蠶豆保健品中左旋多巴的測(cè)定方法研究

趙愛(ài)平 馮德建 許洋 鄒燕 張琦 李懷平

摘要：建立蠶豆保健品中左旋多巴含量的高效液相色譜測(cè)定方法。樣品經(jīng)0.10mol/L鹽酸溶液超聲提取20min，XDB C18色譜柱分離，以甲醇-10mmool/L磷酸二氫鉀溶液（體積比2：98）等度洗脫，280nm下檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：左旋多巴質(zhì)量濃度在1.656～265.0mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法的平均加標(biāo)回收率為98.4%～100.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%～2.18%，檢出限為1.9mg/kg，定量限為6.3mg/kg。能夠滿足蠶豆保健品中左旋多巴含量的檢測(cè)和質(zhì)量控制需要。

關(guān)鍵詞：蠶豆保健品；左旋多巴；高效液相色譜儀；蠶豆粉；蠶豆茶

0引言 蠶豆（vicia faba L.），豆科植物中的一種，屬于蝶形花亞科，廣泛種植于我國(guó)四川、云南、湖南等地，產(chǎn)量位居世界第一。蠶豆含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，特別是其中的功效成分左旋多巴（L-Dopa），在臨床上已被證實(shí)是治療帕金森病的一線藥物，在蠶豆的花和葉片中含量較高，具有重要的藥用價(jià)值，以其為原料制成的保健品具有良好的市場(chǎng)前景。目前，對(duì)左旋多巴的測(cè)定主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，本文通過(guò)對(duì)樣品前處理和色譜條件的優(yōu)化，建立了蠶豆保健品中左旋多巴含量的高效液相色譜測(cè)定方法，能夠滿足蠶豆保健品中左旋多巴含量的檢測(cè)和質(zhì)量控制，期為延伸蠶豆產(chǎn)業(yè)鏈和促進(jìn)蠶豆深加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備 Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），Sartorius BP 211D型電子天平（德國(guó)Sartorius集團(tuán)），Agilent XDB C18色譜柱（150mmx4.6mm，5μm，美國(guó)Agilent公司），KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），Millipore Milli-Q型超純水器（美國(guó)Miflipore公司），XW-80A型漩渦混合器（上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2材料與試劑 材料與試劑：0.45μm微孔濾膜（水相）；甲醇（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），色譜純；磷酸二氫鉀（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），優(yōu)級(jí)純；鹽酸（成都市科龍化工試劑廠），分析純；左旋多巴（中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量≥98%）。 樣品：蠶豆保健品（蠶豆粉）。 左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取左旋多巴132.5mg，用0.10mol/L鹽酸溶液溶解并定容至250mL，配制成質(zhì)量濃度為530.0 mg/L的左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下保存。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.2g（精確到0.000 1g）蠶豆保健品樣品于25mL比色管中，加入20mL 0.10mol/L鹽酸溶液，于60Hz超聲清洗器中超聲提取20min，冷卻至室溫后用0.10 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻，過(guò)0.45μm水相濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.4液相色譜條件 色{普柱：Agilent XDB C18色譜柱（150mmx4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-10mmol/L磷酸二氫鉀溶液（體積比2：98）；流量：0.7mL/min；色譜柱溫度：25℃；進(jìn)樣量：10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 左旋多巴在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶，在稀酸中易溶。本方法考察了不同濃度（0.05，0.10，0.15 mol/L）鹽酸溶液作為提取溶劑的提取效率，結(jié)果表明左旋多巴在0.10mol/L鹽酸溶液中提取最為完全。同時(shí)，本方法還對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明超聲提取時(shí)間超過(guò)20min后，樣品中的左旋多巴含量不再增加，因此選定超聲提取時(shí)間為20min。

2.2樣品色譜條件優(yōu)化 本方法利用DAD檢測(cè)器對(duì)左旋多巴進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明其在280nm處有最大吸收，因此確定280nm作為本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。由于左旋多巴在C18色譜柱上保留較弱，本方法考察了不同體積比的甲醇與10mmol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相時(shí)樣品的分離情況，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，有機(jī)相甲醇的比例越高左旋多巴的出峰時(shí)間就越短，且與樣品中其他基質(zhì)成分的分離效果也越差，當(dāng)降低甲醇的比例至2時(shí)，左旋多巴的出峰時(shí)間為5.2min左右，且色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱性好，能夠與樣品中其他基質(zhì)成分實(shí)現(xiàn)很好地基線分離。因此，本方法確定甲醇與10 mmol/L磷酸二氫鉀溶液的體積比為2：98。同時(shí)，本方法還分別考察了不同色譜柱溫度和流量對(duì)樣品分離的影響，如表1所示?？梢钥闯觯V柱溫度的升高和流量的增大均會(huì)導(dǎo)致左旋多巴出峰時(shí)間前移，且與樣品中其他基質(zhì)成分的分離度下降，但均對(duì)色譜峰峰形影響不大。因此，本方法確定色譜柱溫度為25℃，流量為0.7mL/min。圖1是優(yōu)化后空白溶液（0.10 mol/L鹽酸溶液）、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液和樣品加標(biāo)溶液的色譜圖。

2.3線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限 用0.10 mol/L的鹽酸溶液逐級(jí)稀釋左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度分別為1.656，16.563，33.125，66.250，132.500，265.000 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積y與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度x（mg/～L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。結(jié)果表明，左旋多巴質(zhì)量濃度在1.656～265.0 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=23.098 1x+10.7594，相關(guān)系數(shù)r為0.9999。以3倍信噪比（3S/N）確定本方法中左旋多巴的檢出限為1.9mg/kg，以10倍信噪比（10 S/N）確定本方法中左旋多巴的定量限為6.3 mg/kg，能夠滿足蠶豆保健品中左旋多巴含量檢測(cè)和質(zhì)量控制需要。

2.4方法的準(zhǔn)確度與精密度 準(zhǔn)確稱取蠶豆保健品樣品24份，等分成4組，其中3組分別添加1.2，2.5，5.0mL的左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加標(biāo)量分別為636.0，1 325.0，2650.0μg，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算方法的回收率和精密度。結(jié)果表明，3種不同添加濃度下測(cè)得蠶豆保健品中左旋多巴的平均回收率在98.4%-100.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%-2.18%，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度。

2.5實(shí)際樣品的測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱取購(gòu)于市場(chǎng)的2種蠶豆保健品（蠶豆粉、蠶豆茶）樣品各12份，等分成2組，其中1組用于測(cè)定樣品中左旋多巴的含量，另外1組用于樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，分別按照本方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，蠶豆粉的檢測(cè)結(jié)果為7.52mg/g，樣品加標(biāo)回收率為97.7%～100.0%：蠶豆茶的檢測(cè)結(jié)果為39.51 mg/g，樣品加標(biāo)回收率為98.1%～101.1%，表明本方法適合蠶豆保健品中左旋多巴含量的測(cè)定。

3結(jié)束語(yǔ) 本文率先優(yōu)化了蠶豆保健品的前處理?xiàng)l件和色譜條件，建立了蠶豆保健品中左旋多巴含量的高效液相色譜測(cè)定方法，可為相關(guān)領(lǐng)域提供參考。方法的平均加標(biāo)回收率為98.4%～100.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%～2.18%，檢出限為1.9mg/kg，定量限為6.3mg/kg，能夠很好地滿足蠶豆保健品中左旋多巴含量的檢測(cè)和質(zhì)量控制。