-2585.

[11] THOMPSON J T，MIGNEN O，SHUTTLEWORTH T J.The N-terminal domain of Orai3 determines selectivity for activation of the store-independent ARC channel by arachidonic acid[J].Channels，2010，4（5）：398-410.

[12] JAGNANDAN D，CHURCH J E，BANFI B，et al.Novel mechanism of activation of NADPH oxidase 5.Calcium sensitization via phosphorylation[J].J Biol Chem，2007，282（9）：6494-6507.

[13] INOGUCHI T，LI P，UMEDA F，et al.High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen species production through protein kinase C-dependent activation of NAD（P）H oxidase in cultured vascular cells[J].Diabetes，2000，49（11）：1939-1945.

[14] ENDRINGER D C，TAVEIRA F S N，KONDRATYUK T P，et al.Cancer chemoprevention activity of labdane diterpenes from rhizomes of Hedychium coronarium[J].Revista brasileira de farmacognosia，2014，24（4）：408-412.