不同提取方法所得迷迭香凈油的品質(zhì)研究

陳明 張文龍 楊上鶯 錢建文 念小魁 徐蘭蘭 袁林翠

摘要[目的]探討傳統(tǒng)方法和綠色方法提取的迷迭香凈油的品質(zhì)差異。[方法]通過對(duì)迷迭香凈油的感官指標(biāo)、組成成分、主要活性物質(zhì)的含量以及清除DPPH自由基（DPPH·）的能力進(jìn)行分析，比較回流提取法、油提法和超聲油提法所得迷迭香凈油的品質(zhì)。 [結(jié)果]回流提取法和超聲油提法制備的迷迭香凈油在感官和得率等指標(biāo)上相近。3種迷迭香凈油均含有多種芳香成分和維生素E（VE），超聲油提迷迭香凈油（Ab-us）VE含量最高，回流提取迷迭香凈油（Ab-cv）VE含量最低，油提取迷迭香凈油（Ab-o）還含有一定量的甾醇。Ab-us含有迷迭香酸，其抗氧化物的含量最高，體外抗氧化活性和貯藏穩(wěn)定性優(yōu)于其余2種凈油，是具有開發(fā)價(jià)值的天然抗氧化劑。[結(jié)論]研究可為迷迭香凈油的制備及工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞迷迭香凈油；超聲油提取法；抗氧化活性

中圖分類號(hào)TS264.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0178-05

Abstract[Objective]To study the quality difference of rosemary absolute oil which was extracted by traditional method and green method. [Method]Rosemary absolute oils extracted by heat reflux extraction， oil extraction and ultrasoundassisted oil extraction were compared through the analysis of sensory index， chemical compositions， content of active ingredients and scavenging effects of DPPH radicals. [Result]Results showed that the sensory and yield of rosemary absolute oils extracted by heat reflux extraction and ultrasoundassisted oil extraction were similarity and better than that extracted by oil extraction. All of the rosemary absolute oils contented multiple aroma constituents and vitamin E （VE）. Among them rosemary absolute oil extracted by ultrasoundassisted oil extraction （Abus） had the highest content of VE while rosemary absolute oil extracted by heat reflux extraction （Abcv） had the lowest. Rosemary absolute oil extracted by oil extraction also contented sterol. Rosmarinic acid was found in Abus. Abus not only had obvious advantages on the antioxidant content， but also on the antioxidant activity in vitro and storage stability. [Conclusion]The study can provide a theoretical basis for the preparation and industrial application of rosemary oil.

Key wordsRosemary absolute oil；Ultrasound assisted oil extraction；Antioxidant activity

迷迭香是唇形科迷迭香屬多年生常綠亞灌木，是目前公認(rèn)的具有高效抗氧化作用且安全無毒的香料作物。迷迭香原產(chǎn)地中海國(guó)家，云南氣候條件適宜，成功引種迷迭香，且形成了一定規(guī)模[1]。迷迭香香氣清涼、濃郁并帶有甜樟腦的氣息，因而被作為香料用于食品、日化品等產(chǎn)品中。此外，迷迭香還具有防腐、抗菌、提高記憶力等功效[2-5]。迷迭香凈油是迷迭香經(jīng)有機(jī)溶劑提取后所得浸膏的乙醇抽提物，屬于天然抗氧化劑。迷迭香凈油含有多種抗氧化成分，其抗氧化成分之一鼠尾草酸在凈油制備過程中將會(huì)分解為親脂性更強(qiáng)的二萜類物質(zhì)，這些萜類物質(zhì)在100 ℃以上仍然具有抗氧化性。Guo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物在240 ℃油炸環(huán)境中被氧化后生成的二級(jí)和三級(jí)代謝產(chǎn)物仍然具有穩(wěn)定的抗氧化活性，彌補(bǔ)了一些天然抗氧化劑只能在較低溫度下保持抗氧化活性的缺陷[7]。同時(shí)，迷迭香凈油與具有一定潛在毒性[8]的人工合成抗氧化劑[2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）和丁基羥基茴香醚（BHA）等]相比，安全性較高。綜上所述，迷迭香凈油在高溫食品中具有一定的應(yīng)用前景。

然而目前凈油的提取方式還局限于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取，即使用石油醚等弱極性溶劑對(duì)迷迭香原料進(jìn)行提取制得浸膏，之后再用乙醇進(jìn)行萃取、濃縮。這種方式雖然簡(jiǎn)單，但是提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗高，提取溶劑也具有一定毒性?；诖?，使用弱極性的食用油作為提取溶劑代替石油醚，則可以提高迷迭香凈油產(chǎn)品的安全性。近年來，不論是采用新型綠色溶劑還是新提取技術(shù)（如超聲波）制備迷迭香凈油的報(bào)道都比較少。而各提取方法又各有優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致迷迭香凈油的得率和品質(zhì)有所差別。因此，筆者從迷迭香凈油的品質(zhì)出發(fā)，探討了傳統(tǒng)方法和綠色方法提取的迷迭香凈油在感官、理化、組成和活性等方面的差異，為迷迭香凈油制備方法的研究和工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。迷迭香干燥粉末，水分含量為9.4%，過40目篩；葵花籽油，昆明沃爾瑪惠宜。

1.1.2主要試劑。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，貴州迪大生物科技有限公司；福林酚試劑，山西西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基-肼基（DPPH），Alfa Aesar；BHT（99%），山東西亞化學(xué)股份有限公司；鼠尾草酸（98%）、鼠尾草酚（98%）、迷迭香酸（98%）和熊果酸（98%），均為中國(guó)江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；正己烷、無水乙醇（提取用）、碳酸鈉、甲醇、磷酸均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；無水乙醇（檢測(cè)用）、乙腈，均為國(guó)產(chǎn)色譜純?cè)噭?/p>

1.1.3主要儀器。

PTHW型5 000 W加熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；PC-420型磁力攪拌器，美國(guó)Corning；100 D型超聲波發(fā)生器，北京宏祥隆生物科技有限公司；5804R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；T6型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；6890-5975 N型氣相色譜/質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent；2695型HPLC液相色譜儀，美國(guó)Waters。

1.2方法

1.2.1迷迭香凈油的提取。

1.2.1.1回流提取法。

稱取適量迷迭香粉末，按料液比1∶20（W/W）加入正己烷，回流提取2 h，得到提取液。過濾后取濾液，于50 ℃下減壓濃縮至干。之后加入其2.5倍體積的無水乙醇，充分振蕩萃取。將乙醇萃取液于8 000 r/min下離心15 min，取上清液于50 ℃減壓濃縮，待乙醇完全蒸干后得到回流提取迷迭香凈油（Ab-cv）。

1.2.1.2油提法。

稱取適量迷迭香粉末，按料液比1∶20（W/W）加入葵花籽油后在室溫下攪拌提取2 h，得到提取液。過濾后取濾液，在濾液中加入其2.5倍體積的無水乙醇，充分振蕩萃取，取乙醇層萃取液，于50 ℃減壓濃縮，然后于-15 ℃下冷凍過夜以完全分離殘留油脂。冷凍液離心20 min（8 000 r/min），取上清液于50 ℃下減壓濃縮，待乙醇完全蒸干后得到油提取迷迭香凈油（Ab-o）。

1.2.1.3超聲油提法。

稱取適量迷迭香粉末，按料液比1∶20（W/W）加入葵花籽油后，在功率為400 W的超聲波下攪拌提取15 min，過濾后取濾液，在濾液中加入其2.5倍體積的無水乙醇，充分振蕩萃取，取乙醇層萃取液，于50 ℃減壓濃縮，然后于在-15 ℃下冷凍過夜以完全分離殘留油脂。冷凍液離心20 min（8 000 r/min），取上清液于50 ℃下減壓濃縮，待乙醇完全蒸干后得到超聲油提迷迭香凈油（Ab-us）。

1.2.2

感官評(píng)價(jià)。以15位專業(yè)人員組成感官評(píng)定小組，對(duì)不同提取方法所得迷迭香凈油進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分別對(duì)比其在透明度、色澤、流動(dòng)性和氣味方面的差異。

1.2.3理化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3.1凈油得率。

按照式（1）計(jì)算迷迭香凈油的得率。

得率（%）=m1/m2×100（1）

式中，m1為迷迭香凈油的質(zhì)量（g），m2為用于提取的迷迭香粉末的質(zhì)量（kg）。

1.2.3.2總酚含量。

采用Folin-Ciocalteu法建立用于總酚含量測(cè)定的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]，線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.024 8x-0.104 0。該方程式的相關(guān)系數(shù)為0.995，線性檢測(cè)范圍為0～50 μg/mL。分別取適量不同提取方法所得迷迭香凈油，用無水乙醇配制為2 mg/mL的溶液，用Folin-Ciocalteu法測(cè)定并根據(jù)回歸方程計(jì)算沒食子酸質(zhì)量濃度ρ（GAE），然后按照式（2）計(jì)算迷迭香凈油的總酚含量。

總酚含量（mg GAE /g）=（ρ× D）× V /（W×103）（2）

式中，D為測(cè)定樣品中沒食子酸質(zhì)量濃度的稀釋倍數(shù)，V為定容體積（mL），W為迷迭香凈油的質(zhì)量（g），ρ為沒食子酸當(dāng)量（μg GAE/mL）。

1.2.4組成成分檢測(cè)。

使用6890-5975 N型氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）檢測(cè)3種迷迭香凈油的主要化學(xué)成分。準(zhǔn)確量取3種迷迭香凈油樣品以及葵花籽油的乙醇萃取物各25 μL，用無水乙醇稀釋至1 mL，于GC-MS進(jìn)樣分析，并以葵花籽油的乙醇萃取物作為空白對(duì)照。

儀器條件：Agilent 6890-5975 N氣相色譜-質(zhì)譜儀，HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

色譜條件：載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度280 ℃；升溫程序?yàn)橹鶞?0 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：掃描范圍41～510 aum；電離電壓70 V；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；掃描方式為全掃描。

1.2.5主要活性單體檢測(cè)。

使用2695型高效液相色譜儀檢測(cè)迷迭香凈油中主要活性單體（鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸和熊果酸）的含量。

1.2.5.1

樣品前處理。準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.001 g）迷迭香凈油樣品和葵花籽油的乙醇萃取物至5 mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用于迷迭香酸和熊果酸的檢測(cè)；同時(shí)取上述溶液0.5 mL至25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用于鼠尾草酸和鼠尾草酚的檢測(cè)。

1.2.5.2儀器條件。Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.5%磷酸-水溶液；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量5 L；梯度洗脫：0～50 min，10% A；50～70 min，75% A；70～75 min，100% A；75～80 min，10% A。

1.2.6抗氧化活性測(cè)定。

以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，按照Zeng等[10]所述方法測(cè)定并計(jì)算Ab-cv、Ab-o和Ab-us對(duì)DPPH自由基（DPPH·）的清除率。

1.2.7貯藏期測(cè)定。

將3種不同工藝得到的迷迭香凈油放置于4 ℃冰箱中貯藏，分別測(cè)定其在貯藏1、3、6和12個(gè)月后的總酚含量，以此來監(jiān)測(cè)不同工藝對(duì)迷迭香凈油活性成分貯藏時(shí)間的影響。

2結(jié)果與分析

2.1迷迭香凈油感官評(píng)價(jià)

不同提取方式得到的迷迭香凈油在外觀上有不同的表現(xiàn)。如表1所示，Ab-us和Ab-o透明度好，Ab-cv的顏色黑且渾濁，這可能與溶劑的萃取性能有關(guān)，說明正己烷可將較多雜質(zhì)提取出來。Ab-us呈棕黃色，顏色比Ab-o深，說明迷迭香中的非極性色素在超聲波的輔助下被更充分地提取出來。Ab-cv香氣更濃烈，Ab-o香氣淡，這是因?yàn)榈蜏靥崛〔荒苁瓜銡獬煞趾芎玫厝艹觯谳o助超聲波后，迷迭香的特征香氣成分也得到較好地提取。綜合比較可知，Ab-cv和Ab-us感官質(zhì)量更佳。

2.2迷迭香凈油總酚含量分析

Ab-cv、Ab-o和Ab-us的得率及總酚含量如表2所示。Ab-o的得率和總酚含量均最低，得率比Ab-cv和Ab-us分別低41.6和315 g/kg，這說明單純使用葵花籽油作為溶劑，在室溫下提取效果欠佳。但Ab-us的得率和總酚含量高于Ab-cv和Ab-o，說明經(jīng)過超聲波處理后，總酚類物質(zhì)更容易被提取出來[11]。Ab-cv的總酚含量和得率與Ab-us差異不大，因此從得率和總酚含量上看，Ab-cv和Ab-us的品質(zhì)更好。

2.3迷迭香凈油組成成分分析

圖1為迷迭香凈油總離子流圖（TIC），由峰面積歸一化法得出各組分的相對(duì)含量，分別分離鑒定出26種（Ab-cv）、28種（Ab-o）和29種（Ab-us）化合物，主要是醇類、烯類、酯類、酮類及少數(shù)其他化學(xué)物質(zhì)。同時(shí)，葵花籽油的乙醇萃取物并沒有檢出上述物質(zhì)，說明葵花籽油作為溶劑在經(jīng)過乙醇萃取等后續(xù)工藝后不存在殘留，不會(huì)對(duì)迷迭香凈油的成分造成影響。

表3分析了迷迭香凈油的具體組成成分。3種迷迭香凈油均在8～20 min內(nèi)檢測(cè)到9種主要的致香成分，分別為百里香素、桉樹腦、檸檬烯、芳樟醇、松油烯-4-醇、樟腦、龍腦、α-萜品醇和石竹烯，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)論一致[12-14]。由圖1a和1b可知，Ab-o和Ab-us在保留時(shí)間30～40 min范圍內(nèi)檢出的成分主要是酯類、酮類和雜環(huán)類化合物，這說明葵花籽油作為提取溶劑能夠從迷迭香中得到更多更為復(fù)雜的成分（雜環(huán)類化合物），極大地豐富了迷迭香凈油的化學(xué)組成。Ab-cv和Ab-us在39 min時(shí)均檢出角鯊烯，含量分別為0.78%和0.36%，說明迷迭香中含有少量角鯊烯。Ab-cv、Ab-o和Ab-us在43 min處均檢出VE。在輔以超聲波后，VE在葵花籽油中的溶出表現(xiàn)出一定程度的增加。此外，Ab-o在45～48 min有3個(gè)明顯的峰，分別是菜油甾醇（1.42%）、豆甾醇（2.37%）和谷甾醇（13.05%）。綜上所述，超聲油提法能盡可能多地溶出迷迭香中的揮發(fā)性成分，豐富迷迭香凈油的組成。

2.4迷迭香凈油抗氧化單體含量分析

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)迷迭香凈油和葵花籽油乙醇萃取物，其主要活性單體的含量如圖2所示。葵花籽油乙醇萃取物中沒有檢測(cè)到目標(biāo)物質(zhì)，說明油提法和超生油提法使用葵花籽油作為溶劑不會(huì)對(duì)迷迭香凈油的主要抗氧化單體造成影響。在所有迷迭香樣品中，鼠尾草酸的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余2種檢出物質(zhì)。而Ab-cv的鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸的含量均低于Ab-o和Ab-us，雖然回流提取法在提取時(shí)的溫度比油提法高很多，但是溫度的升高并沒有增加活性成分的含量，甚至可能導(dǎo)致一部分活性成分分解為其他化學(xué)物質(zhì)（鼠尾草酸轉(zhuǎn)變?yōu)槭笪膊莘樱?。這說明溫度并不是影響這3種活性單體含量的唯一因素[15]，溶解性的影響則更明顯。鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸在葵花籽油中的溶解性比在正己烷中好。這3種單體在Ab-us中的含量均高于Ab-o和Ab-cv，說明超聲波的加入能夠大大提高鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸在迷迭香凈油中的含量。此外，迷迭香酸是水溶性酸，在Ab-cv和Ab-o中均未檢出迷迭香酸，僅在Ab-us中檢出0.18 mg/g，說明像超聲波這樣對(duì)植物細(xì)胞有強(qiáng)大破壞作用的提取方式能夠促進(jìn)一些水溶性成分的溶出。

2.5迷迭香凈油抗氧化活性分析

BHT、迷迭香凈油和葵花籽油乙醇萃取物在不同濃度下對(duì)DPPH·的清除作用如圖3所示?？梢钥闯觯珺HT、Ab-cv、Ab-o和Ab-us在0～120 μg/mL濃度范圍內(nèi)，均對(duì)DPPH·有顯著的清除作用，并且該作用與樣品濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。但是葵花籽油乙醇萃取物對(duì)DPPH·的清除作用表現(xiàn)得不明顯，說明葵花籽油作為溶劑在經(jīng)過乙醇萃取等后續(xù)工藝后不存在殘留，且對(duì)迷迭香凈油的抗氧化性沒有影響。在該試驗(yàn)中，BHT在較低濃度下便對(duì)DPPH·表現(xiàn)出明顯的清除作用。但隨著樣品濃度的增加，BHT與迷迭香凈油之間的差異也越來越小。當(dāng)濃度為120 μg/mL時(shí)，BHT、Ab-cv、Ab-o和Ab-us對(duì)DPPH·的清除率分別為（89.56±0.358）%、（79.92±0502）%、（75.78±0.633）%和（88.81±1.022）%，所有樣品的IC50分別為33.24 μg/mL（BHT）、72.36 μg/mL（Ab-cv）、84.77 μg/mL（Ab-o）和70.07 μg/mL（Ab-us）。在濃度超過120 μg/mL后Ab-us對(duì)DPPH·的清除率與BHT相差無幾。雖然BHT在濃度不高時(shí)對(duì)DPPH·的清除作用比迷迭香凈油強(qiáng)，但事實(shí)上BHT對(duì)人體安全存在一定隱患，當(dāng)劑量達(dá)到一定程度后具有溶血和致癌的作用[16]。而迷迭香凈油具有天然、安全、抗氧化活性強(qiáng)的特點(diǎn)，尤其是Ab-us是具有開發(fā)潛力的食品抗氧化劑。

2.6迷迭香凈油貯藏期分析

Ab-cv、Ab-o和Ab-us的總酚含量隨貯藏時(shí)間的變化如圖4所示。由圖4可知，Ab-us在12個(gè)月的貯藏過程中，總酚含量均高于Ab-cv和Ab-o。在貯藏1個(gè)月后，Ab-o中的總酚含量下降了1508%，Ab-cv和Ab-us的下降幅度分別為6.11%和093%。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，Ab-cv中的總酚含量呈明顯快速的下降趨勢(shì)，幅度大于Ab-o和Ab-us，而Ab-us的總酚含量的降幅低于Ab-cv和Ab-o，說明Ab-us在貯藏條件下更穩(wěn)定。

3結(jié)論

回流提取法和超聲油提法制備的迷迭香凈油在感官和得率等指標(biāo)上相近，所得迷迭香凈油品質(zhì)更佳。

迷迭香凈油中含有多種芳香成分和VE，隨著提取方法不同，含量也不同。超聲油提法能豐富迷迭香凈油的組成成分，提高VE含量。同時(shí)，也能提高抗氧化單體的含量，表現(xiàn)出更好的體外抗氧化活性。而單純使用葵花籽油進(jìn)行提取，并不能得到品質(zhì)良好的迷迭香凈油，不論是得率、組成成分還是抗氧化活性都不及回流提取法和超聲油提法。因此，若從環(huán)保角度出發(fā)，使用食用油作為提取溶劑則必須外加輔助手段。

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