細菌產(chǎn)生的纖維素酶(綜述)(續(xù)2)

嚴鴻林

摘? 要：本期主要介紹纖維素酶在細菌體系中的作用方式、細菌共培養(yǎng)以及纖維素酶基因在異源宿主中的克隆與表達。

關(guān)鍵詞：纖維素酶;共培養(yǎng);克隆;細菌

中圖分類號：S851.6 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）12-0018-03

6? 纖維素酶在細菌體系中的作用方式

研究人員關(guān)注對纖維素特異性黏附有重要作用的四種結(jié)構(gòu)：（1）被稱為纖維小體的大型多組分復合物;（2）菌毛或菌毛黏連;（3）細菌糖萼層表面的碳水化合物;（4）酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

6.1 通過類纖維體復合物的黏附

纖維小體是大的、穩(wěn)定的多酶復合物，特異性地黏附和降解位于細胞表面上可見突起的纖維素。多纖維素酶復合物由包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多附著位點（稱為黏附素）的中央非催化亞基（稱為支架蛋白）組成，附著位點用于結(jié)合酶促遞送。酶促提交物包含催化結(jié)構(gòu)域和對接結(jié)構(gòu)域[稱為碼頭蛋白（dockerin）]，后者與支架蛋白上的內(nèi)聚相互作用。研究最徹底和最好的纖維小體是嗜熱細菌熱纖維梭菌。

6.2 通過纖毛黏附

纖毛參與表面附屬物的細菌黏附。革蘭氏陰性菌中纖毛的寬度為5 nm～7 nm，長度為100 nm～200 nm。隨著對纖毛在細菌黏附作用中了解的加深，我們清楚地認識到纖毛的結(jié)構(gòu)亞單位負責細菌黏附。革蘭氏陽性菌黏放線菌和血鏈球菌中纖毛的一些亞基單位已經(jīng)被鑒定。大腸桿菌具有三種類型的纖毛，其碳水化合結(jié)合位點均在纖毛小的（28 kDa～? 35 kDa）重復亞基中，并且大部分位于纖維的唇部，剩余的重復亞基位于纖毛其他位置。在白色瘤胃球菌中，一種新型的纖維素結(jié)合蛋白（cbpC，17.7 kDa）已經(jīng)被認為屬于丸蛋白，并且最類似于革蘭氏陰性致病菌的4型菌毛蛋白。

6.3 通過細菌糖萼的碳水化合物表面黏附

電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)了大部分有關(guān)通過碳水化合物表位黏附的證據(jù)。許多研究表明，圍繞白色瘤胃球菌和瘤胃黃瘤菌的黏液層由糖蛋白（碳水化合物殘基）組成，參與細菌的黏附。如果用蛋白酶和葡聚糖酶處理通過高碘酸鹽氧化去除糖萼碳水化合物，那么白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌對纖維素的黏附會顯著降低。更多的碳水化合物黏附作用的直接證據(jù)在纖維桿菌中已給出。

6.4 通過纖維素分解酶的纖維素結(jié)合域黏附

已經(jīng)揭示了在纖維素酶結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的兩個功能域，即負責水解切割糖苷鍵的活性催化結(jié)構(gòu)域和將細菌酶結(jié)合到其底物上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在許多情況下，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過富含羥基氨基酸的接頭與催化核心連接，并且大多數(shù)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有四個保守的色氨酸和兩個另外的半胱氨酸殘基。由于保守的芳香族殘基，人們認為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過氫鍵或疏水相互作用連接到纖維素上。已經(jīng)有研究表明，缺乏這些結(jié)構(gòu)域的細菌黏附性較差，在某些情況下，其消化晶體纖維素的能力較差。人們已經(jīng)在產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌中鑒定了不同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括內(nèi)切葡聚糖酶2和EGF。Karita等克隆了來自白色瘤胃球菌F-40的基因egVI，發(fā)現(xiàn)該酶含有不同的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

7? 共培養(yǎng)

細菌共培養(yǎng)用于改善纖維素的水解和提高產(chǎn)物利用率以獲得更值得需要的發(fā)酵產(chǎn)物。熱纖梭菌有其優(yōu)勢與能夠?qū)⑽焯前l(fā)酵成乙醇的生物進行共培養(yǎng)，因為熱纖梭菌只能發(fā)酵己糖。因此，熱纖梭菌已經(jīng)與其他厭氧嗜熱梭狀芽孢桿菌、熱硫化氫梭菌和布氏熱厭氧桿菌培養(yǎng)。這些生物體具有與厭氧嗜熱梭狀芽孢桿菌共生的能力，可用于纖維素和半纖維素的水解，最終轉(zhuǎn)化成乙醇（圖2）。共培養(yǎng)的優(yōu)點是增加產(chǎn)量，但挑戰(zhàn)是副產(chǎn)物（如乙酸和乳酸）的產(chǎn)生，通過影響細胞的生長速率來降低乙醇產(chǎn)量。開發(fā)細菌共培養(yǎng)是一項艱巨的任務。培養(yǎng)基和生長條件，如溫度/空氣和碳源必須是同步的，因為保證每個菌株的均勻生長是建立共同培養(yǎng)所必需的。穩(wěn)定的共同培養(yǎng)也可以通過更特定地控制代謝相互作用（即相互關(guān)系或相互作用）和其他相互作用（即生長促進或生長抑制如抗生素）來實現(xiàn)。

細菌共培養(yǎng)的替代途徑是基因工程菌的開發(fā)，這種菌能夠從頭到尾完成纖維到乙醇的轉(zhuǎn)化。這意味著，代謝工程改造的熱纖梭菌可以發(fā)酵戊糖和己糖，但是，由于梭菌對遺傳操作的頑固性，對梭狀芽孢桿菌的分子改造將是一項艱巨的任務。因此，共培養(yǎng)具有優(yōu)勢，因為它可以減少由單個細菌群體產(chǎn)生的外源性產(chǎn)物的量，從而減少宿主細胞代謝失衡的機會。此外，分工將優(yōu)化每個反應路徑。盡管細菌共培養(yǎng)是生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的一個常見的概念，但尚處于不成熟的階段，并且具有很大的潛力。

8? 纖維素酶基因在異源宿主中的克隆與表達

Pasternak和Glick已經(jīng)綜述了纖維素酶基因在細菌宿主中的克隆和表達。Forsberg等綜述了細菌纖維素酶的特性和克隆，特別是來源于瘤胃厭氧菌產(chǎn)琥珀酸擬桿菌。其中最重要的是：（1）由于原核與真核生物翻譯機制的差異，從真核宿主中克隆纖維素酶基因不能直接在原核細胞中表達;（2）由于與原核生物相比真核基因組更大，來自真核細胞的基因組克隆庫需要用長度為20 kb～40 kb的DNA來構(gòu)建。像pBR322這樣的載體插入片段大于10 kb～15 kb的DNA不能很好地復制和得到令人滿意的結(jié)果。重組纖維分解策略將非纖維素分解微生物改造成可分解纖維微生物涉及功能性纖維素酶系統(tǒng)的異源表達。這種異源表達已在各種微生物中構(gòu)建來實現(xiàn)多種用途。

8.1 異源纖維素酶在細菌中的表達

8.1.1 運動發(fā)酵單胞菌

一些纖維素酶編碼基因已經(jīng)在運動發(fā)酵單胞菌中克隆和表達，并取得了不同程度的成功。通過可移動的質(zhì)粒載體將來自熒光假單胞菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因（eglX）引入運動發(fā)酵單胞菌。然而，該重組菌株在整個生長期在細胞內(nèi)異源內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)生與培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度無關(guān)。類似地，將枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶導入運動發(fā)酵單胞菌中該酶表達量低，并且在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液中也沒有檢測到活性。

與上述熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌基因相反，菊歐文氏菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因（celZ）可在運動發(fā)酵單胞菌中有效表達。運動發(fā)酵單胞菌所產(chǎn)酶的活性與菊歐文氏菌的親本菌株相當。據(jù)報道，內(nèi)切葡聚糖酶基因的生物合成發(fā)生于運動發(fā)酵單胞菌的指數(shù)生長期期間，約35%的酶釋放到培養(yǎng)基中而不參與細胞裂解。另一個纖維素酶基因已被成功克隆，并在運動發(fā)酵單胞桿菌中表達。來自木質(zhì)醋酸菌的CMCase基因在運動發(fā)酵單胞菌中有效表達，并且在周質(zhì)間隙中檢測到約75%的酶活性。

8.1.2 腸原桿菌

由celY和celZ編碼的兩種菊花內(nèi)切葡聚糖酶和木質(zhì)醋酸菌的纖維素酶基因已經(jīng)在大腸桿菌以及相關(guān)腸桿菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌中有表達。由于啟動子構(gòu)建，celY最初在大腸桿菌中的表達很差。然而，通過使用來自運動發(fā)酵單胞菌的替代啟動子，大腸桿菌中celZ的表達增加了6倍。

9? 纖維素酶生物技術(shù)：未來

使用木質(zhì)纖維素材料或其他化學原料生產(chǎn)乙醇是生物技術(shù)史上遇到的最困難的任務之一。通過對培養(yǎng)物中的酶進行定量、純化、鑒定和應用來研究微生物纖維素的利用，這同時也是微生物生物技術(shù)的重要方面之一。纖維素水解的定量描述包括纖維素酶的吸附、酶水解速率、微生物纖維素利用的生物能量學以及與可溶性底物動力學對比的特征。從生物學角度來看，纖維素生物質(zhì)的處理具有預處理底物和替代工藝配置的特點。生物體發(fā)育被認為是“整合生物加工”，其中纖維素分解酶的生產(chǎn)、生物質(zhì)的水解和糖發(fā)酵成所需產(chǎn)物在一步發(fā)生。我們對兩種生物開發(fā)策略的“整合生物加工”進行了審查：（1）可改善能夠利用纖維素的微生物的產(chǎn)物產(chǎn)量和耐受性;（2）實現(xiàn)纖維利用分解菌的高產(chǎn)和耐受性酶體系的異源表達。

10? 結(jié)論

微生物轉(zhuǎn)化纖維素生物質(zhì)是開發(fā)新型生物工藝和產(chǎn)品潛在的可持續(xù)方法。目前，微生物纖維素酶正在全球多個行業(yè)進行商業(yè)化生產(chǎn)，并在食品、動物飼料、燃料、造紙業(yè)、紡織業(yè)以及各種化學工業(yè)中得到廣泛應用。纖維素酶研究主要集中于真菌，但由于細菌具有較高的生長速率、熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性，因此人們對用細菌產(chǎn)生纖維素酶的興趣也在增加。在不適宜環(huán)境中篩選來自微生物的纖維素酶的快速和可靠方法的發(fā)展將允許更多數(shù)量的新型細菌纖維素酶被分離出來用于工業(yè)用途。我們目前對這些酶和生產(chǎn)菌的生產(chǎn)、純化、鑒定、生物化學、分子生物學的認識是可觀的。然而，通過合理的設計，可以利用現(xiàn)有的酶結(jié)構(gòu)和功能知識來進一步設計這些新型酶?；蛘撸梢酝ㄟ^隨機誘變技術(shù)對其改進，重點是要通過定向進化選擇理想的性狀加以增強。此外，通過蛋白質(zhì)工程改善細菌纖維素酶活性或賦予所需的酶特征可能是纖維素酶研究的另一個領域。盡管迄今為止我們?nèi)〉昧思毦w維素酶的一些研究進展，但對纖維素酶和細菌還需要付出更多的努力才能產(chǎn)生重要的工業(yè)影響。

（續(xù)完）