氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙血液中部分生理生化指標(biāo)的影響

黃艷 黎慧 李斌 劉盼 邵晨 王宇

摘要 [目的]探明氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）的毒性效應(yīng)。[方法]采用96 h靜態(tài)毒性試驗(yàn)法研究了不同濃度和不同暴露時(shí)間的氨氮對(duì)虎紋蛙血糖（Glu）、高鐵血紅蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）的影響。[結(jié)果]隨暴露時(shí)間的增加，Glu濃度出現(xiàn)顯著的先升后降，并在72 h后達(dá)到最大值；MetHb含量和BUN濃度則隨氨氮濃度的增加或者暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；而BA則只在48～72 h的不同暴露時(shí)間下具有較大的變化。[結(jié)論]為降低氨氮對(duì)人工養(yǎng)殖虎紋蛙的影響，需要將養(yǎng)殖水體的氨氮濃度控制在59.46 mg/L以下。

關(guān)鍵詞 虎紋蛙；氨氮脅迫；血液生理生化指標(biāo)

中圖分類號(hào) S947.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）01-0087-04

Abstract [Objective] In order to understand the toxic effects of ammonia-N stress on blood physiological-biochemical indices of Hoplobatrachus chinensis .[Method] 96 h static toxicity tests in different concentrations and exposure time were used to evaluate the effects of ammonia-N on the concentration of blood glucose （Glu）， methemoglobin （MetHb）， blood urea nitrogen （BUN） and blood ammonia （BA）. [Result] With the exposure time increase， Glu concentration increased first and then decreased and it reached the maximum value at 72 h treatment；MetHb and BUN showed significant positive correlation with ammonia-N concentration or exposure time under the circumstance of the same exposure time or concentrations. Blood ammonia concentration changed significantly with exposing for 48-72 h. [Conclusion] It would be better to control the ammonia-N concentration under the safety level （59.46 mg/L） to reduce the effect of ammonia-N on breeding H.chinensis .

Key words Hoplobatrachus chinensis ；Ammonia-N stress；Blood biochemical indices

氨氮是養(yǎng)殖水體中最常見的污染物之一。在養(yǎng)殖過(guò)程中因投餌過(guò)多、養(yǎng)殖密度過(guò)大以及濫用殺菌劑和消毒劑等因素都會(huì)使水體中有機(jī)物含量增多，造成養(yǎng)殖水體氨氮的不斷累積，進(jìn)而對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用[1-2]。已有研究顯示，氨氮脅迫將導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的鰓、腎和肝臟等器官發(fā)生病變[3-4]，包括引起鰓部潰爛，鰓小片顯著增厚，腎小管退化，腎小囊出現(xiàn)膨脹、囊腔充血和阻塞以及肝臟組織充血、退化、壞死等癥狀[5-7]。此外，動(dòng)物機(jī)體的呼吸系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)也會(huì)受到氨氮的影響，引起免疫力下降，并導(dǎo)致動(dòng)物體病原菌易感性增強(qiáng)，最終影響其生長(zhǎng)和存活[1，8-12]。然而，上述關(guān)于氨氮脅迫對(duì)水生動(dòng)物毒性的研究目前主要集中在魚類和甲殼動(dòng)物，對(duì)兩棲動(dòng)物的毒性效應(yīng)研究尚未見報(bào)道。兩棲動(dòng)物是脊椎動(dòng)物從水生過(guò)渡到陸生的重要類群，其生命活動(dòng)的各個(gè)階段均離不開水環(huán)境。因此，以氨氮為代表的養(yǎng)殖水體污染可能是制約兩棲動(dòng)物健康養(yǎng)殖的潛在重要因素。

虎紋蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）是我國(guó)Ⅱ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，由于棲息地破壞及人類濫捕等因素導(dǎo)致其野生種群數(shù)量急劇下降。為滿足人類的消費(fèi)需求，目前虎紋蛙已在海南、廣東、浙江等地開展了產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。該研究擬以虎紋蛙為研究對(duì)象，采用96 h靜態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)法，通過(guò)研究不同濃度和不同暴露時(shí)間氨氮對(duì)虎紋蛙血糖（Glu）、高鐵血紅蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）含量變化的影響，以期為探討虎紋蛙的人工健康養(yǎng)殖和氨氮對(duì)兩棲動(dòng)物的毒害機(jī)制提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用虎紋蛙種群來(lái)自浙江省金華市某虎紋蛙養(yǎng)殖場(chǎng)。試驗(yàn)前將體質(zhì)健康、規(guī)格相近[體重（181.17±1.36） g，體長(zhǎng)（12.58±0.12） cm]的虎紋蛙成體置于水族箱（90 cm×40 cm×40 cm）中馴養(yǎng)7 d，控制水溫為（22±1）℃，pH為7.0±0.1，溶氧量為（8.7±0.1）mg/L。每24 h用曝氣脫氯的自來(lái)水換水1次，并定時(shí)投喂虎紋蛙專用飼料（漳州市聯(lián)泰飼料有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 半致死濃度試驗(yàn)。

在預(yù)試驗(yàn)確定虎紋蛙24 h全部死亡和96 h全部存活的氨氮濃度后，在該濃度范圍內(nèi)按照等對(duì)數(shù)梯度設(shè)計(jì)7個(gè)氨氮濃度組：220.00、293.37、391.22、521.70、695.70、927.73和1 237.15 mg/L，每個(gè)氨氮濃度設(shè)置2個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（0 mg/L）。氨氮溶液使用分析純NH4Cl配制，并采用納氏試劑法測(cè)定溶液的實(shí)際氨氮濃度，每24 h更換新配制的試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)中觀察記錄不同濃度組在不同時(shí)間（24、48、72 和96 h）各個(gè)體的活動(dòng)狀況、中毒癥狀和死亡個(gè)體數(shù)量，并及時(shí)去除死亡個(gè)體。

1.2.2 暴露試驗(yàn)。

根據(jù)上述半致死濃度試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置4個(gè)氨氮濃度組：0、120、360和600 mg/L，其中0 mg/L為對(duì)照組，其他濃度為處理組，每組2個(gè)平行（30只/每平行），試驗(yàn)持續(xù)96 h。

1.3 血液樣品制備與檢測(cè)

暴露試驗(yàn)期間，分別于0、24、48、72和96 h在每個(gè)濃度組中隨機(jī)采集6只虎紋蛙樣本于冰上毀髓斷頭取血。將血液置于含有EDTA抗凝劑的2 mL無(wú)菌離心管中，4 ℃靜置12 h，3 500 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。Glu、MetHb、BUN和BA的含量均使用南京建成生物工程研究所的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法和步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以氨氮濃度和暴露時(shí)間作為自變量進(jìn)行雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），若二因素間無(wú)顯著交互作用，則進(jìn)行二因素的主效應(yīng)分析；若二因素間有顯著交互作用，則固定其中1個(gè)因素的水平，對(duì)另一個(gè)因素進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。用LSD多重比較法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平取 α =0.05。氨氮對(duì)虎紋蛙的96 h半致死濃度采用直線內(nèi)插法計(jì)算，以“96 h半致死濃度×0.1”作為其安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對(duì)虎紋蛙的半致死濃度

半致死濃度（LC50）是受試生物對(duì)毒性物質(zhì)的敏感性指標(biāo)，其值越小，生物體對(duì)毒物越敏感，毒物對(duì)生物的毒性也越強(qiáng)[13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，虎紋蛙從自然水體轉(zhuǎn)入不同濃度的氨氮水體均表現(xiàn)出不同程度的中毒癥狀，其死亡率隨著氨氮濃度的增加或暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增，其累積死亡率見圖1。氨氮對(duì)虎紋蛙的96 h半致死濃度和安全濃度分別為594.62和59.46 mg/L。

2.2 氨氮對(duì)虎紋蛙血液中部分生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙Glu的影響。

氨氮濃度和暴露時(shí)間雙因素對(duì)虎紋蛙Glu的影響無(wú)顯著交互作用（ P >0.05），氨氮濃度對(duì)Glu無(wú)顯著影響（ P >0.05）（表1）。主效應(yīng)分析結(jié)果顯示，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，Glu先升后降。當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，Glu顯著高于其他暴露時(shí)間（圖2）。

2.2.2 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙MetHb的影響。

氨氮濃度和暴露時(shí)間雙因素對(duì)虎紋蛙MetHb的影響有顯著交互作用（ P <0.05），氨氮濃度和暴露時(shí)間均對(duì)MetHb有顯著影響（ P <0.05）（表1）。控制其中一個(gè)因素后所進(jìn)行的單因素方差分析結(jié)果顯示：在相同氨氮濃度下，MetHb隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加；而相同時(shí)間內(nèi)，MetHb隨著氨氮濃度的升高而顯著增加（圖3）。

2.2.3 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙BUN的影響。

氨氮濃度和暴露時(shí)間雙因素對(duì)虎紋蛙BUN的影響有顯著交互作用（ P <0.05），氨氮濃度和暴露時(shí)間均對(duì)BUN有顯著影響（ P <0.05）（表1）。單因素方差分析結(jié)果顯示，在同一氨氮濃度下，BUN隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加，96 h時(shí)增加顯著；而在同一暴露時(shí)間下，隨著氨氮濃度的增加，BUN在24 h時(shí)并未升高，而在48、72和96 h時(shí)則顯著升高（圖4）。

2.2.4 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙BA的影響。

氨氮濃度和暴露時(shí)間雙因素對(duì)虎紋蛙BA的影響無(wú)顯著交互作用（ P >0.05）（表1）。結(jié)果分析顯示，BA在不同氨氮濃度下，暴露組均顯著高于對(duì)照組，但暴露組之間無(wú)顯著性差異（圖5）；在不同暴露時(shí)間下，BA 96和72 h均顯著高于24和48 h，但96和72 h之間、24和48 h之間均無(wú)顯著差異（圖6）。

3 結(jié)論與討論

氨氮在水體中主要以離子氨（NH+4）、分子氨（NH3）和銨鹽等形式存在，是普遍存在于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的有害物質(zhì)。不同水生動(dòng)物對(duì)氨氮毒性的敏感性存在較大差異，具有不同的耐受性[14-16]。研究表明虎紋蛙對(duì)氨氮的96 h半致死濃度和安全濃度均遠(yuǎn)高于虹鱒魚（ Oncorhynchus mykiss ）[14]、史氏鱘（ Acipenser schrencki ）[15]和克氏原螯蝦（ Procambarus clarkii ）[16]等魚類和甲殼動(dòng)物，這可能與動(dòng)物體自身的生理結(jié)構(gòu)和生活習(xí)性有關(guān)?；⒓y蛙屬于兩棲類，其生命活動(dòng)雖然不能完全脫離水生環(huán)境，但其成體的主要呼吸器官肺對(duì)水體的依賴性要遠(yuǎn)小于魚類和甲殼類的水體呼吸器管鰓，因此完全生活于水中的魚類和甲殼類動(dòng)物的氨氮脅迫半致死濃度要遠(yuǎn)大于半水棲的兩棲動(dòng)物。

3.1 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙Glu的影響

動(dòng)物的血液生理生化因子在正常情況下一般處于穩(wěn)定狀態(tài)，但在外界環(huán)境因素的脅迫下，其動(dòng)態(tài)平衡可能會(huì)遭到破壞，并進(jìn)而導(dǎo)致正常生理功能的失衡。Glu作為動(dòng)物體血液中的重要生化因子之一，其濃度的變化反映環(huán)境脅迫，如高密度放養(yǎng)、捕捉、裝載及運(yùn)輸?shù)鹊闹匾笜?biāo)[17-19]。該研究中虎紋蛙的Glu在氨氮脅迫下隨暴露時(shí)間逐漸增加，并在72 h后達(dá)到最大值，隨后又在96 h后恢復(fù)脅迫前水平。說(shuō)明在氨氮脅迫初期，虎紋蛙應(yīng)對(duì)自身的能量分流和代謝調(diào)整產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激效應(yīng)，引起動(dòng)物體額外的能量需求，糖異生作用加強(qiáng)，從而導(dǎo)致Glu升高[20]。而隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，蛙體的應(yīng)激效應(yīng)通過(guò)自身調(diào)節(jié)得到緩解，Glu恢復(fù)正常水平。該結(jié)果與氨氮急性脅迫對(duì)青魚（ Mylopharyngodon piceus ）Glu影響的研究結(jié)果一致[21]，說(shuō)明氨氮脅迫能夠?qū)lu產(chǎn)生顯著影響。此外，該結(jié)果也說(shuō)明Glu在動(dòng)物體內(nèi)的變化具有時(shí)效性，僅能作為動(dòng)物急性反應(yīng)的重要指標(biāo)。

3.2 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙MetHb的影響

MetHb是由血液中的血紅蛋白經(jīng)氧化轉(zhuǎn)變而來(lái)。正常情況下，動(dòng)物體內(nèi)的MetHb含量極少，并處于不斷的生成與分解的動(dòng)態(tài)平衡中。該研究虎紋蛙MetHb在氨氮脅迫下隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)或濃度的增加而顯著上升。表明在氨氮脅迫下，水體中的分子氨（NH3）因具有較高的脂溶性而極易穿透虎紋蛙的細(xì)胞膜進(jìn)入體內(nèi)，將血液中大量的血紅蛋白氧化為MetHb，降低血液的載氧能力[22]。觀察試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，虎紋蛙的游泳和跳躍能力隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)或濃度的增大出現(xiàn)明顯減弱的現(xiàn)象，這與對(duì)鯰魚運(yùn)動(dòng)能力[23]的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明氨氮脅迫可顯著增加MetHb在動(dòng)物體內(nèi)的含量，降低其體內(nèi)的含氧量，進(jìn)而影響水生動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)，引發(fā)一系列的生理反應(yīng)，最終導(dǎo)致虎紋蛙的窒息和死亡。

3.3 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙BUN的影響

BUN是動(dòng)物體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，可通過(guò)腎臟的過(guò)濾和重吸收作用而排出體外。然而，當(dāng)腎臟發(fā)生病變時(shí)，腎小球的濾過(guò)率快速下降，BUN將不能通過(guò)腎臟隨尿液排出體外，導(dǎo)致血液中BUN的含量升高，引起代謝絮亂[24]。因此，動(dòng)物體血液中BUN的含量可用于反映腎臟的健康狀況。該研究中虎紋蛙BUN在氨氮脅迫下具有明顯的時(shí)間和劑量雙效應(yīng)，并與暴露時(shí)間的延長(zhǎng)或濃度的升高呈正相關(guān)，結(jié)合相關(guān)研究推測(cè)氨氮脅迫可能對(duì)虎紋蛙的腎臟組織產(chǎn)生不同程度的損傷，如腎小管和動(dòng)脈球的退化以及腎小囊的膨脹、阻塞、充血和出血等[6-7]。

3.4 氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙BA的影響

BA是動(dòng)物體內(nèi)各種氨基酸經(jīng)分解代謝產(chǎn)生的氨和腸管吸收的氨進(jìn)入血液所形成的，通常會(huì)維持一個(gè)相對(duì)較低的含量。然而，在外源性氨源或肝臟發(fā)生病變等情況下，動(dòng)物體內(nèi)的BA含量會(huì)顯著上升。該研究虎紋蛙BA在氨氮脅迫下顯著增加，但不同濃度的氨氮對(duì)虎紋蛙BA的影響并無(wú)顯著差異；不同暴露時(shí)間對(duì)虎紋蛙BA變化的影響除48～72 h明顯外，其他時(shí)間均不顯著。該研究結(jié)果與氨氮脅迫對(duì)魚類BA的影響不同，并沒有出現(xiàn)BA隨著氨氮濃度增高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而呈顯著正相關(guān)[25]。推測(cè)這可能是虎紋蛙BA在外界氨氮刺激下達(dá)到一定閾值后，機(jī)體啟動(dòng)自身調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)減少外源性氨氮的進(jìn)入、增加體內(nèi)氨氮的排泄以及生成谷氨酰胺和BUN等無(wú)毒物質(zhì)，并將其貯存在各組織中，使機(jī)體內(nèi)BA的積累量不再增加[26-28]，從而將BA穩(wěn)定在一定的水平。

動(dòng)物的血液生理生化指標(biāo)可反映出該個(gè)體的健康狀態(tài)，該研究顯示氨氮脅迫對(duì)虎紋蛙血液中的Glu、MetHb、BUN和BA都具有一定影響。因此，控制虎紋蛙養(yǎng)殖水體中的氨氮濃度在安全范圍（< 59.46 mg/L）內(nèi)將有助于該物種的健康安全養(yǎng)殖。

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