高效除臭菌的分離篩選及Biolog鑒定

竇建軍 徐芯渝

摘要 [目的]對高效除臭菌進行分離篩選及Biolog鑒定。[方法]以養(yǎng)豬場的豬糞便和生物滴濾器中的生物膜為樣本，經(jīng)過分離純化，得到3株具有除臭作用的菌株，命名為DR、DJ、DS，分別對DR、DJ和DS進行16S rRNA和26S rRNA菌種鑒定和Biolog鑒定。[結(jié)果]DR、DJ和DS在48 h可以使臭源的惡臭強度從4.0級降低至2.5級左右。經(jīng)16S rRNA菌種鑒定，DR、DJ和DS分別為副干酪乳桿菌、啤酒酵母菌和梭形桿菌，均為革蘭氏陽性菌；在Biolog鑒定試驗中，DR、DJ和DS不僅能夠代謝20多種糖類及其衍生物，產(chǎn)生乙醇、乳酸、醋酸等物質(zhì)，而且還能夠代謝10多種氨基酸及其衍生物，尤其是腐胺這種低嗅閾值的惡臭物質(zhì)。[結(jié)論] DR、DJ和DS是高效除臭菌，對于有機質(zhì)惡臭污染的控制有一定的作用。

關鍵詞 除臭菌；分離篩選；16S rRNA；26S rRNA；Biolog

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）32-0066-05

Isolation and Screening of Highefficiency Deodorizing Bacteria and Identification of Biolog

DOU Jianjun1，XU Xinyu2

（1.Chongqing Mulian Environmental Protection Engineering Co.，Ltd.， Chongqing 400000；2.Faculty of Urban Construction and Environment Engineering， Chongqing University， Chongqing 400045）

Abstract [Objective] The aim was to isolate and screen highefficiency deodorant bacteria and perform Biolog identification.[Method] Using the pig manure from the pig farm and the biofilm in the biological drip filter as samples， three strains with deodorization were obtained by separation and purification， named DR， DJ， DS， 16S rRNA and 26S rRNA species identification and Biolog identification were performed on DR， DJ and DS， respectively.[Result]DR， DJ and DS can reduce the malodor intensity of the stinky source from 4.0 to 2.5 at 48 h.According to 16S rRNA strain identification， DR， DJ and DS were respectively Lactobacillis paracasei， Saccharomyces cerevisiae and Lysinibacillis sphaericus， which were Grampositive bacteria；in the Biolog identification test， DR， DJ and DS could not only metabolize more than 20 kinds of sugars and their derivatives， but also produced ethanol， lactic acid， acetic acid， etc.， and also metabolized more than 10 amino acids and their derivatives， especially the odorous substance of the low odor threshold of putrescine.[Conclusion]DR， DJ and DS are highefficiency deodorizing bacteria， which have a certain effect on the control of organic odor pollution.

Key words Deodorizing bacteria；Isolation and screening；16S rRNA；26S rRNA；Biolog

作者簡介 竇建軍（1982—），男，山西壽陽人，高級工程師，博士，從事環(huán)境微生物及微生物生態(tài)研究。*通訊作者，碩士研究生，研究方向：水污染控制。

收稿日期 2018-07-04；修回日期 2018-07-12

惡臭污染屬于大氣污染，是由于刺激嗅覺器官而引起的心理不愉快，嚴重時會影響生活環(huán)境。由于惡臭污染是以人的嗅覺感知為判斷標準，因此區(qū)別于其他類型的污染。已知的惡臭氣體中，易對生命造成傷害的有幾十種，危害較大的如二甲基二硫、三甲胺、硫酚類化合物、硫醇類化合物甲胺、和苯乙烯等，而最常見的就是氨氣和硫化氫[1]。

目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的除臭菌包括賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaeficus）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、異常威克漢姆酵母（ Wickerhamomyces anomalus）、植物乳酸菌（Lactobacillus plantatum）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermo philus）等[2-4]。筆者從養(yǎng)豬場的豬糞便和生物滴濾器中的生物膜中取樣，經(jīng)過分離純化，得到3株具有除臭作用的菌株，命名為DR、DJ、DS，通過對菌株的培養(yǎng)及脫硫脫氮性能的研究，并經(jīng)過16S rRNA和26S rRNA的菌種鑒定，為其將來運用于垃圾場、養(yǎng)殖場及污水處理場提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。

養(yǎng)豬場中新鮮及經(jīng)過堆肥和腐熟的豬糞便，運行良好的生物滴濾器中生物膜。

1.1.2 儀器。

電熱恒溫培養(yǎng)箱- HPX-9272MBE（上海博訊公司）；QYC-200小型恒溫搖床（上海?，敼荆?；數(shù)顯控溫水浴鍋-GKC112（上海浦東新區(qū)電理儀器廠）；TProfessional 196全自動 PCR擴增儀（德國Biometra公司）；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（UVP）（BioSpectrum AC+Gel Camera 美國UVP公司）；BA200顯微鏡（MOTIC，麥克奧迪）；Biolog微生物自動鑒定儀- MicrogStation（美國BIOLOG公司）；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；高速離心機-HC-2518（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Starter 3100 pH計（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；生化培養(yǎng)箱- SPX智能型（上海予騰生物科技有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱-JC303（上海成順儀器儀表有限公司）；752紫外可見分光光度計（上海右一儀器有限公司）。

1.1.3 試劑。氯化鈉、硫酸鎂等均為國產(chǎn)分析純，蛋白胨、牛肉膏等為生物試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基。

1.2.1.1 菌種富集培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2.1.2 菌種篩選培養(yǎng)基。

（1）除臭菌株篩選培養(yǎng)基。孟加拉紅培養(yǎng)基3.5%、酵母膏0.1%、蛋白胨1.5%、葡萄糖1.0%、瓊脂1.8%、pH 6.0，121 ℃滅菌 20 min，葡萄糖單獨進行滅菌。

（2）除氮菌株篩選培養(yǎng)基。蛋白胨1.0%、牛肉粉0.5%、酵母粉0.5%、葡萄糖2.0%、吐溫80 0.1%、磷酸氫二鉀02%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三鈉0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、碳酸鈣1.0%，pH 6.3～6.8，121 ℃滅菌 20 min。

（3）除氮菌株篩選培養(yǎng)基。大豆胨0.5%、蛋白胨0.025%、酪蛋白胨0.03%、酵母浸粉0.3%、牛肉粉0.5%、乳糖0.6%、抗壞血酸0.05%、β-甘油磷酸鈉2%、硫酸鎂0.025%、瓊脂2%、pH 7.0～7.4，121 ℃滅菌 20 min。

（4）除硫菌株篩選培養(yǎng)基。氯化銨0.2%、磷酸氫二鉀0.05%、氯化鎂0.02%、碳酸氫鈉0.5%、氯化鈉0.5%、九水硫化鈉0.06%、檸檬酸鈉1.5%，pH 7.2，121 ℃滅菌 20 min。

1.2.2 菌種的分離和純化。

將養(yǎng)豬場的糞便以采集的生物膜分別置于錐形瓶中，加入100 mL純水進行稀釋，取20 mL加入200 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基當中，分為兩組進行培養(yǎng)，A組在35 ℃、120 r/min的搖床中恒溫培養(yǎng)，B組放置于35 ℃恒溫厭氧缸中靜置進行厭氧培養(yǎng)，富集10 d。

將兩組發(fā)酵液進行梯度稀釋，用平板涂布法接種在篩選培養(yǎng)基平板上，放置在35 ℃培養(yǎng)箱中，A組直接進行培養(yǎng)，B組繼續(xù)進行厭氧培養(yǎng)，挑取平板上長出的單菌落用劃線法反復進行純化，直到得到單一的菌株。

將篩選到的菌株進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d以后將培養(yǎng)液噴灑在糞便上，間隔6 h用嗅辨法測定糞便的惡臭強度。臭味強度指人們通過嗅覺感覺到的氣味的強弱程度，0級為無氣味；1級為能稍微感覺出極微弱的臭味；2級為能勉強辨別出臭味的品質(zhì)；3級可明顯感覺到有臭味；4級為較強的氣味；5級為讓人無法忍受的強烈臭味。當臭味強度超過3級時，即可認為大氣已受到惡臭污染。具體方法為：由3名嗅辨員測定惡臭強度，取其平均值。選擇具有除臭效果的菌株用甘油保種方法，置于4 ℃的冰箱中進行菌種保藏[5]。

1.2.3 菌種的形態(tài)特征觀察。

1.2.3.1 菌落形態(tài)觀察。

觀察平板中固體培養(yǎng)基上的菌落，描述其大小、顏色、形狀等。

1.2.3.2 革蘭氏染色觀察。

用接種環(huán)挑取待測固體培養(yǎng)基上經(jīng)過篩選后純化的菌落，在滴過純水的載玻片上涂勻成薄膜狀，使載玻片通過酒精燈火焰，加熱并將細菌固定。

然后對其進行革蘭氏染色：

①加草酸銨結(jié)晶紫1滴，約1 min，水輕輕沖洗；

②媒染：滴加盧戈氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1 min，水輕輕沖洗；

③用95%乙醇滴洗涂片，直至流出乙醇不出現(xiàn)紫色為止，脫色約20 s，立即用水沖凈乙醇；

④用番紅染液復染1 min，水輕輕沖洗。

在光學顯微鏡下對染色后的菌體形態(tài)100倍放大進行觀察記錄。

1.2.4 菌種的rRNA序列分析。

在PCR管中添加4 μL無菌超純水，然后用無菌的槍頭挑取單菌落在其中洗脫作為PCR模板，上下引物均選取細菌通用引物，①上游引物（27F）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物（1492R）：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′；②上游引物（F341）：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′和下游引物（R518）：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；③上游引物（NL1）：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，下游引物（LS2）：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′[6-7]。

建立PCR的反應體系50 μL：模板 4 μL、Master Mix 25 μL、27F（10 μmol/L）2 μL、1492R（10 μmol/L）2 μL，ddH2O補足至 50 μL。反應條件：95 ℃預反應5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，反應循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；18 ℃保溫60 min。

反應完成，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物純度以及大小：預先制備的1%的瓊脂糖凝膠，內(nèi)含核酸染料，PCR反應完成后，取4 μL的PCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中，在1×TAE的電泳液中進行電泳，電壓100 V。使用凝膠成像系統(tǒng)，在紫外燈下觀察，檢測合格后，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將PCR產(chǎn)物委托金瑞斯生物科技有限公司進行測序，并將測序結(jié)果中Blast板塊與Genbank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中已有細菌的16S rRNA 序列進行相似性比對。

1.3 菌種的Biolog鑒定分析

Biolog系統(tǒng)說明如表1所示[8]。Biolog 技術(shù)的操作順序如表2所示。根據(jù)之前的rRNA序列分析，判斷菌種類型，試驗程序按 Biolog公司的操作指南，菌株DR使用Biolog GENⅢ Plate，DJ和DS使用Biolog EcoPlate進行，所有菌株在Biolog推薦的培養(yǎng)基（ BUG + B）上在30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h[9]。用木制接種棒挑取外半部分的單菌落，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)幾圈，將菌落轉(zhuǎn)移至試管內(nèi)壁，將其接種在GN/GP-IF接種液中，進行攪動，使菌落分散均勻，制成懸濁液。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離和純化

從養(yǎng)豬場糞便以及生物膜中分離得到3株具有除臭作用的菌株，命名為DR、DJ和DS，其中，DR分離自生物膜中，在厭氧環(huán)境下生長；菌株DS和DJ來自豬糞，DJ在厭氧環(huán)境下生長，DS則能同時在有氧和缺氧條件下生長。菌株DR、DJ和DS對惡臭強度的緩解能力見表3。從表3可以看出，所得到的3株菌株對惡臭均有著較好的控制能力，在48 h內(nèi)，惡臭強度能從4級降至2.2～2.5級。

2.2 菌種的形態(tài)特征

DR、DJ和DS對應的菌落形態(tài)以及經(jīng)過革蘭氏染色后的顯微鏡觀察結(jié)果如圖1和表4所示。

2.3 菌種的rRNA序列分析

對DR、DJ和DS的PCR擴增產(chǎn)物用電泳凝膠成像系統(tǒng)進行檢查，如圖2所示，DS和DJ在1 500 bp處的明亮條帶，DR在500 bp處的明亮條帶，其擴增結(jié)果良好，符合微生物rRNA測序的要求。

2.4 生長曲線的測定及pH變化

根據(jù)測得的OD600的吸光度和pH，以時間（h）為橫坐標，繪制了菌株DR的生長曲線，并描述了在生長過程中DR的pH變化（圖3）。

菌株DR在初始12 h處于生長延緩期，生長速率較緩慢；12～22 h進入對數(shù)生長期，22～32 h為其生長穩(wěn)定期，在培養(yǎng)過程中pH不斷下降至3.56，在厭氧培養(yǎng)過程中，在厭氧呼吸的作用下產(chǎn)生大量乳酸改變了培養(yǎng)液的pH。

菌株DJ的生長較迅速，在經(jīng)歷了4 h的生長延緩期后就迅速進入了對數(shù)生長期，10 h后進入生長穩(wěn)定期；在培養(yǎng)過程中pH在5～7浮動，略有增加的趨勢；DJ的生長曲線符合一般細菌的生長規(guī)律；菌株DJ的穩(wěn)定期較長，便于批量培養(yǎng)。

菌株DS的生長較快，生長延緩期只有短暫的2 h，緊接著就開始了對數(shù)生長期直到14 h，14～22 h為生長穩(wěn)定期；在培養(yǎng)過程中pH在9.35上下浮動，先下降后升高；由于菌株DS的衰亡非常緩慢，便于批量培養(yǎng)，因此選取培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)物進行后續(xù)試驗。

2.5 菌種的Biolog鑒定分析

3株除臭菌株在Biolog ECO和GENIII鑒定板上的顯色反應如圖4所示。以A1孔為對照，定義為陰性反應，記錄GenIII鑒定板1～9列共71種碳源，分析它們的利用情況。從顯色反應的結(jié)果來看，與A1孔類似的反應標記為“陰性”反應（-），看起來偏紫色（深于A1）的標記為“陽性”反應（+）。有時，Biolog的平板總微孔中的色反應不明顯的則標記為中性（＼）。以GenIII鑒定板的A10孔為對照，10～12列所檢測的是化學敏感性，孔內(nèi)吸光值不到A10孔的一半，定為“陰性”反應（-），孔內(nèi)吸光值超過A10孔一半的反應被定為“陽性”反應（+）。

從圖4可看出，3株細菌的陽性反應均很明顯，對鑒定板中碳源的利用情況不完全相同（顯色反應上存在一些差異）。

Biolog Eco鑒定板含有31種不同的碳源，每一種碳源重復3組。通過分析菌株對幾種典型的碳源底物在不同生長階段的代謝情況，來描述各菌株之間對于不同碳源的利用差異。鑒定板中的碳源底物根據(jù)其官能團和代謝途徑的不同可分為6類：糖類及其衍生物、羧酸、氨基酸、多聚物、酚酸類和胺類。Biolog Eco鑒定板反應一般采用每孔顏色平均變化率（AWCD）[8]來描述，表征微生物利用碳源的整體能力以及微生物的代謝活性。

菌株DR的碳源利用情況如圖5，在培養(yǎng)初始階段，利用率最高的是D-海藻糖和D-果糖，且DR對于這2種碳源的高利用效率始終持續(xù)到碳源消耗殆盡。初始階段對于L-乳酸和α-羥基-丁酸也有利用，但是略低于D-海藻糖和D-果糖，可見以上4種碳源都是DR最容易利用的碳源，同時消耗速度也非常快。在24 h時，肌苷、甘油和N-乙酰神經(jīng)氨酸也能得到利用，其中肌苷的利用能力最好，相對維持的時間也更長。最滯后的是乙酸，在48 h后才開始得到充分利用。

利用能力最高的9種碳源底物中，4種是糖類，4種是羧酸，1種是脂類[11]。最終的消耗結(jié)果分別為甘油>乙酸>肌苷>N-乙酰神經(jīng)氨酸>α-羥基-丁酸>蜜二糖>D-果糖>L-乳酸>D-海藻糖。

除此之外，菌株DR對包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、水楊苷、龍膽二糖等在內(nèi)的10種糖類都有一定的利用能力，在代謝過程中產(chǎn)生乙醇、乳酸、醋酸等產(chǎn)物，同時，對組胺、N-乙酰-D-半乳糖胺等多種氨基酸及其衍生物有降解作用，也說明菌株DR對氨基酸類物質(zhì)的利用能力遠不及糖類物質(zhì)。

菌株DJ的碳源利用情況如圖6，事實上DJ對多種碳源都能很好的利用，因此在碳源消耗上較均勻持久，在此僅選取了其中最為顯著的一部分。菌株DJ的適應期較長，在24 h 后出現(xiàn)明顯的變色反應，其中最容易被利用的I-赤藻糖醇，其利用效率緩慢穩(wěn)定持久，一直持續(xù)到中后期；48 h時，D-纖維二糖的利用效率明顯提升，且穩(wěn)定增長，持續(xù)代謝；在72 h時，L-天冬酰胺酸的吸光度增長率迅速升高。D-蘋果酸直到84 h才開始進行劇烈的代謝反應。而D-葡萄胺酸在DJ生長的整個過程都是持續(xù)穩(wěn)定的碳源，其吸光度穩(wěn)定增長。菌株DJ作為一種酵母菌它還能將腐胺（丁二胺）這種嗅閾值極低的惡臭物質(zhì)進行代謝。

6種碳源底物[12]中，2種屬于糖類及其衍生物，3種是羧酸，1種屬于氨基酸底物及其衍生物，最終的AWCD值分別為L-天冬酰胺酸>D-葡萄胺酸>D-蘋果酸>I-赤藻糖醇>D-纖維二糖>N-乙酰-D-葡糖胺。

3 結(jié)論

從臭源豬糞便等篩選獲得了能夠高效去除氨氣和硫化氫等惡臭物質(zhì)的3種菌株DR、DJ和DS，對其進行形態(tài)觀察、分子生物學鑒定以及生長曲線測定，3種菌種分別為副干酪乳桿菌（Lactobacillis paracasei sp.）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和梭形桿菌（Lysinibacillis sphaericus）。經(jīng)過Biolog的

鑒定分析，DR、DJ、DS不僅對20多種糖類及其衍生物類型的碳源具有良好的利用能力，并在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生乙醇、乳酸、醋酸等物質(zhì)，而且對10多種氨基酸及其衍生物類型的碳源有良好的代謝能力，尤其是腐胺這種低嗅閾值的惡臭物質(zhì)，這對于有機質(zhì)惡臭污染的控制有一定作用。

基于已經(jīng)得到的高效除臭菌株，可以通過物理、化學等多種誘變方法使其基因突變，得到更加高效、廣譜的菌株，獲得更高降解效率，并深入研究除臭菌株的大罐發(fā)酵的技術(shù)；尋找菌株之間的最佳組合和最佳除臭效率，以期能更好地應用于實際的工業(yè)化生產(chǎn)中。

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