常用藥材中去甲烏藥堿的LC—MS/MS測定方法研究

楊明 何思睿 張丹 孫波 王雅一

摘要：該文建立常用藥材中去甲烏藥堿的LC-MS/Ms測定方法。采用Hypersil Gold-C18柱（100mmx2.1mm，3μm）為色譜柱，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.3mL/min；質(zhì)譜采用電噴霧電離（ESI+）模式離子化，選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM）掃描。結(jié)果表明：去甲烏藥堿在3.05～122ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（y=1 530.85x-153.164，r=0.9993）；檢測限和定量限分別為0.6，3ng/mL；重復(fù)性精密度和中間精密度分別為4.08%和4.73%；平均加樣回收率為86.98%；22種常用中藥材中僅有4種藥材檢測出去甲烏藥堿，含量（μg/g）分別為細(xì)辛（8.66）>黃柏（8.216）>花椒（5.010）>地膚子（4.66）。所建分析方法可快速、靈敏、準(zhǔn)確地定量中藥材中去甲烏藥堿，并提示部分中藥材和食材中存在去甲烏藥堿，運(yùn)動員應(yīng)慎用。

關(guān)鍵詞：去甲烏藥堿；Lc-MS/MS；中藥材；興奮劑

0引言

去甲烏藥堿（higenamine，HG）屬于芐基異喹啉類生物堿，是存在于烏頭、附子、蓮子心等中藥材中的強(qiáng)心活性成分。HG能夠刺激B受體，通過減少血小板黏附、抑制iNOS和上調(diào)HO-1的表達(dá)，對心血管產(chǎn)生正力、正時性作用，增加心輸出量和心率，降血壓；因此，臨床上常被用作強(qiáng)心藥。由于近年在運(yùn)動場上偶有HG陽性發(fā)現(xiàn)，為確保運(yùn)動員健康，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（world anti-doping agency，WADA）在《2017年禁用清單國際標(biāo)準(zhǔn)》中將HG明確列為β₂：激動劑類禁用物質(zhì)。然而，HG廣泛分布于植物甚至是一些食材中，如減肥產(chǎn)品、能量飲料或運(yùn)動機(jī)能的產(chǎn)品添加劑中常發(fā)現(xiàn)有HG的存在嗍，成為運(yùn)動員誤服HG的潛在風(fēng)險。因此，必須提前避免運(yùn)動員食用含HG的植物藥材或食材。

關(guān)于HG的檢測文獻(xiàn)較少.常用的檢測方法有HPLC-UV、法、HPLC-FLD法、HPLC-MS法等。其中常規(guī)的HPLC-UV法靈敏度偏低；柱前衍生熒光法，改善了靈敏度，但增加誤差步驟：而采用LC-MS法具有靈敏度高、步驟少、選擇性高等特點(diǎn)，目前已有用于體內(nèi)HG的檢測。為此，本文擬采用LC-MS/Ms聯(lián)用技術(shù)，在選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式下，首次對常用中藥材和食材中的HG進(jìn)行定性和定量檢測。研究運(yùn)動員常用藥材或食材中HG的分布規(guī)律，篩選出適合運(yùn)動員使用的藥材和食材，補(bǔ)充反興奮劑領(lǐng)域的研究缺陷。

1實驗部分

1.1儀器

Ultimate3000 UHPLC高效液相色譜儀（Dionex）-TSQ Quantum Ultra電噴霧三重四級桿質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）；Thcrlno Scientific Hypersil GoldC18色譜柱（100mmx2.1 mm，3μm）；XS205電子分析天平（Mettler Tdedo公司，感量0.01 mg）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5430離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；200 μL、1000μL移液槍（德國Eppendoff公司）；超純水制備儀（美國Milli-Q公司）。

1.2試劑與試藥

去甲烏藥堿對照品（98.4%，LC-MS專用，美國Cato Research Chemicals公司）；藥材黃柏、花椒、細(xì)辛、地膚子、續(xù)斷、延胡索、紅花、血蝎、赤芍、芙蓉葉、木香、丁香、肉桂、川芎、獨(dú)活、當(dāng)歸、羌活、大黃、川木香、沒藥、大血藤、白芷共22味藥材，購于中藥市場；甲酸（98%，LC-MS專用，百靈威科技有效公司）；甲醇（HPLC grade，F(xiàn)isher Scientific）。

1.3對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取去甲烏藥堿對照品適量于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，于4℃下冷藏備用。

1.4供試品溶液的制備

本文以去甲烏藥堿含量較高的細(xì)辛藥材為目標(biāo)，設(shè)計了甲醇濃度、提取時間、浸泡時間、藥材粒度等對提取率的考察，最終確定藥材的提取條件為：藥材粉末（40目）約1.0g，精密稱定，于錐形瓶中加入75%甲醇50mL，浸泡1h并超聲提取0.5 h，離心15min（5000r/min），取上清液1mL于10mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，搖勻，取溶液適量用0.22μm的微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液用于LC-MS/MS進(jìn)樣。

1.5儀器條件

1）色譜柱：Thermo Hypersil Gold（100mmx2.1mm，3μm）；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫流程見表1：流量：0.3mL/min；柱溫：35℃：進(jìn)樣體積：5μL。

2）質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI）；正離子掃描；選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）掃描模式；噴霧電壓3 500kV；毛細(xì)管溫度為350℃；氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，其中鞘氣壓力為35psi（1psi=6.895kPa），輔助氣壓力為10psi；氬氣為碰撞氣，碰撞壓力為1.5retort（1Ton=133.322Pa）；母離子為m/z=272.2，定量離子為m/z=107.3，對應(yīng)的碰撞能量為28eV。

在上述條件下，對照品以及樣品的總離子流圖分別見圖1和圖2，去甲烏藥堿保留時間約為5.56min，其質(zhì)譜圖見圖3。

1.6基質(zhì)考察

取甲醇10mL，超聲處理1 h，于5000r/min下離心15min，取上清液1mL于10mL容量瓶中，用50%甲醇定容，取適量用0.22μm的微孔濾膜過濾，用于LC-MS/MS進(jìn)樣，結(jié)果說明空白基質(zhì)對去甲烏藥堿的測定無干擾。

2方法學(xué)驗證

2.1線性與檢測限

將1.3項去甲烏藥堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至一定濃度，再分別取適量于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋成一定梯度的系列對照品溶液。按照1.5項儀器條件進(jìn)行測定，以去甲烏藥堿濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得出在3.05-122 ng/mL濃度范圍內(nèi)去甲烏藥堿的線性回歸方程為y=l 530.85x-153.164，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。取上述標(biāo)準(zhǔn)梯度中最大濃度溶液，逐級稀釋，進(jìn)樣測定，直到信噪比S/N≥3和S/N≥10時，對應(yīng)的檢測限和定量限分別0.6 ng/mL和3 ng/mL。

2.2精密度實驗

取一定濃度去甲烏藥堿對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以峰面積計算進(jìn)樣精密度（RSD）為2.56%；分別取細(xì)辛藥材粉末6份，照1.4項下條件提取制備供試品溶液，進(jìn)樣5μL于LC-MS-MS儀，記錄總離子流圖色譜圖以去甲烏藥堿的含量計算重復(fù)性精密度（RSD）為4.08%；同時另由兩個不同的人員分別連續(xù)6d處理并測定細(xì)辛中去甲烏藥堿的含量，計算中間精密度（RSD）為4.73%，滿足試驗需要。

2.3穩(wěn)定性試驗

稱取細(xì)辛藥材適量，按照1.4項下制備方法進(jìn)行處理，并于1.5項下的儀器條件分別在0，1，2，4，8，12，24h進(jìn)樣，記錄峰面積，由峰面積計算RSD。結(jié)果細(xì)辛中去甲烏藥堿峰面積變化的RSD值為4.78%，表明去甲烏藥堿溶液24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.4加樣回收率實驗

稱取細(xì)辛藥材約1 g（本底值8.66 μg/g），分別加入3個不同水平的去甲烏藥堿對照溶液，按照1.4項下制備方法進(jìn)行處理，并于1.5項下的儀器條件測得加樣回收率如表2所示。

2.5樣品測定

分別取黃柏、花椒、細(xì)辛等22種常用傷痛藥材細(xì)粉各1.0g，精密稱定，于錐形瓶中加入75%甲醇50mL，浸泡1h并超聲提取0.5h，離心15min（5000r/min），取上清液1 mL于10mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，搖勻，取溶液適量用0.22txm的微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液，結(jié)果如表3所示。

3分析與討論

3.1供試品溶液的制備

由表4可知，甲醇的體積分?jǐn)?shù)在75%時效率最高：由表5可知，提取劑的用量升高與提取率正相關(guān)，其中1：50后提取率上升不明顯，確定1：50（g/mL）的比例較為適宜：實驗還表明藥材粒度小有利于提高效率，確定40目較為適宜。由圖4可知，提取效率與超聲時間正相關(guān)：圖5和圖6表明，提取效率與預(yù)先浸泡時間正相關(guān)，比較不同時間浸泡時間后0.5 h和1 h的超聲提取可知，在相同浸泡時間的條件下，超聲時間越長，提取率越高。所以，綜合考慮充分浸泡和縮短超聲時間的條件下，確定浸取1h再超聲0.5h。另外，實驗發(fā)現(xiàn)直接甲醇稀釋的供試品溶液進(jìn)樣后，去甲烏藥堿的峰行展寬明顯，而選用50%甲醇溶液稀釋進(jìn)樣柱效明顯改善。

3.2 HG與運(yùn)動員

HG作為β₂激動劑類物質(zhì)，已被列入WADA的興奮劑清單中，其心臟方面正時性、加快心率等作用將直接影響高強(qiáng)度運(yùn)動員的身體健康，需要提前預(yù)防運(yùn)動員誤食誤用含HG的食材或藥材。本文針對中藥鐵打損傷藥和火鍋等食材和藥材，選用了處方中常用的細(xì)辛、木香、芍藥、川芎、地膚子、紅花、黃柏、花椒等22種材料，并在黃柏、花椒、細(xì)辛和地膚子中定量檢出HG，證明了中藥和食材中可能造成遠(yuǎn)動員的誤用。特別是火鍋中傳統(tǒng)放入大量花椒，是食材中最容易攝入過量HG的途徑。另一方面，結(jié)合HG的人體藥代動力學(xué)的特征，其半衰期短（t₀₅為0.133 h約7.98 min），消除快（CL為249 L/h）且主要通過尿排泄，所以，當(dāng)運(yùn)動員賽前誤食過多的含去甲烏藥堿食物，建議大量飲水加快排泄。

4結(jié)束語

綜上，本文所建常用藥材中去甲烏藥堿的檢測方法，具有快速、靈敏、精準(zhǔn)等特點(diǎn)，是常用藥材中HG檢測的較好方法。其中地膚子、花椒、黃柏等藥材屬本文首次定量報道。在所選的22種常用藥材和食材中有4種藥材檢出HG，將提示W(wǎng)ADA和運(yùn)動員以及心血管患者需特別慎用。