安徽和縣地區(qū)辣椒病株辣椒輕斑駁病毒的鑒定

嚴(yán)丹侃 鄭紅英 張海珊

摘要 [目的]鑒定安徽和縣地區(qū)辣椒病株辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV） （PMMoV-AH）。[方法]采用膠體金免疫層析試紙條和RT-PCR檢測和縣辣椒病樣辣椒輕斑駁病毒，并將其外殼蛋白基因序列與已報道的國內(nèi)外12個PMMoV分離物進(jìn)行同源性分析。[結(jié)果]PMMoV-AH與已報道的12個分離物核苷酸同源性介于94.5%～100.0%，氨基酸同源性介于96.8%～100.0%?；谕鈿さ鞍谆蛐蛄羞M(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，PMMoV-AH與亞洲分離物親緣關(guān)系密切，與其他區(qū)域分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。[結(jié)論]PMMoV危害性強，對于其在安徽地區(qū)的發(fā)生和防治還需進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞 辣椒輕斑駁病毒；外殼基因；和縣

中圖分類號 S436.418.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）32-0082-03

Identification of Pepper Mild Mottle Virus in Hexian，Anhui Province

YAN Dankan1，ZHENG Hongying2，ZHANG Haishan1 et al （1.Institute of Plant Protection and AgroProducts Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Heifei，Anhui 230031；2.Institute of Virology and Biotechnology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021）

Abstract [Objective]To identify the pepper mild mottle virus in Hexian，Anhui Province.[Method]The PMMoVAH was identified in the sample of diseased fruits of pepper which collected in Hexian by using immunochromatography colloidal gold strip and RTPCR method.The pair of universal primers was used to amplify the coat protein gene sequence of PMMoVAH.[Result]Sequence analysis and phylogenetic analysis showed that PMMoVAH was closely related to 12 PMMoV isolates reported in China and abroad with nucleotide sequence identity between 94.5%-100.0% and amino acid sequence identity between 96.8%-100.0%.Phylogenetic tree showed that PMMoVAH was closely related to Asian isolates but not with other isolates.[Conclusion]Due to the significant losses caused by PMMoV，further research is required to control and prevent the prevailing of the disease caused by PMMoV in Anhui Province.

Key words Pepper mild mottle virus；Coat protein gene；Hexian

基金項目 國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303028）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項目 （17A1125）；安徽省蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系。

作者簡介 嚴(yán)丹侃（1986—），男，安徽滁州人，助理研究員，碩士，從事植物病毒與媒介昆蟲研究。*通訊作者，章東方，研究員，從事植物病毒與媒介昆蟲研究；燕飛，研究員，博士，從事植物病毒學(xué)研究。

收稿日期 2017-11-28；修回日期 2018-05-30

辣椒病毒病是辣椒生產(chǎn)中的重要病害，目前已發(fā)現(xiàn)近 40種病毒可以侵染辣椒[1-2]，包括煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、 黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV） 、馬鈴薯 Y 病毒（potato virus Y，PVY）、蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）和辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）等。安徽省和縣是全國著名的蔬菜生產(chǎn)基地，截至2016年底，該縣種植蔬菜面積2.87萬hm2，年產(chǎn)蔬菜110萬t。和縣蔬菜生產(chǎn)以秋延辣椒生產(chǎn)聞名，常年種植面積0.67萬hm2以上，鮮產(chǎn)紅辣椒20多萬t，是全國綠色食品原料（辣椒）標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地，“和縣辣椒”品牌獲得地理標(biāo)志商標(biāo)。近年來，和縣辣椒生產(chǎn)上辣椒病毒病危害加重，特別是當(dāng)?shù)刂髟岳苯菲贩N“好農(nóng)11”發(fā)病嚴(yán)重。染病辣椒葉片癥狀較輕，而果實癥狀明顯，呈現(xiàn)斑駁、凹陷和壞死等病毒病癥狀，后期辣椒果實外觀和內(nèi)在品質(zhì)均顯著變差，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)乩苯飞a(chǎn)。為明確該病毒病種類，筆者采用血清學(xué)和 RT-PCR 等方法對該病毒進(jìn)行了鑒定，并對其所感染病毒的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析，從而為和縣辣椒病毒病防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 2016年 10 月—2017年4月在安徽省和縣溫室大棚采集辣椒樣本（PMMoV-AH），采集樣本為具有明顯扭曲或斑駁等癥狀的辣椒病果，將其保存于-70 ℃冰箱中備用。

供試 PMMoV膠體金免疫層析試紙條購自美國Agdia公司；植物總 RNA 提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit購自TaKaRa公司；PCR擴增采用的Premix TaqTM購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 辣椒果實總RNA提取和cDNA合成。選取 2 份經(jīng) DAS-ELISA 檢測為陽性的辣椒病葉，提取病葉總 RNA，以2份溫室培育的健康辣椒葉片作為陰性對照，每份樣品稱取 0.1 g。按照 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit說明書提取RNA，以 M4-T[5-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3] 為起始引物[3]，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Toyobo 公司）合成病毒基因組RNA的第一鏈cDNA，具體方法參照說明書。

1.2.2 外殼蛋白基因序列的克隆與測序。通用引物 Tob Uni1：5′-ATTTAAGTGGAGGGAAAACCACT-3′和 Tob Uni2：5′-GTYGTTGATGAGTTCGTGGA-3′用于擴增煙草花葉病毒屬病毒[4]，引物的合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR酶采用Premix TaqTM（TaKaRa公司），反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照產(chǎn)品說明書。取 PCR 產(chǎn)物 5 μL 在 1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后于凝膠成像儀上觀察、拍照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收后，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行克隆測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒果實采集與膠體金免疫層析試紙條檢測

安徽和縣辣椒種植區(qū)辣椒果實呈現(xiàn)明顯的斑駁癥狀，其中辣椒呈現(xiàn)青綠色時出現(xiàn)黃色斑塊，果實在成熟時不能轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，出現(xiàn)黃色斑塊；辣椒植株和葉片癥狀不明顯（圖1）。對采集到的辣椒病果進(jìn)行PMMoV膠體金免疫層析試紙條檢測，辣椒病果呈陽性，表明采集到的樣品中攜帶 PMMoV，而健康的辣椒果實中未檢測到PMMoV存在。

2.2 RT-PCR 檢測結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，2份辣椒病果樣品RNA經(jīng)通用引物擴增大小約為750 bp的預(yù)期目的片段，經(jīng)克隆測序后比對，發(fā)現(xiàn)為PMMoV的外殼蛋白基因序列，陰性對照的健康辣椒葉片中未出現(xiàn)擴增條帶（圖2）。

2.3 序列測定與分析

將PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收后進(jìn)行克隆測序，并將所獲得的序列結(jié)果提交至 GenBank（登錄號為MG437273）。從GenBank中獲得PMMoV其他12個分離物全基因組序列，以同屬的TMV和番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）為外群，根據(jù)外殼蛋白基因序列，使用DNAstar軟件中的MegAlign進(jìn)行開放閱讀框及非編碼區(qū)序列比對分析，結(jié)果表明（表1）PMMoV-AH 與選取的 12 個 PMMoV 分離物核苷酸序列同源性為 94.5%～100.0%；與亞洲分離物同源性均為97.9% 以上； 與中國保定和日本茨城分離物XJ-01同源性達(dá)100.0%；而與歐洲的 3 個分離物 PMMoV-Is、PMMoV-I 和 PMMoV-Ia 的同源性相對較低（94.5%～94.9%）；與外群ToMV同源性僅為 67.7%，與 TMV同源性僅為 65.8%。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，PMMoV-AH 與12 個 PMMoV 分離物氨基酸的序列同源性為96.8%～100.0%； 除中國貴州分離物PMMoV-Guizhou外，與其他亞洲分離物同源性均達(dá)100.0%；而與歐洲分離物同源性稍低，為96.8%～98.1%；與外群 ToMV 和 TMV 的同源性僅為 73.7%和 71.8%。

2.4 基于外殼蛋白基因序列的進(jìn)化關(guān)系分析

將 PMMoV-AH 外殼蛋白基因序列與已知的12 個 PMMoV 分離物和外群ToMV和TMV的外殼蛋白基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖 3），使用Mega6.0軟件[5]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，采用鄰位相接聚類分析法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用1 000次重復(fù)的自展檢驗評價系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。所有PMMoV 分離物形成兩大支系群體，來自亞洲（中國、日本、韓國和印度）的分離物聚為 1 個分支，而來自以色列和歐洲（西班牙和意大利 ）的3 個分離物形成另1個分支。

3 討論與結(jié)論

PMMoV自從在新疆被首次報道以來[6]，陸續(xù)在陜西、山東、河北、北京、寧夏、貴州、臺灣、甘肅、青海、遼寧和湖南等地被發(fā)現(xiàn)，其危害面積逐步增加。該研究通過膠體金免疫層析試紙條和RT-PCR檢測，確定安徽和縣地區(qū)辣椒上暴發(fā)的病毒為辣椒輕斑駁病毒，這是該病毒在安徽地區(qū)的首次報道。通過對PMMoV外殼蛋白基因序列與其他地區(qū)的分離物同源性進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明PMMoV-AH 與已報道的 12 個其他分離物同源性較高，核苷酸同源性介于94.5%～100.0%，氨基酸同源性介于96.8%～100.0%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)， PMMoV-AH與亞洲分離物親緣關(guān)系密切。和縣作為安徽省重要的蔬菜生產(chǎn)區(qū)，辣椒生產(chǎn)遭受PMMoV危害十分嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為辣椒果實變小畸形、果面斑駁，影響果實的外觀和品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。同時，該病毒在辣椒種子、加工辣椒和人類糞便中均可檢出，且具有侵染性[7-8]。因此，重視 PMMoV 對辣椒生產(chǎn)的威脅，加強優(yōu)質(zhì)辣椒抗性品種的選育，建立高效簡便、快捷靈敏的檢測和防治方法已十分緊迫。

參考文獻(xiàn)

[1]

KAZINCZI G，HORVTH J，GBORJNYI R.Some aspects of pepper virus research[J].Acta phytopathologica et entomologica hungarica，2001，36（3/4）：329-347.

[2]MIJATOVIC′ M，IVANOVIC′ M，OBRADOVIC′ A，et al.Potato virus Y （PVY） on pepper in Serbia[J].Acta horticulturae，2002，579：545-549.

[3] CHEN J，CHEN J，ADAMS M J.A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae，and its use to examine the taxonomic status of several members of the family[J].Archives of virology，2001，146（4）：757-766.

[4] LETSCHERT B，ADAM G，LESEMANN D E，et al.Detection and differentiation of serologically crossreacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP[J].Journal of virological methods，2002，106（1）：1-10.

[5] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6： Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J].Molecular biology and evolution，2003，30（12）： 2725-2729.

[6] 向本春，謝浩，崔星明，等.新疆辣椒輕微斑駁病毒的分離鑒定[J].病毒學(xué)報，1994，10（3）：240-245.

[7] ZHANG T，BREITBART M，LEE W H，et al.RNA viral community in human feces：Prevalence of plant pathogenic viruses[J].PLoS Biology，2005，4（1）：108-118.

[8] PENG J J，SHI B B，ZHENG H Y，et al.Detection of pepper mild mottle virus in pepper sauce in China[J].Archives of virology，2015，160（8）：2079-2080.